ÚVOD... 3 TEORETICKÁ ČÁST... 4 PROTEOMIKA Chromatografické separační metody...11 Elektromigrační separační metody...11

Transkript

1 ÚVOD... 3 TEORETICKÁ ČÁST... 4 PROTEOMIKA... 5 Proteom...5 Strategie analýzy v proteomice... 6 Stavba proteomu... 7 Aminokyseliny... 7 Peptidy... 8 Proteiny... 8 Identifikace proteinů... 9 Kvantitativní analýza...10 NÁSTROJE ANALÝZY V PROTEOMICE...11 Chromatografické separační metody...11 Elektromigrační separační metody...11 Elektroforéza Kapilární elektroforéza Kapilární elektrochromatografie Izotachoforéza Hmotnostní spektrometrie...15 Laserová desorpce a ionizace za účasti matrice Laserová desorpce a ionizace s modifikací nosiče vzorku Ionizace elektrosprejem Průletový analyzátor MS/MS (MS n ) Fragmentace v MALDI-TOF Rentgenová strukturní analýza...21 Nukleární magnetická rezonance...22 ENZYMATICKÉ ŠTĚPENÍ...23 Enzymatické štěpení v gelu a v roztoku Trypsin Peptidové mapování Enzymatické štěpení proteinů na MALDI terčíku CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE...27 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST PŘÍSTROJE A VYBAVENÍ...29 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE...30 REAKČNÍ PODMÍNKY ENZYMATICKÉHO ŠTĚPENÍ

2 PROVEDENÍ MECHANICKÉ MODIFIKACE MALDI TERČÍKU...33 PROVEDENÍ MECHANICKÉ MODIFIKACE MALDI TERČÍKU...34 Uzavřený mikroreaktor...35 Uzavřený mikroreaktor s omezením velikosti kapky...36 Nepájivá maska Modifikace terčíku pomocí PTFE Použití vysokovroucího rozpouštědla...42 Enzymatické štěpení po přídavku vysokovroucího rozpouštědla LIMIT DETEKCE V MALDI-TOF MS...46 LOD přístroje a příspěvek rušení...46 Příspěvek enzymatického štěpení...49 Příspěvek kinetiky štěpení...51 Závěr...54 SPOJENÍ CE A MALDI-TOF MS S LIF DETEKCÍ PRO ANALÝZU PROTEINŮ...55 ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK...58 POUŽITÁ LITERATURA

3 ÚVOD Tato diplomová práce je součástí projektu vývoje nové instrumentace pro komplexní analýzu proteomu. Příkladem možného uplatnění je analýza proteomu bakteriofága 812, který je označován za vhodného kandidáta pro fágovou terapii zejména pro rod Staphylococus Aureus. Instrumentace je založená na platformě off-line spojení kapilární elektroforézy s MALDI-TOF hmotnostní spektrometrií, kde se zpracování a detekce frakcí vzorku odehrávají na MALDI terčíku. Separace z CE je za subatmosférického tlaku nanášena na MALDI terčík, zóny proteinů jsou detekovány pomocí laserem indukovaná nativní fluorescence a následně jsou identifikovány metodou peptidového mapování pomocí enzymatického štěpení na terčíku. Teoretická část je proto zaměřená především na vybrané kolonové separační techniky používané pro analýzu biomolekul, se zaměřením na CE. V oblasti hmotnostní spektrometrie je kladen důraz zejména na MALDI-TOF MS. Zmíněny jsou i další metody využívané pro analýzu biomolekul. Mým úkolem v projektu vývoje nové instrumentace je studium enzymatického štěpení na terčíku a identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS a peptidového mapování. 3

4 TEORETICKÁ ČÁST 4

5 PROTEOMIKA Proteom Termín proteom byl zaveden v roce 1995 Marcem R. Wilkinsem pro označení veškerého proteinového komplementu kódovaného genomem. Název vznikl z anglické definice PROTEin complement able to be encoded by a given genome nebo PROTEin equivalent of a genome 1. Komplexní výzkum proteomu zahrnuje tři základní aktivity; identifikaci veškerých proteinů produkovaných určitou buňkou, tkání nebo organismem, definici vzájemných interakcí těchto proteinů nezbytných pro určitou biologickou funkci, a stanovení přesné trojrozměrné struktury proteinů klíčové pro identifikaci nízkomolekulárních ligandů, například látek, které mohou sloužit jako potencionální léčiva. Později v roce 2001 byly cíle proteomiky stanoveny poněkud přesněji jako identifikace všech proteinů kódovaných lidským genomem (popřípadě genomy dalších, zejména tzv. modelových organismů) s následným stanovením jejich a) exprese v různých buňkách daného organismu, b) subcelulární lokalizace v různých organelách, c) post-translačních modifikací, d) vzájemných interakcí a e) vztahu mezi strukturou a funkcí (strukturní proteomika). V závislosti na individuálních požadavcích se proteomikou rozumí i intenzivní studium skupiny proteinů, případně jediného proteinu se zaměřením na specifickou vlastnost. Přestože DNA je nositelem informací o struktuře proteinu, nelze často na základě pouhé znalosti genomu objasnit mnohé buněčné procesy. Informace uložená v genech je definována v podstatě lineární sekvencí čtyř znaků (A, C, T, G) a je tedy jednorozměrná. Informace uložená v proteinech je mnohorozměrná, závislá na faktorech jako alternativní splicing (jedna mrna produkuje různé proteiny), posttranslační modifikace, a konečně, správné sbalení proteinu 5

6 vedoucí k jednoznačné trojrozměrné struktuře definující biologii každého proteinu. Navíc je informace uložená v genech poměrně stabilní, zatímco proteom je časově proměnný. Koncentrace jednotlivých druhů proteinů se (na rozdíl od jejich genů) mění podle aktuálních potřeb organismu. Zatímco lidský genom byl sekvenován během jednoho roku v několika sekvenačních továrních halách na robotických zařízeních a DNA sekvenátorech 2, je pro řešení komplexního zadání lidské proteomiky nezbytná kombinace širokého spektra metodických přístupů od klasické chemie a biochemie proteinů až po nejnovější techniky automatického zpracování vzorků a identifikace proteinů hmotnostní spektrometrií. Strategie analýzy v proteomice Základní metodický arsenál proteomiky představují jednak techniky pro separaci proteinů a jejich detekci ve velmi komplexních směsích, dále techniky pro identifikaci jednotlivých proteinů a jejich přiřazení ke kódujícím DNA sekvencím. V neposlední řadě je to i bioinformatika umožňující zpracování obrovského množství takto získaných dat, jejich analýzu a modelování biologických procesů, které reprezentují. Technika dvourozměrné gelové elektroforézy (2D GE) stále zůstává vzhledem ke své unikátní separační účinnosti základem mnoha proteomických projektů. Použití imobilizovaných ph gradientů do velké míry vyřešilo problém reprodukovatelnosti prvního rozměru (IEF), i když stále přetrvávají problémy s analýzou hydrofobních, nerozpustných proteinů, příliš malých nebo příliš velkých proteinů, příliš kyselých nebo příliš bazických proteinů, apod. U některých látek, jako jsou například malé proteiny a peptidy, se dává přednost kolonovým technikám separace, jako je afinitní nebo iontoměničová (IEC) chromatografie, kapilární elektroforéza (CE), příp. využití několikarozměrného uspořádání (například kombinace IEC a RP-HPLC). Následuje napojení na hmotnostní spektrometrii především s měkkými ionizačními technikami (MALDI, ESI), a to jak on-line (CE-ESI, RP- HPLC-ESI), tak off-line (nanášení na MALDI terčík), příp. jako sběr frakcí. Při použití speciálních hmotnostních detektorů poskytující spektra s vysokým rozlišením (FT-ICR, Orbitrap) se objevuje reálná možnost získání detailních informací pro množství proteinů a peptidů odpovídající několika tisícům molekul. 6

7 V zásadě existují dva základní přístupy ke komplexní analýze proteinů. První tzv. topdown metoda zahrnuje MS, příp. MS/MS analýzu celých proteinů, druhá tzv. bottom-up někdy také shotgun metoda využívá specifického enzymatického nebo chemického naštěpení proteinů s následnou MS, příp. MS/MS analýzou produktů. Pro dělení je určující typ analytu v hmotnostním spektrometru, nikoliv použití separační techniky. Stavba proteomu Aminokyseliny Přestože je v přírodě známo více jak tři sta různých aminokyselin, v proteomu savců se jich běžně vyskytuje jen dvacet. Každá aminokyselina obsahuje dvě funkční skupiny, karboxylovou skupinu a aminoskupinu (kromě prolinu, který obsahuje iminovou skupinu) a alifatický nebo aromatický zbytek, navázaný na alfa uhlíku, který dělí aminokyseliny do několika skupin (polární, nepolární, kyselé, zásadité), a také určuje funkci dané aminokyseliny v polypeptidovém řetězci. Protože se na každém alfa uhlíku (vyjma glycinu) nacházejí čtyři různé substituenty, vykazují aminokyseliny optickou aktivitu. Aminokyseliny přítomné v bílkovinách se vyskytují zásadně v L-formě, u některých druhů antibiotik a u mikroorganismů je možná i D- forma. Každá aminokyselina je charakterizována nejméně dvěmi disociačními konstantami, které odpovídají disociaci karboxylové skupiny a protonaci aminoskupiny. Jejich volný náboj nabývá různých hodnot v závislosti na ph prostředí a při určitém ph (tzv. isoelektrický bod, pi) je celkový náboj molekuly roven nule. Kondenzační reakcí karboxylové skupiny jedné aminokyseliny a aminoskupiny druhé aminokyseliny za odštěpení molekuly vody vzniká peptidová vazba (Obr. 1). + H 3 N R 1 O O H 3 N R 2 O O - + H 3 N O C R 1 R 2 NH O - O Obr. 1: Schéma vzniku peptidové vazby 7

8 Peptidová vazba má částečný charakter dvojné vazby (je kratší než jednoduchá vazba, a je rigidní a planární), čímž je znemožněna rotace na vazbě C-N, avšak vazby mezi alfa uhlíky a alfa karboxylovou skupinou nebo alfa aminoskupinou umožňují volné otáčení postranních řetězců, ovšem jsou limitovány charakterem a velikostí postranních řetězců. Kvůli stérickému bránění převažuje antigonální konformace. Peptidy Peptidy jsou nízkomolekulární látky, které jsou tvořeny dvěma a více aminokyselinami spojenými peptidovou vazbou (viz výše). Dělí se podle počtu spojených aminokyselin (oligopeptidy, polypeptidy), podle struktury (lineární, cyklické), případně podle způsobu výroby (přírodní, syntetické). Při biosyntéze peptidů je možno jít typickou cestou (např. syntéza glutathionu), ale nejčastěji vznikají peptidy jako produkt specifického štěpení proteinů a tato směs peptidů je označována jako proteinová mapa a je využívána k identifikaci proteinu. Důležitým atributem každého peptidu je sekvence, čili druh a pořadí aminokyselin v jakém jsou na sebe napojeny. Při molekulové hmotnosti větší než cca deset tisíc hmotnostních jednotek se již hovoří o proteinech. Proteiny Proteiny, neboli bílkoviny, jsou přírodní vysokomolekulární látky složené z aminokyselin vzájemně spojených peptidovou vazbou a jsou součástí všech živých organismů. Molekuly proteinů mohou vytvářet protáhlé, vláknité, ve vodě nerozpustné struktury, tzv. fibrilární proteiny, neboli skleroproteiny (chrupavka, vlasy, rohovina, ), a kulovité, příp. elipsoidní, ve vodě rozpustné globulární proteiny, neboli sféroproteiny (enzymy, proteiny ze svalové tkáně, ). Sekvence aminokyselin určuje tzv. primární strukturu proteinu. Různé vlastnosti aminokyselin a jejich kombinace udávají jak prostorové záhyby aminokyselinového řetězce, z nichž je "stvořena" konečná podoba proteinu, tak i konečné vlastnosti proteinů. 8

9 Sekundární struktura je určena typy interakcí v jednotlivých úsecích polypeptidového řetězce (disulfidové a vodíkové můstky, hydrofobní a iontové interakce) a je tvořena dvěma základními tvary; alfa-šroubovicí a beta-skládaným listem. Terciární struktura udává trojrozměrný tvar polypeptidového řetězce a kvartérní struktura určuje prostorové uspořádání dvou a více polypeptidů v jednom proteinu. Všechna tato strukturní uspořádání pomáhají stabilizovat přirozenou konformaci proteinu, která však snadno podléhá fyzikálním a chemickým vlivům, jako jsou změna teploty, ph, zvýšení iontové síly a přítomnost tenzidů, solí, organických rozpouštědel, iontů těžkých kovů a dalších chemických látek. Dochází k tzv. denaturaci proteinu, což je rozložení resp. porušení sekundární a terciární struktury, přičemž primární struktura zůstává zachována. Denaturace může být reverzibilní nebo ireverzibilní; pokud při odstranění denaturačního činidla dojde k navrácení proteinu do původního stavu (strukturou i funkcí), jedná se o renaturaci. Identifikace proteinů Postup při identifikaci proteinů zahrnuje získání podrobnější informace o zkoumaném proteinu (molekulová hmotnost, isoelektrický bod, apod.), což ale ke spolehlivé identifikaci zdaleka nestačí. K jednoznačné identifikaci je třeba znát buď (alespoň částečnou) sekvenci proteinu, nebo jeho otisk, tzv. fingerprint. Dříve bylo nejpoužívanější metodou ke zjišťování sekvence peptidů a proteinů Edmanovo odbourávání, které spočívá v postupném odštěpování aminokyselin z polypeptidového řetězce a pomocí následné HPLC analýzy vznikajících fenylthiohydantoinových derivátů aminokyselin se stanoví N-terminální sekvence proteinu. Dnes se využívá specifického štěpení polypeptidového řetězce enzymem, bakteriální endopeptidázou nebo chemicky s analýzou vzniklých štěpů pomocí MS, příp. MS/MS. V zásadě existují tři různé přístupy k identifikaci proteinů, v závislosti na typu získaných dat pomocí hmotnostní spektrometrie. Ta mohou obsahovat molekulové hmotnosti peptidů, kombinace hmotností a částečné sekvence proteinu nebo MS/MS data. Poté lze identifikovat protein na základě databázového hledání při porovnávání hmotnostních fragmentů nebo části sekvence. Buď lze analyzovat skupinu vzniklých peptidů, nebo podrobně analyzovat alespoň jeden peptid. 9

10 Metoda peptidového mapování (PMF Peptide Mass Fingerprinting) je založena na porušení specifických peptidových vazeb v proteinu, v závislosti na použitém činidle a následné MS analýze. Produktem je směs peptidů (digest), jejíž hmotnostní spektrum vykazuje charakteristický otisk (fingerprint) daného proteinu. Porovnáním naměřených hodnot m/z s teoretickými hodnotami m/z získanými z mezinárodních databází je možné protein identifikovat. Při metodě sequence tag (SQT), příp. MS-tag se po specifickém štěpení pomocí MS/MS stanoví část sekvence (alespoň tři aminokyseliny) vybraného peptidu a na základě znalosti této sekvence je možné určit původní protein. Identifikace proteinu metodou accurate mass tag (AMT) probíhá na základě znalosti velmi přesné hmotnosti jednoho fragmentu po specifickém štěpení proteinu. Hmotnostní spektrometr musí mít vysokou rozlišovací schopnost (např.: FT-ICR MS, Orbitrap) a pokud je přesnost stanovení hodnoty m/z 1 ppm, existuje vysoká pravděpodobnost, že této hmotnosti odpovídá právě jedna kombinace aminokyselin, a tím i jeden protein. Kvantitativní analýza Kvantifikaci proteinů lze provádět několika způsoby v závislosti na použité metodě. Např. při analýze gelovou elektroforézou je možné proteiny barvit stříbrem, Coomassie blue, aj., při kvantifikaci po MS detekci jsou přidávány standardy značené stabilními izotopy 2 H, 13 C, 15 N, 18 O, nebo využity kombinované metody (ICAT, IMAC, itraq, SILAC, aj.). Při obarvování proteinů pomocí Coomassie blue (CB) lze využít jak klasickou, tak koloidní nebo horkou CB. Volba činidla pro obarvování závisí na požadované citlivosti, době odbarvování a ceny. Kvantifikace pomocí redukce dusičnanu stříbrného na kovové stříbro poskytuje sice vysokou citlivost, ale nevýhodou je vícekrokový postup, nízký dynamický rozsah a možný výskyt komplikací při MS analýze. Další možností je využití fluorescenčního značení (Sypro Ruby 3, Sypro Orange, ), které poskytují dobrou kvantifikaci, dynamický rozsah a také minimum kroků. 10

11 NÁSTROJE ANALÝZY V PROTEOMICE Chromatografické separační metody Chromatografické metody využívají k dělení složek směsi mnohonásobného opakovaného vytváření rovnovážných stavů složek mezi dvěma fyzikálně odlišnými fázemi, fází stacionární (nepohyblivou), a fází mobilní (pohyblivou). Proces separace je charakterizován rovnovážnými stavy vytvářenými na základě různých (kvantitativně i kvalitativně) fyzikálně chemických interakcí mezi složkou a mobilní fází, složkou a stacionární fází a také mezi mobilní a stacionární fází. Metoda vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC High Performance Liquid Chromatography) je standardní kolonová technika pro separaci proteinů a peptidů s vysokým rozlišením zón. Podstatou separace je rozdílná distribuce analytů ve vzorku mezi stacionární (sorbent) a mobilní fází (eluent). Gelová permeační chromatografie (GPC Gel Permeation Chromatography, SEC Size Exclusion Chromatography) využívá mechanického dělení molekul analytů v pórech gelu na základě jejich rozdílné velikosti (molekulové hmotnosti) a tvaru. Využívá se k preparativním separacím, ke stanovení molekulových hmotností, resp. při odstraňování nízkomolekulárních sloučenin (odsolování). Iontově výměnná chromatografie (IEC Ion Exchange Chromatography ) využívá rozdílné výměnné adsorpce analytů (iontů) na povrchu iontového měniče, neboli ionexu. Elektromigrační separační metody Elektromigrační separační metody využívají dvou elektrokinetických jevů elektroforézy a elektroosmózy. V prostředí obsahujícím roztok s nabitými částicemi a pevné povrchy stýkající se s roztokem, které mohou nést elektrické náboje (stěny kapiláry, povrchy přítomných částic), se vytvářejí elektrické dvojvrstvy a mezi nimi vzniká určité rovnovážné rozdělení nábojů. 11

12 V elektromigračních separačních metodách je na toto prostředí připojeno stejnosměrné elektrické pole, které poruší rovnováhu v rozložení nábojů a vyvolá jejich pohyb. Principem separace složek vzorku je rozdílná rychlost jejich migrace, neboť nabité částice různých složek se v určitém prostředí liší svou elektroforetickou pohyblivostí. Elektroforéza Elektroforéza spočívá v migraci elektricky nabitých částic v elektrickém poli, které je obvykle vytvořeno vložením konstantního stejnosměrného napětí mezi dvě elektrody. V zónové elektroforéze je prostředí mezi elektrodami tvořeno základním elektrolytem, který zajišťuje dostatečnou elektrickou vodivost v celém systému. Vzorek je dávkován do určitého místa tohoto systému. Separace probíhá na základě rozdílných elektroforetických pohyblivostí analytů v závislosti na tom, zda se jedná o kation, anion, nebo elektroneutrální látku. Velikost částic může být různá, od jednoduchých iontů až po makromolekuly. Vliv difuse, která se snaží vyrovnávat v celém objemu roztoku koncentrace složek, je nutné eliminovat, např. fixací složek během separace a elektroforézu provádět ve vhodném separačním loži. Jeho uspořádání může být plošné nebo kapilární. Dvourozměrná plošná gelová elektroforéza (2D GE) kombinuje dva druhy elektromigračních separací. Vzorek proteinů se nejdříve rozdělí isoelektrickou fokusací podle isoelektrických bodů (pi) jeho složek. V kolmém směru se pak plošnou elektroforézou v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsíranu sodného (SDS-PAGE) jednotlivé bílkoviny rozdělí pouze podle molekulových hmotností, protože přídavkem tenzidu získaly všechny složky směsi stejný náboj. Tímto způsobem lze separovat velmi komplexní směsi, obsahující tisíce proteinů a porovnávat dva a více vzorků při určování proteinové exprese. Kapilární elektroforéza V kapilární elektroforéze (CE Capillary Electrophoresis) je nosičem kapilára, která je naplněna základním elektrolytem vedoucím proud. Její konce jsou ponořeny do zásobníků 12

13 s elektrolytem, společně s elektrodami z inertního materiálu. Mezi elektrody se aplikuje vysoké napětí (10 30 kv). Doba analýzy se oproti plošnému uspořádání zkracuje zejména z těchto důvodů: Jouleovo teplo tvořené uvnitř kapiláry je účinně odváděno jejími stěnami, proto lze použít vyšších intenzit elektrického pole. Kapilára prochází detektorem a je prováděna on-line detekce. Elektroforézu doplňuje elektroosmóza. Elektroosmotický tok má za následek pohyb roztoku kapilárou k detektoru. Snižuje analytické časy a k detektoru unáší i částice migrující opačným směrem. Elektroosmotický tok Stěny kapiláry z taveného křemene obsahují silanolové skupiny, které v kontaktu s roztoky o vyšším ph disociují, čímž se vytváří záporný náboj stěny. Ke stěně je přitažena vrstva kationtů základního elektrolytu a vzniká stabilní elektrická dvojvrstva, tzv. Sternova vrstva. Kationty blíže středu kapiláry tvoří tzv. difusní vrstvu. Po aplikaci napětí tyto kationty migrují ke katodě. Kationty H + bývají silně hydratovány a jejich pohyb společně s asociovanými molekulami vody vyvolá tok celého roztoku ke katodě. Tento jev se nazývá elektroosmóza a tok se označuje jako elektroosmotický tok (EOF ElectroOsmotic Flow). Hodnota rychlosti může být i taková, že unáší ke katodě i anionty. Neutrální částice se pohybují rychlostí EOF, kationty rychleji, anionty pomaleji, v závislosti na jejich elektroforetické pohyblivosti. Rychlost EOF lze přídavky vhodných činidel upravovat, příp. jej úplně obrátit. Nejvíce využívané techniky v kapilární elektroforéze jsou CZE (Capillary Zone Electrophoresis kapilární zónová elektroforéza), MECC (Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography micelární elektrokinetická kapilární chromatografie), CGE (Capillary Gel Electrophoresis kapilární gelová elektroforéza), CIEF (Capillary IsoElectric Focusing kapilární isoelektrická fokusace). Poslední dvě jsou významnými technikami na poli separace biomolekul a v rozvoji biotechnologií léčiv. 13

14 Kapilární elektrochromatografie Kapilární elektrochromatografie (CEC Capillary ElectroChromatography) kombinuje principy kapilární elektroforézy a HPLC. Jako kolony jsou používány kapiláry plněné mikročásticemi stacionární fáze o rozměrech 1,5 5 µm. K plnění kolon se používá např. tlakového plnění suspenzí mikročástic v organickém rozpouštědle nebo v oxidu uhličitém v nadkritickém stavu, aplikace EOF, atd. Jsou používány náplňové kolony i kapilární kolony, u nichž je stacionární fáze na vnitřním povrchu kapiláry. Pro posun mobilní fáze je využívána aplikace stejnosměrného napětí a vyvolání elektroosmotického toku. V koloně nastává separace na stejných principech jako v HPLC. Velkou výhodou je pístový profil EOF, který podstatně zvyšuje účinnost separace. CEC je metoda využitelná jak pro neutrální, tak i nabité látky, od jednoduchých molekul až po makromolekuly. Izotachoforéza Separace iontů v isotachoforéze (ITP IsoTachoPhoresis) probíhá také na základě rozdílných elektroforetických mobilit, ale je řízena vloženým proudem (narozdíl od elektroforézy, která je řízena vloženým napětím). Roztok dělených iontů je dávkován jako rozhraní dvou rozdílných elektrolytů. První elektrolyt nacházející se před vzorkem se nazývá vedoucí (leading) a obsahuje ionty mající náboj stejného znaménka, ale vyšší hodnotu elektroforetické pohyblivosti než všechny separované ionty. Druhý elektrolyt nacházející se za vzorkem se nazývá uzavírající (terminating) a obsahuje ionty stejného znaménka jako dělené ionty, ale s nižší hodnotou elektroforetické pohyblivosti než všechny dělené ionty. Každý separovaný ion vytváří během analýzy svoji vlastní zónu. Zóny všech dělených iontů jsou uzavřeny mezi vedoucí a uzavírající elektrolyt a jsou seřazeny bezprostředně za sebou podle klesající elektroforetické pohyblivosti dělených iontů. 14

15 Hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrometrie (MS Mass Spectrometry) patří v širším slova smyslu mezi separační techniky, které převádí vzorek na ionizovanou plynnou fázi a vzniklé ionty separuje podle hodnoty podílu jejich hmotnosti a náboje (m/z). Jednotlivé kroky MS analýzy probíhají podle obecného schématu: převedení vzorku do plynné fáze ionizace extrakce, příp. urychlení iontů do hmotnostního analyzátoru separace iontů detekce iontů Hmotnostní spektrometrie se dělí do několika skupin, podle způsobu ionizace, separace, atd. Při převádění vzorku do plynné fáze rozhoduje počáteční skupenství vzorku. Pro plynný vzorek je potřeba pouze odstranit nosný plyn, u kapalných vzorků se využívá sprejových technik a pro pevné vzorky je většinou využívána laserová desorpce. Při ionizaci vzorku se rozlišuje tvrdá a měkká ionizace, kdy u měkké ionizace nedochází k významné fragmentaci analytu, a proto může být vhodná pro analýzu velkých molekul, jako jsou proteiny, polysacharidy, nukleové kyseliny, apod. Mezi tvrdé ionizační techniky patří elektronová ionizace (EI Electron Impact), ionizace elektrickým polem (FI Field Ionization), laserová ionizace (LDI Laser Desorption\Ionization) a další. Z měkkých ionizačních technik lze zmínit chemickou ionizaci (CI Chemical Ionization), sprejové techniky jako termosprej (TSI ThermoSpray Ionization), elektrosprej (ESI ElectroSpray Ionization)), bombardování urychlenými atomy nebo ionty (FAB Fast Atom Bombardment, FIB Fast Ion Bombardment), ionizaci sekundárními ionty (SIMS Secondary Ion Mass Spectrometry) aj. Dnes spolu s ESI pravděpodobně nejvyužívanější technika měkké ionizace je laserová desorpce a ionizace za účasti matrice (MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption\Ionization), 15

16 která k ionizaci využívá nízkomolekulárních organických látek k přednostní absorpci laserového záření a následnému přenosu převážně jednotkového náboje na analyt. Před vstupem do hmotnostního analyzátoru jsou ionty elektrickým polem urychleny a zaostřeny pomocí iontové optiky. Hmotnostní analyzátory, neboli separátory slouží k disperzi nebo filtraci iontů podle hodnot m/z, případně podle kinetické energie a mohou obecně pracovat ve dvojím módu. Buďto snímají hmotnostní spektra periodicky v čase, nebo sledují intenzitu jednoho nebo několika vhodně zvolených iontových druhů v čase, tedy jako selektivní detektor. Podle způsobu separace iontů se hmotnostní analyzátory dělí na: magnetický analyzátor (B) kvadrupólový filtr (Q) iontovou past (IT) průletový analyzátor (TOF) analyzátor využívající iontovou cyklotronovou rezonanci (ICR) Laserová desorpce a ionizace za účasti matrice Technika laserové desorpce a ionizace za účasti matrice (MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption\Ionization) byla poprvé popsána v roce 1987 Michaelem Karasem a Franzem Hillenkampem. 4 Japonský vědec Koichi Tanaka následně poprvé využil této ionizační techniky ke stanovení bioorganických molekul s hmotností vyšší než 10 kda, 5 za což mu byla spolu s Johnem Fennem udělena v roce 2002 Nobelova cena za vývoj měkké ionizační techniky pro analýzu biologickým makromolekul pomocí hmotnostní spektrometrie. Proces MALDI zahrnuje tři kroky: Vytvoření směsných krystalů analytu a matrice v důsledku vysokého přebytku matrice jsou molekuly analytu od sebe izolovány, což vede k vytvoření pevného roztoku. Excitaci matrice jakmile je laserový puls zaostřen na místo s krystaly analytu a matrice, většinu laserového záření absorbují chromofory matrice, čímž dochází k její rychlé desorpci. Ta s sebou strhává i molekuly analytu, který se odpaří a ochladí dříve, než se rozloží. 16

17 Ionizaci analytu vzhledem ke kyselé povaze matrice je analyt ionizován především přenosem protonu: MH + + ABCD ABCDH + + M (M je MALDI matrice) Je možný i přenos kationtu (např. Na +, K + ), obvykle v případech nedostatečně odsolených vzorků. Ionty jsou poté pomocí elektrického pole extrahovány do hmotnostního separátoru, kterým je nejčastěji průletový analyzátor (TOF Time-Of-Flight). Jako matrice se používají zejména organické kyseliny (Obr. 2), které vyhovují podmínce absorpce při vlnové délce použitého laseru (obvykle 337 nm). Obr. 2: Běžně využívané matrice v MALDI a) α-kyano-4-hydroxyskořicová kyselina (CHC) b) 2,5-dihydroxybenzoová kyselina (DHB) c) 3,4-dimethoxy-4-hydroxyskořicová kyselina (DHC) d) 4-hydroxy-3-methoxyskořicová kyselina (MHC) 17

18 Laserová desorpce a ionizace s modifikací nosiče vzorku Pro analýzu komplexních směsí proteinů je využitelná i modifikace MALDI techniky, tzv. SELDI (Surface-Enhanced Laser Desorption\Ionization). Ta je založena na principu úpravy povrchu nosiče vzorku, a to ve smyslu tvorby chemicky aktivní (hydrofilní, hydrofobní, normální fáze, kationtové, aniontové) nebo biologicky aktivní (protilátka, antigen, DNA, enzym, receptor) vrstvy o průměru 1 2 mm. Různorodost těchto povrchů dovoluje selektivně zachytit proteiny s nejvyšší afinitou k dané struktuře povrchu. Rozpuštěné směsi jsou nanášeny v malých dávkách a proteiny s dostatečnou afinitou jsou selektivně vázány. Následuje série několika promytí, kdy nespecificky nebo slabě vázané proteiny jsou odstraněny a specificky vázané proteiny jsou desorbovány laserem a analyzovány. Vzhledem k tomu, že pro analýzu jedné směsi se využívá více specifických interakcí, výsledkem SELDI analýzy pro každou interakci je specifický vzor, neboli otisk, který neumožňuje přímou identifikaci proteinů, ale poskytuje porovnání mezi jednotlivými vzorky. Analýza se uplatňuje při klinických studiích normálních a patogenních proteomů při léčbě leukémie 6 či rakoviny 7. Ionizace elektrosprejem Ionizace elektrosprejem (ESI ElectroSpray Ionization) je spolu s MALDI nejpoužívanější technikou měkké ionizace v hmotnostní spektrometrii. Objev ESI se připisuje Malcomovi Dole, který v 60. letech 20. století poprvé demonstroval využití elektrospreje k ionizaci bez poškození molekuly. O dvacet let později byla publikována práce Johna Fenna, který se svými spolupracovníky v laboratoři úspěšně využil ESI k měkké ionizaci netěkavých, termálně labilních, vysokomolekulárních biologických látek a jejich následné analýze pomocí MS. 8 Tato práce později vedla k udělení Nobelovy ceny za chemii v roce Základní uspořádání elektrospreje lze popsat následovně. Vzorek je zaváděn ve formě roztoku, ať prostou infúzí, anebo častěji jako tok eluentu z kapalinové chromatografie. Roztok vzorku protéká kapilárou, na jejíž konec je pomocí kapalinového spojení, přídavné kapaliny nebo pokoveného hrotu kapiláry přiváděno elektrické napětí (typicky 2,5 až 5 kv). Opačný pól se 18

19 nachází na elektrodě s otvorem, která slouží jako vstup do hmotnostního spektrometru. Působením elektrického pole dochází ke zvýšení koncentrace kladného náboje a tvorbě tzv. Taylorova kužele. Emitované kapky analytu a rozpouštědla z kapiláry získají povrchový náboj se stejnou polaritou jako je náboj na hrotu kapiláry a pohybují se ke vstupnímu otvoru protější elektrody. V průběhu letu dochází v protiproudu sušícího plynu k postupnému vypařování rozpouštědla, čímž se objem kapky postupně snižuje a zároveň se zvyšuje hustota povrchového náboje až do tzv. Rayleighovy limitní fáze, kdy se kapka vlivem odpuzování souhlasných nábojů asymetricky rozpadá na menší kapky. Tento proces se opakuje, dokud se v kapce nenachází (převážně vícenásobně) nabitá molekula analytu, která prochází vstupním otvorem štěrbiny diferenciálně pumpovaných komor do hmotnostního analyzátoru. Průletový analyzátor Průletový analyzátor (TOF Time-Of-Flight) využívá k separaci rozdílné rychlosti iontů v závislosti na poměru m/z. Jedná se o pulsní hmotnostní analyzátor; nejdříve jsou pulsem extrakčního napětí ionty urychleny na vstupu do analyzátorové trubice, získaná kinetická energie je dána rozdílem elektrického napětí ve zdroji. Hlavní výhodou je schopnost detekce molekul bez teoretického limitu m/z (prakticky cca 10 6 Da) a krátká doba záznamu spektra. Vysoká citlivost je dána extrakcí výrazné většiny iontů nacházejících se v iontovém zdroji a jejich transmisí k detektoru. Pro zvýšení rozlišení se využívá dvou konstrukčních prvků, které přispívají k zúžení disperze kinetické energie iontů. Použití tzv. iontového zrcadla, neboli reflektoru, slouží ke kompenzaci různých kinetických energií pro ionty se stejnou hodnotou m/z. Ionty s větší kinetickou energií proniknou hlouběji do odrazového elektrického pole reflektoru, čímž dojde k jejich opoždění oproti iontům s nižší kinetickou energií a tím i k vyrovnání celkové doby strávené v letové trubici, protože hloubka průniku iontů do elektrického pole reflektoru je přímo úměrná pouze jejich kinetické energii a nezávisí na hodnotě m/z. Druhým prvkem pro zvýšení rozlišení je pulsní (zpožděná) extrakce, která koriguje nerovnoměrnou disperzi počátečních kinetických energií iontů. Po laserovém pulsu je aplikováno nulové extrakční napětí po dobu cca 100 až 1000 ns. Během tohoto zpoždění se distribuce iontů v iontovém zdroji změní tak, že ionty 19

20 o stejném m/z, ale s vyšší kinetickou energií se budou nacházet dále od nosiče vzorku než ionty s nižší kinetickou energií. Následnou aplikací extrakčního napětí dojde k vyrovnání distribuce počátečních kinetických energií pro ionty o stejné m/z. Nevýhodou zpožděné extrakce je funkčnost pouze ve vymezeném, předem zvoleném, intervalu m/z. MS/MS (MS n ) Tandemová spojení dvou nebo více hmotnostních analyzátorů jsou určena ke studiu fragmentace iontů. Podstatou je selekce prekursoru (ion určený k fragmentaci) v iontovém zdroji, následuje extrakce studovaného iontu do fragmentační cely, kde dochází ke kolizím s molekulami plynu, a analýza dceřiných iontů (produktů) pomocí druhého hmotnostního analyzátoru. MS/MS lze provádět buď v prostoru, kdy je potřebná fyzická přítomnost dalšího hmotnostního analyzátoru (QqQ, Q-TOF, TOF-TOF, EBE-Q, EBE-TOF), nebo v čase pomocí iontové pasti (LIT Linear Ion Trap), FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance). MS/MS, příp. MS n u iontové pasti funguje na principu vypuzování všech nepotřebných iontů vyjma prekursoru, který se podrobí aktivačním kolizím s plynem a dalším vypuzováním iontů jsou proměřeny produkty, příp. provedena selekce dalšího prekursoru. Bylo demonstrováno až MS 10, ale v praxi se uplatňuje MS 2 MS 3 z důvodu klesajícího výtěžku iontů. Fragmentace v MALDI-TOF Fragmentace v MALDI-TOF slouží k získávání informací o struktuře analytu a k analýze směsí jako v případě tandemové hmotnostní spektrometrie (selekce prekursoru, fragmentace, analýza produktů). Jedná se však o tzv. pseudo MS/MS, protože k fragmentaci nedochází v kolizní cele v důsledku srážek s molekulami kolizního plynu, ale v důsledku vyšší počáteční excitace laserem. 20

21 Fragmentace za iontovým zdrojem Při fragmentaci za iontovým zdrojem (PSD Post-Source Decay) v MALDI-TOF je energie laseru zvýšena tak, aby došlo k rozpadu molekuly v průběhu letu. Prekursor je vybrán pomocí iontového selektoru (IG Ion Gate), což je zařízení vhodně umístěné za iontový zdroj, na které je přiváděno napětí vychylující všechny ionty směrem od detektoru. Pouze v okamžiku, kdy iontovým selektorem prolétá rodičovský ion, je napětí vypnuto a zvolený ion pokračuje k detektoru. Během letu se rozpadá a jeho kinetická energie se rozdělí mezi dceřiné ionty v poměru k jejich hmotnosti. K separaci dochází v reflektoru na základě různých kinetických energií a ionty dopadají na detektor v čase, který je funkcí jejich hodnoty m/z. V důsledku omezené rozlišovací schopnosti iontového selektoru je metoda vhodná jen v případě prekursorů s relativně velkými rozdíly molekulových hmotností. Fragmentace v iontovém zdroji Na rozdíl od fragmentace za iontovým zdrojem, které vyžaduje reflektor, vyžaduje fragmentace v iontovém zdroji (ISD In-Source Decay) pouze zpožděnou extrakci pro prodloužení pobytu vznikajících iontů v iontovém zdroji a k dosažení dostatečné intenzity spekter. Z praktického hlediska je ISD metoda zřídka použitelná, protože vyžaduje dokonalou separaci analytu před vlastní ionizací. Rentgenová strukturní analýza Rentgenové záření se rozptyluje na atomech a iontech prvků a interferuje na možných myšlených rovinách krystalu. Vzniklý difraktogram, který je charakteristický pro každou krystalickou sloučeninu slouží k objasnění struktury, případně k identifikaci látek. Znalost struktury nesmírně složitých komplexů má pro pochopení procesů odehrávajících se v biologických systémech základní význam a proto se proteinová krystalografie stala nezbytnou součástí molekulární biologie a biotechnologických aplikací. Proteinová krystalografie dovede v současné době popsat nejen molekulární strukturu a dynamiku, ale umožňuje i velmi přesný 21

22 odhad slabých mezimolekulárních interakcí v makromolekulárních systémech (hydrofobní síly, hydratace, vodíkové můstky), které rozhodují o jejich struktuře a funkci. V návaznosti na zlepšující se dostupnost zdrojů synchrotronového záření, propojení s metodami molekulárního modelování a s technikami využívajícími nukleární magnetické rezonance, představuje rentgenová strukturní analýza v současné době efektivní nástroj pro studium struktury a funkce biologických systémů na molekulární úrovni. Nukleární magnetická rezonance Spektrometrie pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR Nuclear Magnetic Resonance) může být považována za metodu komplementární k rentgenové difrakci. Jejím cílem je především doplnit chybějící údaje k úplnému popisu struktury a dynamiky krystalických a vysoce organizovaných systémů. Díky tomu je možné popsat strukturu a trojrozměrné uspořádání i u takových látek, které jen velmi neochotně poskytují krystaly vhodné k rentgenové difrakci, které jsou nerozpustné anebo poskytují pouze velmi zředěné roztoky. Existuje řada fyzikálních veličin sledovaných metodou NMR citlivých na rychlost a amplitudu vnitřních pohybů sloučenin, a právě NMR spektroskopie podává komplexní informace o vnitřní struktuře a uspořádání hmoty. Zatímco difrakční techniky neposkytují dostatečnou citlivost k atomům vodíku, protože má kolem sebe jen malou elektronovou hustotu, NMR experimenty jsou k přítomnosti vodíku 1 H velmi citlivé. 22

23 ENZYMATICKÉ ŠTĚPENÍ Enzymatické štěpení neboli trávení (digestion, enzymatic cleavage) je druhem specifického štěpení využívaného při analýze proteinů. Jedná se o specifické porušení peptidové vazby, v závislosti na použitém enzymu. Produktem je směs peptidů (digest), která vykazuje charakteristický peptidový otisk (fingerprint) daného proteinu. Obliba enzymatického štěpení u analýz proteinů tkví v přesunu hmotností z oblasti vysokých hodnot m/z do oblasti nízkých hodnot m/z. Zde jsou parametry hmotnostních spektrometrů výrazně lepší (rozlišení, citlivost, přesnost a správnost stanovení m/z) a izotopová obálka píků je užší. Užití proteolytických enzymů pro peptidové mapování je velmi časté, nicméně optimální podmínky štěpení jsou obvykle stanoveny individuálně. Existuje celá řada využívaných enzymů (lysin, chymotrypsin, papain, aj.), ale nejčastěji používaným enzymem je trypsin. Jeho specifita spočívá ve štěpení na C-konci lysinu nebo argininu, pokud nesousedí s prolinem (toto omezení nemá obecnou platnost, někdy lze pozorovat velmi pomalé štěpení této vazby) v alkalickém prostředí o ph 7-9. V ideálním případě je enzymatické štěpení specifické a úplné. V praxi však dochází i ke vzniku peptidů s nerozštěpenými místy (tzv. missed cleavage ). Dále se ve spektru se mohou objevit nadbytečné píky v důsledku autolýzy trypsinu, neselektivního štěpení, přítomností nečistot, post-translační modifikace (PTM Post-Translation Modification), aj. nebo naopak některé píky chybějí (adsorpce peptidů, vzájemné rušení peptidů, nedostatečné rozštěpení proteinu, PTM, atd.). Enzymatické štěpení v gelu a v roztoku Enzymatické štěpení v gelu je většinou využíváno po separaci z 2D GE. Ukotvení proteinu v gelu má své výhody, při modifikacích proteinu, při promývání, ale je zároveň hlavní nevýhodou. Póry gelu znesnadňují přístup enzymu k proteinu, štěpení probíhá většinou po delší dobu a v přebytku enzymu a po naštěpení je nutné vzniklé fragmenty z gelu extrahovat, většinou opakovanými přídavky acetonitrilu. Tyto faktory mohou negativně

24 ovlivnit celkovou výtěžnost, a proto je obecný zájem optimalizovat standardní postup při štěpení v gelu. 9 Při štěpení v roztoku není protein nikde ukotven, a proto je volně přístupný pro enzym. Enzym nemusí být v nadbytku, produkty není nutné extrahovat, autolýza trypsinu je výrazně nižší. Mohou se však objevit komplikace při snaze modifikovat protein, kdy přidaná činidla zůstávají s analytem v roztoku. Trypsin Trypsin se řadí mezi skupinu proteolytických enzymů označovaných jako serinové proteasy. Charakterizuje je přítomnost extrémně reaktivního serinového zbytku, který je zodpovědný za jejich enzymovou aktivitu. Struktura trypsinu byla objasněna v roce 1967 rentgenovou krystalografií. Spolu s chymotrypsinem a elastasou patří do skupiny trávicích enzymů, označovaných jako endopeptidasy. Jsou syntetizovány pankreatickými buňkami jako proenzymy, které je potřeba aktivovat prostřednictvím enteropeptidasy za specifického odštěpení N-terminálního hexapeptidu (H 3 N-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys). Tím se změní konformace molekuly, obnaží se aktivní centrum a trypsin, schopný další aktivace sám sebe, tzv. autokatalýzy, se stává aktivním. Tři výše uvedené endopeptidasy při štěpení proteinů katalyzují hydrolýzu peptidových vazeb s různou specifitou závislou na postraních řetězcích. Přestože trypsin a chymotrypsin obsahují shodné sekvence, jejich substrátová specifita se liší v důsledku rozdílných vazebných míst. V chymotrypsinu je vazebné místo pokryté hydrofobními skupinami, u trypsinu se nachází záporně nabitý řetězec kyseliny asparagové. Peptidové mapování Analýzou na MALDI-TOF MS je získáno hmotnostní spektrum fragmentů enzymatického štěpení. V případě trávení pomocí trypsinu je získáno spektrum s fragmenty peptidů s hodnotou m/z převážně v rozmezí Da, které jsou specifické pro daný protein. V mezinárodních databázích se nacházejí sekvence proteinů, které lze pomocí různých komerčních nebo volně dostupných programů teoreticky rozštěpit a porovnat s naměřenými hodnotami, což může vést k identifikaci proteinů. Pro všechny je společný 24

25 způsob hledání na základě několika parametrů. V každém případě musí být zadány hmotnosti jednotlivých peptidových fragmentů nalezených v hmotnostním spektru a typ použitého enzymu. Dále je potřeba určit toleranci m/z, která určuje možnou odchylku hodnoty m/z od teoretické hodnoty a výrazně ovlivňuje výsledek hledání. Pokud jsou známy podrobnější informace o štěpeném proteinu, lze zúžit počet kandidátů, např. zadáním rozmezí molekulových hmotností proteinu a/nebo pi proteinu, možných modifikacích proteinu, typ použitého hmotnostního spektrometru. Dále je možno zadat počet míst, která nebyla rozštěpena; obvykle se udává jedno, maximálně dvě, protože výrazně vzroste počet hmotností, které by mohli odpovídat specifickému štěpu proteinu a tím snížit relevanci výsledku. Výsledkem databázového hledání je seznam kandidátů proteinů, které by mohly odpovídat původnímu proteinu. Každý výsledek je charakterizován nejméně třemi číselnými parametry, MOWSE skóre, poměr nalezených m/z ku zadaným m/z peptidů a procento pokrytí sekvence (SQ Sequence coverage). Platí, že čím jsou tato čísla vyšší, tím vyšší je pravděpodobnost správné identifikace proteinu. Procentuální pokrytí sekvence proteinu zahrnuje sekvenci nalezených peptidových fragmentů do celkové sekvence proteinu. Jinak řečeno, určuje procento pokrytí všech aminokyselin v proteinu na základě znalostí hmotností jednotlivých specifických peptidů. Příklady volně dostupných databází a programů využitelných pro PMF: MS-Fit-ProteinProspector 10, MASCOT 11, PeptideSearch 12, MassSearch 13, Pep-Ident 14, Pro- Found 15, pepmapper 16, aj. Enzymatické štěpení proteinů na MALDI terčíku Spojení separační techniky (CE) s detekční technikou MALDI MS je běžně realizováno jako sběr frakcí CE eluátu do vialek. Eluát je také možno nanést přímo na 17, 18, 19 MALDI terčík, buď ve formě kontinuální stopy, nebo jako diskrétní, oddělené frakce. Při off-line spojení pak běžný postup detekce zahrnuje buď nanesení eluátu na terčík s předem nanesenou matricí, nebo nanesení matrice přes jednotlivé frakce vzorku, a analýzu pomocí MS, příp. MS/MS. V důsledku přidání matrice ke vzorku je znesnadněno enzymatické štěpení pomocí trypsinu, který vyžaduje alkalické ph. Navrhli jsme proto detekci proteinů ve frakcích pomocí laserem indukované nativní fluorescence (LIF Laser-Induced Fluorescence) a proteinů. V nepřítomnosti fluoreskující MALDI matrice je možné provést enzymatické štěpení přímo na terčíku, kdy na základě předchozí detekce pomocí LIF jsou vybrané proteiny 25

26 rozštěpeny. Štěpení probíhá ve vodném roztoku s přídavkem slabě alkalického pufru (typicky NH 4 HCO 3 ); vzhledem k malým objemům je třeba zajistit nevysychání roztoku. Z literatury jsou známy různé postupy při zajišťování vhodných podmínek, např. průběžné přidávání kapky pufru, 20 doba štěpení odpovídající době odpaření rozpouštědla, 21 použití trypsinem pokrytých nanovialek přímo na MALDI terčíku s dobou štěpení řádově v minutách, 22 nebo štěpení prováděné v boxu, ve kterém je přítomna voda a její nasycená pára, čímž dochází ke snižování rychlosti vypařování vzorku. 23 Pro jednoduché postupy však nejsou uvedeny detailní reakční podmínky, složitější postupy (nanovialky) nejsou kompatibilní s naším rozhraním CE-MALDI-TOF MS a k jeho provedení též chybí potřebná instrumentace. 26

27 CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE Jak bylo výše uvedeno, enzymatické štěpení se spolu s MALDI-TOF hmotnostní spektrometrií a peptidovým mapováním řadí k významným nástrojům využívaným při identifikaci proteinů. Tato diplomová práce je součástí komplexního projektu analýzy proteomu bakteriofága 812 pomocí off-line spojení CE a MALDI-TOF MS. Práce je zaměřena na studium enzymatického (tryptického) štěpení proteinů v malých objemech roztoku. Enzymatické štěpení je třeba prozkoumat z hlediska využití při analýze proteinů na MALDI destičce, což obnáší zajištění vhodných reakčních podmínek a porovnání s reakcí provedenou v makroměřítku (> 100 µl). Práce navazuje na diplomovou práci Jaromíry Novákové, která ověřila proveditelnost enzymatického štěpení v mikroměřítku na MALDI terčíku a za přítomnosti MALDI matrice. Vzhledem k tomu, že trávení pomocí trypsinu probíhá za zvýšené teploty, je důležité zajistit, aby po celou dobu štěpení roztok vzorku na terčíku nevyschnul. Díky lokalizaci zón proteinů na MALDI terčíku pomocí laserem indukované nativní fluorescenční detekce z pevné fáze není nutný přídavek MALDI matrice, který může komplikovat proveditelnost štěpení probíhajícího pouze za zvýšeného ph. Jedním z předmětů studia je vyzkoušení upraveného terčíku s pevně vymezeným místem pro kapku roztoku pomocí hydrofilně-hydrofobního rozhraní. Součástí práce je proto i výroba upravené destičky. Další zkoumanou alternativou je štěpení v roztoku se sníženou těkavostí, v práci tedy bude ověřena možnost enzymatického štěpení ve vodných roztocích s přídavkem vysokovroucího rozpouštědla. Pro úspěšné využití celkového konceptu zahrnujícího separaci CE, lokalizaci zón proteinu, enzymatické štěpení na terčíku a následující identifikaci peptidovým mapováním MALDI-TOF MS při analýze reálných vzorků je třeba zjistit nejnižší množství proteinu, které lze spolehlivě identifikovat. 27

28 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 28

29 PŘÍSTROJE A VYBAVENÍ Hmotnostní spektrometr MALDI-TOF, Axima CFR, Kratos Analytical Shimadzu Corporation (Velká Británie). Dusíkový laser 337 nm, relativní jednotky výkonu (0 až 180), maximu odpovídá výkon 6 mw při frekvenci 10 Hz. Software: Kratos Analytical Launchpad ver Termostat KEVA, Ing. Pavel Krásenský, Katedra analytické chemie PřF MU (Česká Republika), rozsah teplot C, umožňuje zahřívání vialek nebo MALDI terčíku. ph-metr Orion 720A (USA). Ke zpracování výsledků byl použit software MS Excel 2000, Microsoft (USA). 29

30 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE Acetonitril, C 2 H 3 N, ACN, 99.99% (Scharlau, Německo). Adrenokortikotropní hormon fragment 18 39, ACTH, 99 %, M R = 2464,1 g.mol -1 (Sigma- Aldrich, Německo). Amoniak, NH 3, 25% (POCh, Polsko). Angiotensin lidský, 97 %, M R = 1295,6 g.mol -1 (Sigma-Aldrich, Německo). Bradykinin, 99 %, M R = 1059,5 g.mol -1 (Sigma-Aldrich, Německo). Hovězí sérový albumin, BSA, M R ~ g.mol -1 (Sigma-Aldrich, Německo). Hydrogenuhličitan amonný, NH 4 HCO 3, 99% (Sigma-Aldrich, Německo). Kyselina trifluorooctová, CF 3 COOH, 99 % (Sigma-Aldrich, Německo). Kyselina α-kyano-4-hydroxyskořicová, CHC, M R = 189,2 g.mol -1 (Sigma-Aldrich, Německo). Redestilovaná voda z křemenné aparatury (Heraeus, Německo). Renin substrát tetradekapeptid, 96 %, M R = 1758,9 g.mol -1 (Sigma-Aldrich, Německo). Trypsin hovězí, specifická aktivita jednotek.mg -1 (Sigma-Aldrich, Německo). Trypsin vepřový, specifická aktivita >5000 jednotek.mg -1 (Promega, USA). 30

31 REAKČNÍ PODMÍNKY ENZYMATICKÉHO ŠTĚPENÍ V literatuře existuje řada návodů pro enzymatické štěpení proteinů. Jednotlivé postupy se liší zejména poměrem enzymu k substrátu a výběrem vhodných reakčních podmínek. 24 Přestože se tyto práce věnují převážně problematice štěpení v gelu, je možno aplikovat některé podmínky i pro štěpení v roztoku. Mezi hlavní parametry ovlivňující štěpení patří teplota a doba enzymatického štěpení. Současným trendem je co nejkratší doba analýzy, proto se objevily postupy s poměrně krátkou dobou štěpení za zvýšené teploty. 25 Nevýhodou štěpení za vysoké teploty je možná denaturace enzymu, kdy vlivem porušení sekundární a terciární struktury dochází ke ztrátě jeho funkce. Trávení může probíhat v roztocích s obsahem organického rozpouštědla i nad 50 %, jde převážně o acetonitril (ACN), který napomáhá kratším časům při štěpení a přispívá ke zlepšení kokrystalizace analytu s matricí. 26 Před samotným štěpením je vhodné substrát denaturovat (většinou 6 M roztokem močoviny) a modifikovat rozbalením jeho terciární struktury redukcí disulfidických můstků (-S-S-) na SH skupiny pomocí redukčního činidla (nejčastěji DTT) s následnou alkylací SH skupin, což zajišťuje lepší přístup enzymu k substrátu. Důležitým faktem je ph, optimální rozmezí ph při štěpení trypsinem je 7 9. Jsou popsány i přídavky surfaktantů, které podstatně ovlivňují celkovou dobu štěpení, a přitom nesnižují enzymovou aktivitu a neruší při MS analýze. 27 V současnosti je enzymatické štěpení jedním z nejvýznamnějších faktorů omezujících meze detekce proteinů pomocí MS, a tím i identifikaci proteinů. Se snižující se koncentrací proteinu se při zachování poměru enzym-substrát doba štěpení neúnosně prodlužuje. Do jisté míry je možné zvýšit koncentraci enzymu, ale vysoký poměr enzym-protein může vést k dominanci produktů autolýzy enzymu ve spektru a jiným komplikacím (nespecifické štěpení, výměnné interakce mezi disulfidickými můstky). Tyto enzymové fragmenty mohou potom rušit i původní signál analytu. Alternativní řešení může být použití imobilizovaného trypsinu přichyceného na vnitřním povrchu kapiláry. 28,29 Ale i zde dochází k problémům zejména u vzorků s vysokým obsahem solí. Na základě těchto informací a předchozí práce 30 jsme se rozhodli pro následující návrh experimentu. Jako modelový protein byl použit hovězí albumin (BSA Bovine Serum Albumin), díky jeho vysoké relativní hmotnosti cca a tím i počtu specifických fragmentů, které poskytuje po štěpení. Teplota byla zvolena 40 C a doba štěpení 2 hodiny. 31

32 Štěpení bylo prováděno na terčíku pomocí uzavřeného mikroreaktoru a hmotnostní poměr protein : enzym byl 10:1. Modifikace proteinu (denaturace, redukce a alkylace) nebyly prováděny, protože by analýzy byly komplikovanější a v závěru půjde o vzájemné srovnání experimentů. Lze předpokládat, že modifikace budou zahrnuty v konečné fázi experimentu. Při trávení byl použit amonný pufr zajišťující alkalické prostředí (ph ~ 9). Pro MALDI-TOF MS analýzu byl vždy připraven čerstvý roztok 60 mm matrice CHC v jednom dílu ACN a v jednom dílu 0,1 % TFA. Pokud není uvedeno jinak, přídavek kyselého roztoku matrice do reakční směsi sloužil také k zastavení reakce. Trypsin byl vybrán na základě výsledku MALDI-TOF MS digestu BSA, porovnávající trávení trypsinem zakoupeným od firmy Sigma a Promega (Obr. 3). Na dva spoty na MALDI terčíku byl nanesen 1 µl BSA o koncentraci 0,1 mg.ml -1. Následně byl k jednomu přidán 1 µl trypsinu od firmy Sigma a k druhému 1 µl trypsinu od firmy Promega, o koncentraci 0,01 mg.ml -1. Směs byla uzavřená pomocí mikroreaktoru a ponechána při teplotě 40 C po dobu dvou hodin. Reakce byla zastavena přídavkem 1 µl 60 mm roztoku MALDI matrice. Po odpaření rozpouštědel byly vzorky analyzovány MALDI- TOF MS v reflektronovém módu. Pulsní extrakce byla nastavena pro 1500 Da a počet pulsů laseru byl 200. Obvykle je trypsin přidáván k proteinu v určitém poměru protein : trypsin pohybujícím se 50:1 až 10:1. Zvolený hmotnostní poměr protein : enzym (10:1) odpovídal za daných podmínek reakční kinetice, pokud množství přítomného proteinu nekleslo pod určitou mez. V takovém případě byl použit trypsin o konstantní koncentraci 0,01 mg.ml -1 (Obr. 4), což odpovídá nižšímu poměru protein : trypsin (1:1). Z obrázku je patrné, pokud se sníží koncentrace proteinu pod ~ 0,01 mg.ml -1, je vhodné použít enzym v konstantní koncentraci. Jinak řečeno, koncentrace enzymu by neměla klesnout pod 0,01 mg.ml -1. Pro další experimenty byl použit pouze trypsin od firmy Promega, u kterého nedochází za daných podmínek při štěpení ke vzniku specifických produktů autolýzy, které by mohly znesnadnit identifikaci proteinu. 32