Molekulární mechanismy formování epigenomu

Transkript

1 lncrna a epigenom

2 Molekulární mechanismy formování epigenomu Epigenetika = věda o stabilních genetických modifikacích, které vedou ke změně exprese a funkce genů beze změny sekvence DNA Epigenetické procesy klíčové pro: - diferenciaci a vývoj - funkci mozku -dlouhodobé odpovědi na proměnlivost prostředí Základní nástroje epigenetických procesů: Metylace DNA Modifikace histonů RNAi + nekódující RNA

3 Metylace DNA Metylace DNA = přidání metylové skupiny na cytosin 5-metylcytosin - u prokaryot i eukaryot (rostliny, houby, živočichové) -u savců metylace hlavně na CpG -u savců 3 metyltransferázy: DNMT1 udržuje metylaci DNMT3Aa DNMT3B metylace de novo - 2 vlny demetylací u savců: v zárodečných buňkách a před implantací embrya Význam: - ochrana před TEs - embryonální vývoj - diferenciace kmenových buněk - genomový imprinting -inaktivace X

4 Modifikace histonů = Kovalentní připojení skupiny, většinou na N-konec (tail) -Známo 8 typů, nejstudovanější acetylace, metylace, fosforylace, ubiquitinace ->60 aa pozic pro modifikace

5 Epigenetické změny a RNA Modifikace histonů, metylace DNA a modulace chromatinu prováděny komplexy jejich směřování často řízeno RNA - 20% lncrna asociována s chromatin modulujícími komplexy -RNA asociována s chromatinem funkce a směřování komplexů modulujících chromatin jsou řízeny RNA

6 Dlouhá nekódující RNA (lncrna) ->200 bp (až stovky kbp) -cca 80% RNA v buňce - v savčích genomech desítky tisíc typů lncrna - polyadenylovány, sestřihovány, regulovány TFs - většinou neznáme funkci, ale jsou indicie, že nějakou mají: - 1) exprese a alternativní splicing během diferenciace -2) tkáňově a buněčně specifický pattern exprese - 3) regulace exprese morfogeny, TFs a hormony - 4) asociace s chromatinem v oblasti aktivních genů - 5) změna exprese v rakovinných buňkách

7 Funkce lncrna Přibývají informace o funkcích konkrétních lncrna - reprogramování kmenových buněk - regulace homeotických genů - metastáze rakoviny - genomový imprinting - inaktivace chromosomu X Obecně regulace epigenetických procesů (diferenciace, reakce genomu na vnější prostředí, funkce mozku). Morris and Volt 2010

8 Dobře charakterizované lncrnas u živočichů

9 Xist a inaktivace savčího X Kompenzace genové dávky = potřeba vyrovnat genovou dávku mezi samicí (XX) a samcem (XY) Různé skupiny živočichů dělají různě.

10 Kompenzace genové dávky u savců - u vačnatců inaktivace paternálního X (asi primitivní stav) -paternální X označeno v samčí meióze -nevýhoda: škodlivé recesivní mutace na X odhaleny u samce i samice -u placentálůnáhodná inaktivace v různých buňkách různá Xa -výhoda samice chráněny před škodlivými recesivními mutacemi na X -potřeba mechanismu, který spočítá poměr X:A a vybere Xi -u myši kombinace: embryo náhodná inaktivace placenta - paternální Xi Inaktivace X v období implantace embrya (Hore et al. 2007)

11 Výběr Xi Komunikace mezi Xic obou X synapse v období inaktivace X Regulační složky Xic - Xist (X inactive specific transcript) delece Xist inaktivuje druhé X chybí u ptakořitných - Tsix exprese na obou X, ale na Xa déle delece = inaktivace nositele

12 Exprese Xist -Dlouhá nekódující RNA šíření po celém X (cis) -Exprese Xist jen na počátku inaktivace, udržení inaktivace jinými faktory - Translokace Xist na autosom = inaktivace autosomu x méně efektivní -Na X mimořádně vysoká koncentrace LINEs, zřejmě místa interakce s Xist RNA Xist inaktivuje X u placentálů i vačnatců

13 Inaktivace Xi Rozprostření Xist -vyloučenírnapol II z blízkosti Xi - ztráta epigenetických značek -povolání komplexů PRC2 a PRC1 (polycomb repressive complex)represivní modifikace histonů. Chromosomy myši s chromosomem X pokrytým Xist RNA

14 lncrnas a genomový imprinting Air, Kcnq1ot1 - Relativně dobře prostudované - Součásti klastrů imprintovaných genů -Aktivní u paternální alely -podílejí se na umlčení genů v cis - Mechanismus umlčování není znám (RNAi, chromosome coating,...) V klastrech IGs další ncrnas i jiné typy nekódujících RNA (snorna)

15 Genomový imprinting -Většina genů exprimována bez ohledu na původ (M/P) X některé podle původu (maternální vs. paternální) = genomový imprinting - Objev v 80. letech 20. století u myší 2 typy pokusů: 1) Výměna prvojader vznik zygoty s pouze paternálním / maternálním genomem Vzniklé potomstvo nebylo životaschopné M i P genom je potřeba 2) Výměna jednotlivých chromosomů(křížení linií s translokacemi) uniparentální disomie -90. léta 20. století objev prvních imprintovaných genů (Igf2 a Igf2r) růst embrya

16 První objevené imprintované geny Igf2 růstový faktor -PEG u vačnatců a placentálů -aktivní v celém embryu a placentě - delece paternální kopie embryo 40% normální velikosti -2 paternální kopie u člověka Beckwith-Wiedermannův syndrom = přerostlý plod a vysoký výskyt nádorů

17 První objevené imprintované geny Igf2r receptor Igf2 -MEG u vačnatců a placentálů (kromě primátů -opačná funkce než Igf2 -u obratlovců vazebné místo pro proteiny označené manoso-6-fosfátem+ fosfatázy degradace proteinů v lysozomech -u živorodých savců navíc vazba Igf2 degradace - delece maternální kopie embryo % normální velikosti

18 Imprinting Igf2 a Igf2r u savců Vejcorodí Igf2 Igf2r Vačnatci Igf2 Igf2r není imprintovaný nemá vazebné místo pro Igf2 PEG MEG, má místo pro Igf2 Placentálové Igf2 Igf2r PEG MEG, má místo pro Igf2(u sudokopytníků, hlodavců, ale ne u primátů) Imprinting Igf2 a Igf2r zřejmě souvisí s těsným spojením matky a embrya během embryonálního vývoje prostor pro manipulaci.

19 Genomový imprinting se děje v zárodečných buňkách Kota and Feil 2010

20 Kinship theory IGs jsou nástrojem v boji matky a otce o zdroje, které matka poskytne potomkovi -Otec chce pro svého potomka maximum zdrojů na úkor matky (další potomci nemusí být jeho) X -Matka chce racionalizovat distribuci zdrojů mezi všechny své děti -Imprintované geny jsou exprimovány hlavně v embryu/extraembryonálních tkáních a mozku (manipulace chování)

21 Kinship theory Hore et al. 2007

22 Další taxony s predikovaným imprintingem Živorodí obratlovci hadi, ještěři, žáby, ryby prostor pro aktivní extrakci živin z matky Haplodiploidní sociální hmyz různé příbuzenské vztahy mezi pohlavími -otec příbuzný s dcerami 100% -chce jen dcery, matka 50% -chce 1:1 Vysoká otcovská investice u mořských koníků predikované opačnérolemegs a PEGs

23 Lidské choroby způsobené chybou imprintingu Příčiny: 1) Chromosomální aberace 2) Uniparentální disomie Manipalviratn et al. 2009

24 Projev: - malý vzrůst - snížená inteligence (IQ ~ 70) - problémy s učením Syndrom Prader-Willi -chronický pocit hladu chorobné přejídání obezita - Příčina: -delece části paternálního chromosomu 15 ztráta genu, který je maternálně imprintován jedinci s PWS nemajíaktivníalelu. Sesterský syndrom - Angelmanův La monstrua desnuda (1680) odde Juan Carreño de Miranda - pravděpodobně dívka s PWS Zdroj: Wikipedia

25 Angelmanův syndrom Projev: - problémy s koordinací pohybu, nemotorná chůze - neschopnost mluvit (max. několik slov) - opožděný psychosomatický vývoj - zvláštní chování, stále se usmívá - Příčina: Delece části maternálního chromosomu 15 Důvodem je zřejmě chybějící maternální aktivní alela genu UBE3A (ubiquitin ligáza) Chlapec s loutkou Giovani Francesco Caroto

26 Imprintované geny -U myši známo 145 imprintovaných genů (IG) x predikováno cca Cca 1/2 z nich imprintována i u člověka - Některé IGs konzervované (i u vačnatců) -80% v IGs v klastrech -V klastru bialelické, maternálně (MEGs) i paternálně (PEGs) inprintované geny -Celkový poměr MEGs a PEGs v genomu vyrovnaný -IGs nejsou sekvenčně homologické - Promotory bohaté na CpG Reik a Walter 2001

27 Vznik a regulace PWS-AS lokusu Oblast 15q delece způsobuje Prader-Willi / Angelmanův syndrom -dvě oblasti: PWS 5 PEGs + snorna AS 2 MEGs (exprese v mozku) IC řídí expresi genů v obou oblastech

28 Vznik a regulace PWS-AS lokusu U vačnatců a vejcorodých - většina genů chybí - chybí snorna - nalezené geny na různých místech genomu - chybí ICR bialelická exprese PWS-AS lokus vznikl po odštěpení vačnatců před radiací placentálů

29 Čtení epigenetických značek -Komplexní IGs jsou v klastrech mohou sdílet regulační sekvence - Metylace regulační sekvence nutně umlčení genu - Regulace většinou na úrovni transkripce -Regulace běžnými nástroji (metylace promotorů, silencery, antisense RNA, hraniční sekvence)

30 Čtení epigenetických značek Metylace promotoru -promotory IGs bohaté na CpG -vazba komplexu MBDs + Dnmt1 + deamináz histonů modulace chromatinu Antisence RNA -část IGs asociována s antisense RNA (př. Air, Kcnq1ot1) -antisense transkriptůsama imprintována

31 Čtení epigenetických značek Hraniční oblasti -oblast mezi enhancerem a promotorem IG - hraniční oblast nemetylována vazba represoru inhibice IG čili metylace = aktivita IG Umlčovací faktor (silencer) -některé DMRs metylované na aktivní alele obsahují silencer

32 Myší chiméry - Studium vlivu imprintovaných genů na myších chimérách -Chiméra = směs wt buněk s androgenickými (2 P genomy)/ partenogenetickými (2 M genomy) Výsledek: 1) Množství P a M buněk koreluje s velikostí embrya(p zvětšuje, M zmenšuje) a mozku (P zmenšuje, M zvětšuje) 2) Frekvence P a M buněk je v různých tkáních různá: Vyšší koncentrace P buněk: extraembryonální tkáň, hypothalamus, chondrocyty, tuk a zubní sklovina Vyšší koncentrace M buněk : embryo, mozková kůra, dentin, nosní sliznice V souladu s kinship theory

33 IGs a regulace chování U savců pokračuje rodičovská investice i po narození prostor pro manipulaci chování -IGs hojně exprimované v mozku (i u dospělců) ovlivňují chování - Knock-outy IGs změny v chování podporující kinship hypotézu -Peg3a Gnaxl podorují sání mléka -Mest, Peg3 amagel2 kritické pro normální mateřské chování -PEGs podporují vydávání UZ volání matky X MEGs ho potlačují

34 IGs a regulace chování u myši Grb10 a sociální chování -MEG v embryu inaktivace alely nadměrný růst embrya, poruchy v regulaci insulinu a glukózy -PEG v dospělém mozku inaktivace alely zvýšená dominancea sociální nekompetence Curley 2011 Paternální Grb10 potlačuje agresivitu

35 Mateřská péče a imprinting Špatné zkušenosti během raného vývoje mají dlouhodobý efekt (nemoci a poruchy chování v dospělosti). U lidí týrání/přehlížení v dětství zvýšená pravděpodobnost fyzických a psychiatrických onemocnění, užívání drog. U myší, potkanů a makaků oddělení mláďat od matky silnější reakce na stres, poruchy sociálního a reprodukčního chování (infanticida, týrání)

36 Mateřská péče a imprinting Peg3 -reguluje přežívání buněk vplacentě, embryu a mozku -knock-out vede k poruchám mateřské péče -dodávání živin embryu, kojení, olizování a opečovávání, či stavba hnízda. -výměna potomstva mezi wt a Peg3- liniemi chování převzato od náhradní matky, přeneslo se na vnoučata 1) Peg3 manipuluje matku směrem k péči o potomstvo 2) Zkušenosti z raného vývoje se přenášejí až do následující generace

37 Jak to funguje na molekulární úrovni GR (hippocampal glucocorticoid receptor) - Řídí odpověď na stres regulací osy hypothalamus šišinka nadledvinky ( kortizol, adrenalin, ) -Vysoká hladina GRslabá odpověď na stres - Samičky lépe pečující o mladé méně metylovaný promotor GR může nasednout TF (NGFI-A-indukovaný nervovým růstovým faktorem) vyšší exprese GR -Metylační pattern se ustaví v prvním týdnu života zůstává po celý život.

38 Sociální mozek Lidský mozek selektovaný na řešení sociálních interakcích - IGs nadprůměrně exprimované v mozku ovlivňují chování - analogie placenty = řídí distribuci zdrojů mezi příbuzné -nerovnováha imprintingu psychická porucha - dva extrémy: autismus (porucha PEGs) a psychóza (porucha MEGs) Crespi and Badcock 2008

39 Vliv prostředí na epigenom Embryonální vývoj vs. dospělost jiné vlivy a intenzita dopadu Aguilera et al. 2010

40 Vliv výživy na epigenom Myší linie s mutací A vy (agouti viable yellow) model pro vliv epigenomu na fenotyp -vložení TE do genu agouti nesprávnáexpresežlutá myš -krmení matek stravou s donory metylových skupin (methionin, cholin) a kofaktory (kyselina listová, B12) represe promotoru TE hnědé potomstvo Feil a Fraga 2012 Žluté myši - sklon k obezitě a rakovině

41 Vliv výživy na epigenom Přísun živin během embryonálního vývoje a na počátku života může ovlivnit zdraví v dospělosti (krevní tlak, kardiovaskulární choroby, cukrovka, rakovina). Příjem potravy v rané fázi života ovlivňuje metylaci DNA -obzvláště citlivé jsou TEs a IGs -málo metylace mobilita TEs + aktivita jejich promotorů změna exprese downstream genů - málo metylace bialelická exprese IGs - příliš mnoho metylace umlčení aktivních alel IGs

42 Vliv výživy na epigenom Hladomor v Holandsku srovnání lidí počatých v tomto období s nepostiženými sourozenci rozdíly v metylacích Igf2 po 60 letech vnější vlivy na počátku těhotenství přetrvávají po celý život

43 Prostředí a epigenom Strava - Dostatek složek metabolismu S-adenosylmethioninu(kyselina listová, vitamíny B6, B12, methionin, ) - Butyrát(sýry), sulforaphan (brokolice) inhibice HDAC acetylace promotorů tumorsupresorů Léky Diethylstilbestrol -zvýšené riziko rakoviny prsu, vaginy a děložního krčku a vývojovými anomáliemi změny exprese metyltransferáz a metylace DNA Valproát sodný inhibice HDAC

44 Prostředí a epigenom Životní/pracovní prostor - Ionty kovů(kadmium, nikl a chrom) - redukce metylace a inhibice metyltransferáz, nikl mění modifikace histonů - Bisfenol A-využíván vplastovém průmyslu + vinclozolin-fungicid používaný na vinicích -mění metylaci DNA na některých promotorech, účastní se vývojových poruch a rakoviny. Nezdravé návyky - Kouření - hypermetylace promotorů tumor-supresorů v plicích - Alkohol- u alkoholiků nalezeny změny v metylacích CpG - u potkanů alkoholiků - rozsáhlé epigenetické změny - Kokain konzumacematkouzměnametylací a genové exprese vhippokampu novorozenců a prepubertálních potomků.

45 O čem to bylo -Epigenetické měny umožňují genomu pružně reagovat na vnější podmínky -Hlavními nástroji modulace epigenomu jsou modifikace histonů a metylace DNA - Směřování modulujících komplexů je často řízeno RNA -Genomový imprinting savců ovlivňuje růst embrya a mozek, zřejmě reakce na vznik placenty, boj otce a matky o matčiny zdroje -Epigenetické změny mohou být ovlivněny prostředím a mají dlouhodobý efekt -Správná výživa v těhotenství a mateřská péče vytvářejí odolnost vůči stresu a chorobám - Strava, životní prostředí, léky a návykové látky ovlivňují epigenom

46 Konec