Diagnostika a léčba DMP. Viktor Kožich

Transkript

1 Diagnostika a léčba DMP Viktor Kožich

2 n=800

3 Patofyziologie metabolitů u DMP substrát <1500 Da vedl.produkt >1500 Da produkt 1 2 3

4 Kategorie DMP-příklady Malá molekula Komplexní molekula Hromadění substrátu Chybění produktu Aminoacidopatie Hyperamonemie Org.acidurie Glykogenosy Poruchy BOX MK Poruchy synthesy kreatinu Lysosomální nemoci CDG syndromy Generalisované peroxisomální nemoci

5 Osnova Diagnostika obecně Novorozenecký screening Selektivní screening Léčba

6 Proč je třeba znát diagnosu? Vysvětlení klinických příznaků Omezení úzkosti a nejistoty Prevence zbytečných dalších vyšetření Prevence dalších komplikací Zahájení léčby Stanovení rizika pro příbuzné probanda

7 Diagnostika verifikace hypothes pacient

8 Diagnostika DMP je genetické testování

9 Úrovně diagnostiky

10 Osnova Diagnostika obecně Novorozenecký screening Selektivní screening Léčba

11 Genetiké testování Selektivní screening Celopopulační screening

12 Screening To screen= prosévat Screening= identifikace osob se zvýšeným rizikem nemoci Diagnosa se ověřuje jinými nezávislými metodami

13 zdraví falešné nálezy pacienti

14 Úspěšná diagnostika DMP + Vědoucí lékař(ka) Dostupný laboratorní test 3.bp.blogspot.com/.../s320/physicianatdesk.jpg

15 Genetické testování Selektivní screening Celopopulační screening

16 Novorozenecký screening

17 Novorozenecký screening Aktivní vyhledávání nemocí v celé populaci, presymptomatická diagnostika Sensu stricto- laboratorní analysa suchých krevních skvrn Zakladatel-Prof. Robert Guthrie

18 JMG Wilson and G Jungner: Principles and Practice of Screening for Disease, WHO 1968

19 Klasická kritéria pro screening Nemoc je důležitá a častá Latentní fáze, kdy je nemoc bezpříznaková Průběh nemoci a mechanismy jsou známé Spolehlivý test Test je populací akceptovatelný Hledání pacientů musí být kontinuální proces Přijatelná léčba Podmínky pro diagnostiku a léčbu Konsensus o tom, kdo má být léčen Náklady dg a léčby musí být ekonomicky vyvážené v systému zdravotní péče

20 ISNS data 2007

21 Jak se rozhodnout, které nemoci se mají screenovat?

22 Prospěch versus riziko USA: prospěch postiženého dítěte a znalost diagnosy Evropa: poškození rodin u falešně pozitivních nálezů nebo nemocí s nejasnou prognosou/léčbou

23 Frekvence Časné klinické projevy Závažnost nemoci Max. 700 bodů Nemoc Test Léčba Prospěch léčby-pacient Prospěch léčby-rodina Prevence úmrtí

24 Max bodů

25 81 nemocí 1 29 nemocí 2 25 nemocí

26 Jaké choroby screenovat? USA - ACMG: Skupina onemocnění Organické acidurie/acidémie Poruchy oxidace mastných kyselin Poruchy metabolismu aminokyselin Panel primárního významu (n=30) IVA; GA I; HMG; MCD; MUT; Cb1 A,B; 3MCC; PROP; BKT MCADD; VLCADD; LCHADD; TFP; CUD PKU; MSUD; HCY; TYR I; ASA; CIT Panel sekundárního významu (n=25) Cb1 C,D; 2M3HBA; IBG; 2MBG; 3MGA; MAL M/SCHADD; SCADD; MCKAT; GA II; CPTD I; CPTD II; CACTD; DE REDUCT HPA; TYR II; BIOPT (BS); TYR III; ARG; BIOPT (REG); MET; CIT II Hemoglobinopatie SCA; Hb S/Th; Hb S/C Variantní Hb včetně HbE Jiná onemocnění CH; BD; CAH; GAL; Deafness; CF, SCID GALE; GALK.. další: syndrom fragilního X, LSD, vrozené infekce (toxoplasmóza, CMV, HIV, hepatitidy), LQT, riziko pro DM I

27 DC NS USA-2009

28 Jaké choroby screenovat? Evropa - ISNS: Základní skupina (metodika screeningu není složitá a zdravotní efekt je prokázán) 7 onemocnění s relativně vysokou prevalencí 3 onemocnění s nižší prevalencí Kandidátní skupina (19 onemocnění, u kterých NS zatím představuje více výzev a nejasností ve vztahu ke kriteriím dle Wilsona a Jungnera) PKU/HPA, CH, CAH, CF, MCADD, Hb S/Th, Hb S/C MSUD, GA I, GAL BD, CPTD II, CACTD, GA II, HMGD, HCSD, HCY, IVA, BKT, LCHADD, LSD, 3MCC, TYR I TYR II a III, VLCADD, deficit vitaminu B12, SCID, CMV

29 Zdroj: Therell BL et all: Current status of newborns screening worldwide: Seminars in Perinatology 2015;39:

30

31 ~1: ~1: ~1:6 000 Celý program:~1:1 200

32 Jak správně odebírat správné sušení 3 hod, ne přímé teplo, pokoj.t, bez kontaktu denní odesílání vzorků!!!!!!!

33 Proč je důležitý správný odběr?

34 Tandemový hmotnostní spektrometr (MS/MS)

35

36 DMP Diagnostická efektivita DMP 576,000 novorozenců (IX/2009-XII/2014) Počet pacientů Incidence PKU/HPA 110 1:5 200 Deficit MCAD 29 1: Deficit LCHAD/MTP 10 1: Deficit VLCAD 4 1: Hydroxyprolinemie 3 1: Leucinosa 3 1: IVA 3 1: GA I 3 1: Celkem 165 1:3 500

37 Informace pro rodiče

38 Osnova Diagnostika obecně Novorozenecký screening Selektivní screening Léčba

39 Genetické testování Selektivní screening Celopopulační screening

40 Selektivní screening Klinický výběr pacientů je klíčovou komponentou selektivního screeningu

41 Klinický obraz DMP-věk

42 Klinický obraz DMP-orgány

43 Klinický obraz-multisystémovost

44 Signály možnosti DMP Rodinná anamnesa: konsanguinita, podobný průběh nemoci u příbuzných, neobjasněné úmrtí příbuzných Onemocnění považované původně za běžné neodpovídá na standardní léčbu Multisystémové onemocnění Průběh nemoci ovlivněný zevními faktory/potravou katabolismus hladovění příjem proteinů nebo cukrů (galaktosa, fruktosa) Nevysvětlitelné laboratorní odchylky při běžných vyšetřeních Podklad y- Dr.D.Behulová

45 DMP-skupiny dle patofyziologie DMP intoxikačního typu (nízkomolekulární látky) Poruchy energetického metabolismu DMP s komplexními molekulami (vysokomolekulární látky) akutní i chronický průběh symptomy trvalé, progresivní

46 Potrava a DMP malých molekul (Sub)akutní toxicita mléko (laktosa)-hepatopathie sacharosa/fruktosa/sorbitol- hepatopathie a hypoglykemie bílkovinná strava- zvracení, letargie, koma (poruchy cyklu močoviny, organické acidurie) MCT oleje- porucha srdečního rytmu (poruchy betaoxidace MK) Hladovění a DMP ketotická hypoglykemie u glykogenos hypoglykemie se sníženou tvorbou ketolátek (poruchy beta-oxidace MK) metabolické koma (MAc nebo hypermamonemie) při katabolismu/hladovění

47 Indicie DMP při běžných laboratorních vyšetřeních moči a likvoru Vyšetření moči Abnormální zápach Abnormální zbarvení Krystalurie ph moči Ketolátky Kyselina močová Myoglobin Vyšetření likvoru Glukosa Celková bílkovina Laktát

48 Selektivní screening Jeden metabolit Profil metabolitů= metabolomika

49 Komplexní směsi-obtížná detekce

50

51 HPTLC- oligosacharidy v moči Foto Dr.Ledvinová

52 AMA- citrulinemie pacient kontrola

53 12,29 14,96 4,24 14,80 17,80 3,57 13,47 5,93 12,08 5,07 6,63 18,40 Voltage [m V] 10,64 14,70 6,64 12,28 13,80 5,86 14,81 3,26 6,61 7,21 7,77 10,36 11,51 18,39 13,72 10,63 12,08 14,00 14,70 Voltage [m V] 5,54 GC: methylmalonová aciduria ,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 T ime [min.] ,72 13,81 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 T ime [min.]

54 14,88 3,29 12,29 14,96 4,24 14,80 17,80 3,57 13,47 5,93 12,08 5,07 6,63 18,40 Voltage [m V] 10,64 14,70 5,12 5,94 18,47 18,69 Voltage [m V] 6,67 10,68 14,74 GC: deficit MCAD ,28 12,33 13,76 13, ,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 T ime [min.] ,72 13,81 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 T ime [min.]

55 Hmotnostní spektrometrie 1. rozměr MS LC GC

56 Fragmentace

57 Sensitivita Alkaptonurie: 1-5 g homogentisátu /d Cystinurie: 1-5 g cystinu /d Moč-litry PKU: 0.1 g Phe /l krve ml séra MCAD: C8 acylcarnitin g / l krve NS terč ml krve

58 In vivo měření metabolitů Před léčbou Deficit kreatinu v mozku (MRS) Po léčbě

59 Vyšetřování metabolitů u DMP Specializované testy Obvykle nedostupné v rutinních laboratořích Většinou profilové analysy Většinou chromatografické techniky, potřebné je nákladné vybavení Metody pracné, řada in-house testů Komplexita interpretace (např. organické kyseliny), nutná specializace

60 Selektivní screening Enzymová aktivita Účinnost transporteru Množství enzymu? Lze použít ELISU?

61 Principy enzymologického vyšetření separace substrátu a produktu kvantifikace přírůstku či úbytku substrát* produkt* kofaktor změněný kofaktor kvantifikace přírůstku či úbytku

62 Stanovení enzymů u DMP Obvykle nutné buňky Leukocyty, fibroblasty Tkáně plodu a obalů plodu Techniky fluorimetrické a radiometrické (event. fotometrické), velký rozmach MS/MS Měřený parametr: úbytek substrátu nebo tvorba produktu změny kofaktoru

63 Typické výsledky enzymologie Postižení homozygoti jasně deficitní Heterozygoti: překryv Zdraví homozygoti: obvykle negausovské rozdělení aktivity v populaci

64 Selektivní screening Analysa DNA/RNA

65

66 Next generation sequencing Sekvenování exomu je dostupné (1% z 3GB) Ceny klesají (cíl 1000 USD za genom) Analysa dat je největší úskalí

67 Next generation sequencing?? Nejistota o fenotypových dopadech pozorovaných alelických variant

68 Typický výsledek NGS-exom Komplexní filtrační algoritmy dbsnp, EVS, 1000genomes a populačně specifické db Porovnání oproti databázím cca 20k coding variants 9.5k nonsynonymous variants 10k synonymous variants 500 small InDels 150 loss of function variants 100 variants associated with genetic diseases private variants 0-2 de novo germline mutation Převzato od Dr.V.Stráneckého

69 Úspěšná diagnostika DMP + vědoucí lékař/ka dostupný laboratorní test 3.bp.blogspot.com/.../s320/physicianatdesk.jpg

70 Osnova Diagnostika obecně Novorozenecký screening Selektivní screening Léčba

71 Léčba DMP substrát produkt

72 Léčba primárního defektu substrát 2? 1 enzym transportér produkt?

73 Léčba primárního defektu substrát 2 Transplantace buněk a orgánů 1 enzym transportér Genové manipulace produkt Enzymové manipulace

74 Genové manipulace Náhrada genu ADA deaminasa- léčba v 90.letech Inserční mutagenesa se vznikem leukemie u části pacientů Hledají se bezpečné virové vektory Ovlivnění exprese genů Malé molekuly (PBA, VPA ) Glukosa u pofyrií (exprese HO 1) Oprava mutace Pročtení se předčasným stopkodonem Antisense oligo pro poruchy sestřihu

75 Léčba zaměřená na enzym Substituce normálním enzymem Parenterální podávání Transport do cílového Imunitní odpověd-protilátky Cena a výroba Stabilizace mutantního enzymu Přirozené ligandy- kofaktory Umělé ligandy-malé molekuly (farmakologické chaperony) Slibný přístup k léčbě Erlandsen H and Stevens RC, The Structural Basis of Phenylketonuria. Mol Genet Metab Oct; 68(2):

76 Enzyme supplementation therapy Enzymová substituční terapie Užití u nemocí (LSD)-rutinní i v testování ( glukocerebrosidasa ) M.Gaucher ( A M.Fabry (alfa galaktosidasa ( glukosidasa M.Pompe (kyselá alfa ( iduronidasa MPS I (alfa ( iduronátsulfatasa MPS II (alfa ( B MPS VI (arylsulfatasa ( sfingomyelinasa M.Niemann-Pick B (kyselá MPS IVA Wollmanova nemoc (kyselá lipasa) Výroba rekombinantních enzymů Genzyme, TKT, Biomarin, Shire, Inotech.

77

78 ERT u Gaucherovy nemoci Hromadění glukosylceramidu převážně v buňkách odvozených od makrofágů (Gaucherovy buňky) Léčba: endocytosa zprostředkovaná receptorem manosový receptor (makrofágy, endothelie, játra) není transport do mozku glukocerebrosidasa ošetřená exoglykosidasami (odstranění M-6-P) Enzym isolovaný z lidské placenty X recombinantní enzym (CHO cells) X recombinantní enzym v mrkvi

79 Přirozené kofaktory Většina vitaminů= prekursory kofaktorů Příklady použití BH4 u PKU Pyridoxin u deficitu CBA a OAT Riboflavin u deficitu ETF-DH Vit.B12 u cbla a cblb Ubichinon u defektů respiračního řetězce Mo-kofaktor in kombinovaného deficitu XO/SO

80 Farmakologické chaperony Gregersen N J Inherit Metab Dis (2006) 29:

81 Farmakologické chaperony Slibná oblast výzkumu Často kompetitivní inhibitory enzymů Efektivita t.č. většinou nízká M.Fabry, Gaucher - klinické zkoušky

82 High-throughput screening (HTS) malých molekul Knihovny stovky tisíc látek Knihovny schválených a běžně užívaných léků např. NINDS Assay Interakce s proteinem: fluorescence, absorbance, křivky tavení Funkční důsledky: enzymová aktivita, biologická assay Automatizace, miniaturizace

83 Léčba primárního defektu substrát 2 Transplantace buněk a orgánů 1 enzym transportér Genové manipulace produkt Enzymové manipulace

84 Transplantace

85 Přenos hematopoetických kmenových bb Zdroj: kostní dřeň, pupečník Výhoda: přechod hematoencefalickou bariérou Nevýhoda: vysoká mortalita Lysosomální nemoci Mucopolysacharidosa I- dobrá responsivita MPS III není zpomalení progese u neurologických obtíží Krabbeho nemoc-slibné výsledky u časně diagnostikovaných pacientů (novoroz.screening New York) Peroxisomální nemoci X-ALD _01_01.jpg

86 Přežívání u cerebrální formy X-ALD po přenosu hematopoetických kmenových bb Expert Review of Neurotherapeutics 2008, Vol. 8, No. 9, Pages

87 Transplantace orgánů Transplantace jater/hepetocytů GSD Poruchy cyklu močoviny Organické acidurie Transplantace ledvin Cystinosa Hyperoxalurie I M.Fabry Kombinovaná transplantace jater a ledvin Organické acidurie (zvl.mma) Hyperoxalurie I Transplantace srdce M.Fabry

88 Léčba ovlivněním metabol.dráhy potrava 1 2 toxický prekursor substrát 3 toxický vedl. produkt netoxický produkt produkt 4

89 PAH PKU

90 Děti cca 400 mg Phe/d Dospělí mg Phe/d

91 Léčba ovlivněním metabol.dráhy potrava 1 2 toxický prekursor substrát 3 toxický vedl. produkt netoxický produkt produkt 4

92 Substrát-redukující léčba Farmakologická modulace reakcí nad enzymovým blokem Příklady Nitison u tyrosinemie I a alkaptonurie Miglustat u LSD Metronidazol u propionové acidemie LNAA u PKU-kompetice o transportér

93 Léčba alkaptonurie a tyrosinemie I nitison (NTBC)

94 Substrát-redukující léčba u M.Gaucher Miglustat (OGT 918, SC-48334, N- butyldeoxynojirimycin) Orálně aktivní aminocukr Inhibuje syntasu glukosylceramidu a synthesu glykosfingolipidů Střední koncentrace GM1 gangliosidu klesla o 38.5% po12 měsících léčby (p < 0.05) J. Clin. Invest. 103(4): (1999) THE LANCET Vol 355 April 29, 2000.

95 Léčba ovlivněním metabol.dráhy potrava 1 2 toxický prekursor substrát 3 toxický vedl. produkt netoxický produkt produkt 4

96 Snížení toxicity hromaděných substrátů Méně toxické konjugáty Isovalerová acidemia-glycin Rozpustnější komplexy Cysteamin Fyzikálně chemické vlivy (moč) Alkalinizace Zvýšený přívod tekutin

97 Glycin u isovalerové acidemie

98

99 Léčba ovlivněním metabol.dráhy potrava 1 2 toxický prekursor substrát 3 toxický vedl. produkt netoxický produkt produkt 4

100 Dodání chybějícího produktu Přímo produkt blokované reakce Obohacování směsi AMK (Tyr u PKU) Glukosa u GSD Biotin u deficitu biotinidasy BH4 u defektů v synthese a recyklaci BH4 Distální obejití bloku Glukosa u poruch beta-oxidace MCT oleje u poruch beta.oxidace dlouhých MK Uridin u orotové acidurie Obohacování směsi AMK (Cys u deficitu CBS) Hemarginát u AIP

101

102 Léčba biotinem

103 MCT a mitochondrie MCT oleje Transport nezávislý na karnitinových transporterech Použití u defektů CARN a VLCAD

104 Léčba nespecifická systémová 1 Eliminace toxinů Hemodialysa Hemadsorption (výměnná transfuse) (peritoneální dialysa) 2 Obecná léčba Energie Hydratace Léčba infekce Atd.

105 Léčba poruchy cyklu močoviny CVVHD = continuous venovenous hemodiafiltration; HD = hemodiafiltration. Clay A S, Hainline B E Chest 2007;132: by American College of Chest Physicians

106

107