PROTEOMIKA

Transkript

1 PROTEOMIKA Středa: Čtvrtek: Pátek: Co je proteomika? Nástroje 2D elektroforéza IEF SDS PAGE Barvení Digesce Čištění peptidů Omezení 2D Zpracování Obrazu, Analýza 2D gelů (Dr. J. Pánek, AVČR) Hmotnostní spektrometrie (Dr. P. Halada, AVČR) Alternativní přístupy Nativní techniky Membránové proteiny Chromatografické Separace Klinická proteomika Sérové profilování Literatura a publikace Organizace

2 PROTEIN J. J. Berzelius 1838 Proteios PROTEOMIKA Marc Wilkins 1994 PROTEOM Kompletní sada bílkovin přítomných v daném okamžiku v buňce, nebo tkáni, zahrnující veškeré jejich modifikace, vzájemné interakce, lokalizaci a metabolický obrat. PROTEOMIKA kvantitativní a kvalitativní charakterizace úplné sady bílkovin organely, buněčné linie, tkáně nebo organismu kvantitativní a kvalitativní porovnání proteomů za různých podmínek

3 CÍL PROTEOMIKY Získat globální a integrovaný pohled na biologii studiem kompletní bílkovinné sítě buňky, spíše než studiem jednotlivých proteinů. Cílem je nejen identifikovat všechny bílkoviny, ale zároveň pochopit jejich funkci a strukturu a vytvořit 3D mapu buňky (určit lokalizaci jednotlivých bílkovin).

4 PROČ PROTEOMIKA KDYŽ MÁME GENOMIKU? nelze určit funkci proteinu na základě sekvence DNA nebo mrna nelze popsat molekulární mechanismy fyziologických dějů pomocí studia genomu 200 typů posttranslačních modifikací informace o lokalizaci bílkoviny!!!! špatná korelace hladin mrna a skutečných hladin bílkovin!!!! PROTOŽE PROTEINY A NIKOLIV GENY VYTVÁŘEJÍ FENOTYP!

5 JEDEN GENOM DVA PROTEOMY

6 JEDEN GEN, MNOHO BĹKOVIN Cca genů Několik set tisíc bílkovin

7 STRUKTURNÍ PROTEOMIKA vytváření buněčných nebo subcelulárních map, kompletní informace o bílkovinách a jejich interakcích v dané organele nebo víceproteinovém komplexu. STRUKTURNÍ FUNKČNÍ PROTEOMIKA cílená sub-proteomická izolace a charakterizace funkčních celků nebo souborů bílkovin na základě společné funkce.( identifikace sub-proteomů na základě interakce s nějakým ligandem.) PROTEOMIKA FUNKČNÍ EXPRESNÍ EXPRESNÍ PROTEOMIKA kvantitativní studium porovnávající expresi mezi různými proteomy

8 Počet publikací s proteomickou tématikou (Medline)

9 NOBELOVA CENA ZA CHEMII 2002 Desorpce laserem za přítomnosti matrice (MALDI) K. Tanaka Elektrosprejová ionizace John Fenn

10 KAM AŽ SAHÁ PROTEOMIKA? Graves and Haystead,(2002) MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, Vol. 66, No. 1

11 OBECNÉ SCHEMA PROTEOMICKÉHO EXPERIMENTU Separace směsi bílkovin Elektroforéza, chromatografie a jejich kombinace Výběr bílkovin k identifikaci Barvení gelů a výběr spotů, výběr píků Štěpení vybraných bílkovin a čištění peptidů Enzymatické či chemické štěpení spotů Nebo chromatografických frakcí, čištění Měření přesné hmotnosti peptidů a případně jejich Dalších fragmentů Získání hmotnostních spekter Porovnání hmotností sady peptidů s údaji o všech dostupných ORFs v databázích. Případně přímé porovnání sekvencí. Identifikace bílkovin

12 DVOJROZMĚRNÁ ELEKTROFORÉZA

13 HISTORICKÉ MINIMUM 2D ELEKTROFORÉZY 1930 Tiselius - papírová a škrobová elektroforéza (1948 Nobelova cena) 1956 Smithies a Poulík první 2D 1970 Laemli Akrylamidové gely 1971 Rigetti Izoelektrická fokusace (IEF) 1975 O Farrell : Kombinace IEF a SDS elektroforézy 1982 Bjellqvist: Immobilizované ph gradienty (IPG) Edmanovo sekvenování proteinů Hmotnostní spektrometrie a jemné způsoby ionizace (Tanaka a Fenn Nobelova cena) Genové databáze Nové detergenty a redukční činidla Metody detekce

14 TYPICKÉ USPOŘÁDÁNÍ 2D EXPERIMENTU Pandey & Mann Proteomics to study genes and genomes NATURE VOL JUNE 2000

15 Příprava vzorků Izoelektrická fokusace Ekvilibrace SDS-PAGE Detekce bílkovin Zpracování dat a vyhodnocení

16 PŘÍPRAVA VZORKŮ Kontaminace, ztráty, degradace, modifikace versus reproducibilita Proteiny mají nejnižší rozpustnost v oblasti ph kolem jejich izoelektrického bodu!!! Tělní tekutiny, tkáňové nebo buněčné homogenáty či homogenizované subcelulární frakce Homogenizace buněk, nebo tkáně ( buněčná frakcionace). Mechanické rozbití (krystalizace vody, homogenizéry, sonikace, french-press) Lyzační pufr s detergentem LYZAČNÍ PUFR PRO IEF: Močovina, thiomočovina chaotropní činidlo, zvýšení rozpustnosti, denaturace bílkovin Detergent (CHAPS) čistý zwitteriontový detergent zvýšení rozpustnosti snížení agregace bílkovin Redukční činidlo (DTT) redukce disulfidický můstků (ionizují se nad ph 8) DTT, tributylfosfin Nosičové amfolyty -- (carrier ampholytes, IPG buffers) jsou náhražkou pufrů, je to směs ionizovatelných látek vytvářejí potřebný ph gardient Pigment (BFB) pro snazší manipulaci

17 KON PROTEÁZY A NEČISTOTY VE VZORKU PROTEÁZY stále aktivní i ve vysoké koncentraci močoviny!!! DNA a RNA Zhoršená separace Barví se v kyselé oblasti gelu Sonikace, DNázy, RNázy, Precipitace, komplexování s amfolyty LIPIDY Zhoršená separace Detergent nebo precipitace SOLI Špatná separace Ultrafiltrace, mikrodialýza, precipitace PROTEÁZY Degradace bílkovin Inhibitory proteáz PMSF, koktejly Precipitace UNIVERZÁLNÍ ŘEŠENÍ : Precipitace acetonem, TCA nebo kombinací, ALE Stanovení koncentrace bílkovin Analytická versus preparativní nanáška ( mikrogramů)

19 B A A B B

20 ZÁPORNĚ NABITÉ AMINOKYSELINY ph 7 ph > 9

21 KLADNĚ NABITÉ AMINOKYSELINY (ph 7)

22

23 TEORIE IZOELEKTRICKÉ FOKUSACE Celkový náboj proteinu (net charge) je součtem všech jeho negativních i pozitivních nábojů. Kyselé a zásadité skupiny polypeptidu jsou v protonovány a deptrotonovány v závislosti na ph okolí. Amfoterní molekula (bílkovina) v elektrickém poli v gradientu ph migruje do bodu, kde je její celkový náboj rovný nule. ph tohoto bodu odpovídá izoelektrickému bodu (pi) dané bílkoviny. ph < pi ph=pi ph > pi

24 Net charge TEORETICKÁ DISOCIAČNÍ KŘIVKA DVOU BÍLKOVIN +3 pi pi ph ph pufru se vzorkem -4 + pi ph 3 ph 11 pi -

25 NOSIČOVÉ AMFOLYTY (CARRIER AMPHOLYTES) Zajišťují vytvoření stabilního a hladkého gradientu ph v elektrickém poli Vlastnosti: Vysoká pufrační kapacita a rozpustnost při vlastním pi Dostatečná a stálá elektrická vodivost Absence biologických efektů Nízká MW Původně: směsi různě dlouhých řetězců oligoamino-oligokarboxylových kyselin ALE ty MIGRUJÍ.nestabilní gradient!!! Zakotvené ph gradienty (Immobilized ph gradients IPG)

26 ZAKOTVENÉ PH GRADIENTY (IMMOBILIZED PH GRADIENTS IPG) Derivovaný akrylamid s disociovatelnými karboxy- a aminoskupinami

27 IPG STRIPY (IPG STRIPS) 3 mm široké, 0.5 mm silné, dehydrované - trvanlivost, reproducibilita, plastova podložka, stabilita, nemigrují, neinterferují s nimi redukční činidla.

28 ZOOMING ph ph 4-5 ph 5-6 ph 5,5-6, Celkem 1754

29 REHYDRATACE IPG STRIPŮ A NANÁŠKA VZORKU Rehydratace V pufru bez vzorku V pufru se vzorkem Cup loading (různé ph) aktivní pasivní Typický rehydratační pufr (většinou použit již pro lyzaci vzorku) 7 M Močovina 2 M Thiomočovina 2-4 % CHAPS 0.2 % DTT (TCEP, tributylfosfin] % Nosičové amfolyty (IPG pufr) % BFB

30 REHYDRATAČNÍ NANÁŠKA versus CUP LOADING PRO: Proteiny rovnoměrně rozložené, neprecipitují v místě nanášky Výhodné pro velké nanášky řidších vzorků Rehydratace a nanáška je spojena méně manipulací se vzorkem PRO: IEF ve vysoce kyselých a zásaditých gradientech probíhá lépe Vzorek jde přímo do gelu eliminují se proteinprotein interakce (např. proteázy) Aktivní rehydratace zlepšuje vstup velkých bílkovin do gelu PROTI: Vzorek je dlouhodobě při pokojové teplotě U bazických gradientů dochází k velkým ztrátám proteinu (nevstoupí do gelu) Při rehydrataci stoupá koncentrace proteinu mimo gel a může docházet k precipitaci PROTI: Proteiny s pi blízko bodu nanášky mají nízkou rozpustnost a mobilitu a mají tendenci precipitovat na povrchu gelu V první fázi se proteiny koncentrují na vstupu do gelu a mohou precipitovat

31 PODMÍNKY IZOELEKTRICKÉ FOKUSACE Optimalizace podmínek pro každý vzorek, typ stripu a nanášky. Platí zvlášť pro: větší nanášky, a větší a hydrofobnější proteiny. Teplota: kolem 20 o C ( KARBAMYLACE! versus krystalizace močoviny za nízkých teplot) Aktivníchlazení!!! Dochází k přehřívání na tzv. HOT SPOTS Elektrické podmínky : microa na strip, E co nejvyšší, kroky nebo pozvolný vzestup V praxi až 10 kv. Celková fokusace pro cm stripy kvh Prevence oxidace a vysychání stripu : parafinový olej

32 PŘEHŘÍVÁNÍ IPG STRIPŮ NA TZV. HOT SPOTS (HOT SPOTS jsou hrany iontových pásů - hranice oblasti s nízkou a vysokou vodivostí) E Soli a ionty pufrů

33 TYPICKÝ IEF BĚH V BIO-RAD Protean IEF Cell 18 cm strip ph 3-10 Rehydratační nanáška 1mg 50 microa / strip Celkem Vh + hold t [h]

34 INSTRUMENTACE IEF

35

37 EKVILIBRACE STRIPŮ PŘED DRUHÝM ROZMĚREM Cíle ekvilibrace: Převést bílkoviny do pufrů vhodných pro redukci, alkylaci a SDS separaci Maximalizovat přenos bílkovin ze stripu Redukovat disulfidické můstky Alkylovat cysteiny EKVILIBRAČNÍ PUFR (EQP): 50 mm Tris ph 8.8 2% SDS, 6 M močovina 30 % glycerol 15 min EQP + 1% DTT 15 min EQP % iodacetamid (!)

38 ELEKTROENDOOSMOTICKÝ EFEKT Nepohyblivé (zakotvené) nabité skupiny v elektrickém poli!! katoda Po ekvilibraci v neutrálním nebo zásaditém pufru: COOH disociovaná na COO-, aminoskupiny zůstávají nedisociované Disociovaný karboxyl je přitahována k anodě (+), ale nemůže. To je kompenzováno migrací H3O+ ke katodě (-) Voda nese rozpuštěné částice směrem ke katodě! COO- H3O + Následky: H3O + IEF : SDS-PAGE : bobtnání katodického (bazického) konce zhošená separace ztráta bílkovin na vstupu do gelu zhoršená separace + anoda

40 SDS ELEKTROFORÉZA SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis) Bílkoviny se rozdělují na základě jejich MW Záporně nabité SDS tvoří komplexy s bílkovinami a stíní náboje proteinu (1,4g SDS :1g proteinu) Komplex má jednotkový náboj na hmotnostní jednotku. Všechny komplexy jsou záporně nabité a migrují k anodě PUFR: Tris-chlorid/Tris-glycin pufrový systém s 0.1 % SDS Redukce disulfidických můstků (Dithiothreitol, Dithioerythrol, TCEP, beta-mercaptoethanol) SDS

41 POLYAKRYLAMIDOVÉ GELY Složení a příprava gelu: akrylamid (monomerní) bis-akrylamid (zesíťování polymeru) APS (katalyzátor, produkuje radikál), TEMED (tetramethylethylenediamine) odstraňuje kyslík bránící polymeraci) (+pufr a SDS) Celková koncentrace akrylamidu a bis-akrylamidu určuje KONCENTRACI (T) gelu v procentech (2-20 %) Poměr bis-akrylamidu a akrylamidu POROZITU (C) gelu. APS v zásaditém prostředí může reagovat s Trisem, koncentrace co nejnižší ve prospěch TEMEDu.

42 SDS-PAGE Ekvilibrace stripu Upevnění stripu : zalití agarózou MW markery? Podmínky separace: (minimalizace elektroendoosmozy, difúze, modifikace bílkovin a času) Nízké (nízké pole) prvních minut (redukce elektroendoosmozy) Teplota : o C, termostating, prevence smiling gelů, reprodukovatelný odvod tepla Výhoda rychlých separací (difuze se týká hlavně LMW) Plastic backing vs. fluorescence Reprodukovatelnost: Výhoda přípravy více gelů najednou pomocí multicasters

43

44 NEPHGE, Non-equilibrium ph gradient gel Někdy lepší pro bazické, hydrofobní a velké bílkoviny

45 WITA Small (8x7 cm), large (24x32 cm) and giant gels (48x32 cm) ( mouse ovary total protein extract, spots).

46

48 DETEKCE BÍLKOVIN V GELECH Citlivost Možnost kvantifikace Linearita signálu Dynamický rozsah Kompatibilita s MS Cena (nízká toxicita) Kolorimetrické viditelné barvení Fluorescenční barvení DIGE Radioaktivní detekce

49 DETEKCE BÍLKOVIN VIDITELNÝMI PIGMENTY COOMASSIE BLUE SOLI STŘÍBRA! Různá účinnost na různé proteiny! COOMASSIE BRILIANT BLUE HORKÁ CBB (CBB-R350) Citlivost ng KLASICKÁ CBB (CBB-R250) Citlivost ng KOLOIDNÍ CBB (CBB-G250) Citlivost ng BLUE SILVER (CBB-G250)!NEW! 2004, Candiano et al Citlivost 1-10 ng Alkohol-kyselina Pouze10 minut Vysoké pozadí Dlouhé odbarvování Alkohol-kyselina Odbarvování proteinů Špatná kvantifikace Nízká cena Alkohol - kyselina síran amonný Steady state (bez ztráty při odbarvení) Dobrá kvantifikace Středně vysoká cena Více pigmentu Alkohol - kyselina síran amonný Steady state (bez ztráty při odbarvení) Dobrá kvantifikace Středně vysoká cena

50 Jaterní homogenát, preparativní nanáška 2 mg, barvení koloidní Coomassie Blue 1025 spotů ph 4 ph 7

51 DETEKCE STŘÍBŘENÍM Redukce dusičnanu stříbrného na kovové stříbro, více než 100 variant Citlivost 0.5 ng! nízká cena Vícekrokový postup (až 20) Citlivý na přesnost Nízký dynamický rozsah Negativní barvení Komplikace s MS Problematická reproducibilita

52 FLUORESCENČNÍ DETEKCE (4 8 ng/band) (4 8 ng/band) (1 2 ng/band; comparable to silver staining) (4 8 ng/band) SYPRO RUBY (Molecular Probes) FLAMINGO (BIO-RAD) DEEP PURPLE (GE-Amersham) Sypro Ruby Dobrá kvantifikace Kompatibilní s dalším barvením Minimum kroků Dynamický rozsah Fluorescenční scanner (max. excitace daleko od UV) Sběr spotů je komplikovaný Flamingo Vysoká cena, ale..ale je tu ruthenium a bathophenantrolinsulfát

53 POROVNÁNÍ CITLIVOSTI SYPRO, STŘÍBŘENÍ A COOMASSIE Sypro Orange Sypro Ruby Silver Coomassie

54 2D-DIGE : 2D DIFFERENČNÍ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA (Cy2, Cy3, Cy5 Difference gel electrophoresis) Maleimid - Cys (-SH) Succimid - Lys (ε aminoskupina) Hydrazid - karbonyl

55

56 EXPERIMENTÁLNÍ USPOŘÁDÁNÍ PRO DIGE Minimální versus maximální značení Rozdíly v migraci FlaSH dyes (Fuji, Raytest)

57

58

59 RADIOAKTIVNÍ ZNAČENÍ Inkorporace značených aminokyselin ( 35 S methionin, beta zářič) nebo jiných prekurzorů ŽIVÝMI buňkami - metabolické značení Vysoká citlivost Nejvyšší dynamické rozsah ALE. Gel je nutné usušit před detekcí Klasická radiografie je nepraktická Fosfoimager nezbytný Rizika práce s izotopy

60 Viditelné Klasická CBB nízká citlivost Koloidní CBB střední citlivost, dobrá kvantifikace Hot CBB Stříbření nízká citlivost vysoká citlivost Fluorescenční Sypro a Rb-BPS vyšší citlivost, kvantifikace, dynamický rozsah, F-scanner DIGE Cy-2, 3, 5 a další vysoká citlivost, cena!, scanner a software Radioaktivní detekce 35S a další nejvyšší citivost,kvantifikace, dynamický rozsah, P-imager

61 ZÍSKÁNÍ A ZPRACOVÁNÍ OBRAZU Kritické parametry: rozlišení bitová hloubka (dpi, μm dynamický rozsah

62 KRITICKÉ PARAMETRY rozlišení (počet pixelů na jednotku délky obrázku- dpi, μm, ) bitová hloubka (počet bitů definující každý pixel, stupně šedi, 8 bitů 256 stupňů šedi 16 bitů stupňů šedi) dynamický rozsah (pozor na saturaci)

63

64 Získání obrazu a hloubka a tak 100 dpi 300 dpi.

65 Softwarové vyhodnocení 2D gelů Komerční: PDQuest Phoretix Melanie ProFinder Bio Numerics a další Volně dostupné: GelScape Open2Dprot

66 Co když to ale nevypadá tak hezky?

67 KDYŽ TO NECHODÍ..

68

69

70 LIMITY 2D ELEKTROFORÉZY aktivních genů v buňce proteinů Detekce (2-30 %) % proteinů zůstává mimo detekci

71 Hmotnostní a izoelektrický limit pro konvenční 2D

72 OMEZENÍ 2D TECHNOLOGIE Bílkoviny s extrémním pi! Bíloviny nad 150 kda! Membránové (hydrofobní) bílkoviny

73 Ztráty v průběhu 2D experimentu ZTRÁTY: Rehydratace % IEF 7-14 % Ekvilibrace % SDS-PAGE Fixace a barvení! Až 80 % proteinů může být ztraceno v průběhu konvenčního 2D experimentu!!!!!!

74 Příprava vzorků Izoelektrická fokusace Ekvilibrace SDS-PAGE Detekce bílkovin Zpracování dat a vyhodnocení Příprava vzorků pro identifikaci Identifikace bílkovin pomocí MS

75 ŠTĚPENÍ BÍLKOVIN MS analýza - Intaktní protein je příliš velký navíc komplikace s PTM Cíl fragmentace: Definovaně fragmentovat protein, aby jednotlivé peptidy byly dostatečně malé na optimální MS analýzu, ale zároveň poskytly dostatečnou sekvenční informaci Optimum 6-20 AA, cca Da Proteáza Místo štěpení Poznámka Trypsin za Lys, Arg nenásleduje Pro Glu-C (Proteáza V8) za Glu a Asp nenásleduje Pro Chymotrypsin za Phe,Trp,Tyr, Leu, Ileu, Val, Met nenásleduje Pro Lys-C za Lys nenásleduje Pro Arg-C za Arg nenásleduje Pro Chemická digesce CNBr Met organika, hydrofobní P. BNPS-SKATOL Trp Hydroxylamin Asn-Gly vazba

76 Trypsin: z kravského nebo prasečího pankreasu Štěpí na C- konci za Arg, Lys 50 kda protein : cca 30 peptidů Použití v roztoku, na blotu, v gelu Trypsin štěpí za Lys, Arg pokud nenásleduje Pro

77 PŘÍPRAVA VZORKŮ Z GELU PRO IDENTIFIKACI MS Výběr a vyříznutí spotu (spotpicking) Dehydratace gelu (redukce, alkylace) ACN, vakuum KERATIN!!! Rehydratace v pufru s Trypsinem Digesce 37 o C Extrakce (ACN) Čištění a koncentrace peptidů

78 ČIŠTĚNÍ A KONCENTRACE PEPTIDŮ PO DIGESCI ZipTips Chromatografie v reverzní fázi (Reverse Phase) Hydrofobní vazba peptidu na alifatické uhlovodíkové řetězce (C18 nebo C4) Objem vzorku po extrakci obvykle > 40 mikrolitrů Po koncentraci a odsolení na ZipTips jen 1 10 mikrolitrů