Separační metody používané v proteomice

Transkript

1 Separační metody používané v proteomice Pavel Řehulka rehulka@pmfhk.cz

2 Analýza proteomu analýza komplexní směsi proteom = soubor vyprodukovaných bílkovin v daném typu buněk nebo organismu v daném čase za definovaných podmínek lidská buňka obsahuje přibližně bílkovin koncentrační rozdíl je v buňce okolo 6 řádů, v plazmě 10 až 11 řádů cílená frakcionace a separace vzorku je klíčovým aspektem úspěšné proteomické analýzy frakcionace/separace lze provádět na úrovni proteinů MS proteinů topdown přístup (obtížné) peptidů po aplikaci (enzymatického) štěpení MS peptidů bottomup přístup (komplexní směsi)

3 Reference intervals for 70 protein analytes in plasma Anderson N L, Anderson N G Mol Cell Proteomics 2003;2: by American Society for Biochemistry and Molecular Biology

4 Štěpení proteinů enzymaticky specifické trypsin Ckonec lysinu a argininu (nenásledujeli prolin) AspN Nkonec kyseliny asparagové GluC Ckonec kyseliny glutamové ArgC Ckonec argininu LysC Ckonec lysinu méně specifické chymotrypsin Ckonec fenylalaninu, tyrosinu a tryptofanu (někdy i methioninu a leucinu) pepsin Ckonec fenylalaninu, tyrosinu, tryptofanu, methioninu nespecifické (používá se někdy pro analýzu membránových proteinů a glykoproteinů) subtilisin proteináza K

5 Štěpení proteinů chemicky CNBr Ckonec methioninu s následnou modifikací methioninu na homoserin lakton (pozor: CNBr je vysoce toxický) 2% kys. mravenčí Ckonec kys. asparagové kyselina chlorovodíková 6M roztok při 110 C po dobu 24 hodin aminokyselinová analýza

6 Vlastnosti proteinů a peptidů jsou určeny složením a uspořádáním aminokyselin (primární, sekundární, terciární struktura) dále též posttranslačními modifikacemi molekulová hmotnost (MW) isoelektrický bod (pi) hodnota ph kdy má amfoterní molekula celkový neutrální náboj hydrofobicita tzv. GRAVY index (grand average of hydropathicity) nástroje pro teoretickou predikci některých vlastností

7 Přehled aminokyselin vyskytujících se v přírodě Glycine Gly; G Alanine Ala; A Valine Val; V Leucine Leu; L Isoleucine Ile; I Methionine Met; M Proline Pro; P Phenylalanine Phe; F Tryptophan Trp; W Tyrosine Tyr; Y Cysteine Cys; C Histidine His; H Lysine Lys; K Arginine Arg; R Serine Ser; S Threonine Thr; T Aspartate Asp; D Glutamate Glu; E Asparagine Asn; N Glutamine Gln; Q

8 Small Fyzikálněchemické vlastnosti aminokyselin Tiny P Proline Aliphatic V C SS A G C SH S N Q L I T D E Aromatic M F W Y H K R Positive Negative Polar Hydrophobic Charged Livingstone, C. D. & Barton, G. J. (1993). Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation. Comput. Appl. Biosci. 9,

9 Fyzikálněchemické vlastnosti aminokyselin GASPVTCLINDQKEMHFRYW GA VTCLI K MHF YW hydrophobic S S NDQKE H RYW polar GASPVTC ND small P proline GAS tiny V LI aliphatic HF YW aromatic K H R positive D E negative D KE H R charged Livingstone, C. D. & Barton, G. J. (1993). Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation. Comput. Appl. Biosci. 9,

10 Relative frequency Rozložení četnosti aminokyselin (databáze UniProt rel. 2011_01; NCBInr rel ) 10% 9% 8% UniProt_SwissProt_2011_01 NCBInr_ sequences sequences 7% 6% 5% 4% 3% 2% 1% 0% L A G S V E I T R K D P N F Q Y M H C W UniProt_SwissProt_2011_ NCBInr_ AA Residue

11 Relative frequency Rozložení četnosti proteinových sekvencí podle počtu aminokyselinových zbytků UniProt_Sprot_2011_01 NCBInr_ % 0.50% 0.40% 0.30% 0.20% 0.10% 0.00% # AA Residue

12 Separační metody separace = rozdělení vzorku na více podílů o rozdílném složení charakteristiky separačních metod selektivita metody schopnost dělit látky na základě různých vlastností, např. fyzikálních (bod varu) nebo chemických (polarita molekuly) rozsah použitelnosti pro jaké skupiny analytů lze separační metodu použít frakcionační kapacita maximální počet složek, které lze oddělit v průběhu separace

13 Rozdělení separačních metod používaných v proteomice metody na principu využití různých rovnovážných rozdělovacích konstant mezi dvěma fázemi extrakce: solid liquid, liquid liquid, liquid solid chromatografické metody varianty kapalinové chromatografie jednodimenzionální HPLC, GPC, SCX, TLC, afinitní LC... vícedimenzionální 2DLC (SCXRP, RPRP), chromatofokusacerp,... separace polem elektromigrační metody jednodimenzionální IEF, SDSPAGE, CE, FFE,... dvojdimenzionální 2DGE ultracentrifugace frakcionace tokem v silovém poli (FFF) průtoková cytometrie hmotnostní spektrometrie (MS) membránové separace ultrafiltrace dialýza

14 Extrakce na pevné fázi wetting 100% ACN equlibrating 2% ACN / 0.1% TFA sample loading washing 2% ACN / 0.1% TFA elution 60% ACN / 0.1% TFA C 18 stationary phase to waste to waste collect flowthrough (optional) or to waste to waste collect purified sample

15 Chromatografie vzorek (směs analytů) stacionární fáze mobilní fáze pro úspěšnost separace je důležitá rozdílná interakce analytů se stacionární fází (ovlivněná danou mobilní fází)

16 Signál detektoru Chromatogram při eluční metodě start pík inert n... počet teoretických pater kolony 2 t 16 R n Yt n t 5 R.54 Y1/ 2 2 pík složka A Y 1/2 šířka píku v polovině výšky h/2 h výška píku výška píku základní linie Y t šířka píku v základně mrtvý retenční čas t M t R t R retenční čas redukovaný retenční čas Čas

17 Závislost účinnosti kolony na lineární rychlosti mobilní fáze podle van Deemterovy rovnice H H van Deemterova rovnice H = H A + H B + H C nebo H = A + B/u + Cu kde u = L/t M H C H min H B H A turbulentní difúze H B molekulární difúze H C odpor proti převodu hmoty H A H opt u

18 Druhy kapalinové chromatografie používané v proteomice jednodimenzionální metody vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) na reverzní fázi (RPLC) gelová permeační chromatografie (GPC nebo SEC) iontově výměnná chromatografie (IEX SCX, SAX) afinitní chromatografie (AC) chromatografie na tenké vrstvě (TLC, HPTLC) vícedimenzionální metody SCXRP, RPRP...

19 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie High Performance Liquid Chromatography (HPLC) zásobníky mobilní fáze A a B A B řízení gradientu typická lineární rychlost: 36 mm/sec směšovač vzorek kolona detektor vysokotlaké čerpadlo dávkovací zařízení termostat eluát

20 HPLC na reverzní fázi (RP) sorbent stacionární fáze je hydorfobní náplň uhlovodíkový řetězec navázaný na: silikagelu polymeru Hydrofobicita různý počet uhlíků C4, C8, C18 (proteiny peptidy) mobilní fáze vodný roztok s přídavkem TFA nebo kys. mravenčí gradient tvořený organickým rozpouštědlem ACN Hydrofobní řetězec rozměry kolony velikost částic porozita Příklad označení kolony: C18, 75 um x 15 cm, 3um, 300Å

21 Typy částic v chromatografii na reverzní fázi silikagelové částice klasické i hybridní, např. Ethylene Bridged Hybrid (BEH) particle (pro UPLC) 4 polymerní částice např. kopolymer styrenu a divinylbenzenu monolitické kolony solgel, methacrylate based coreshell částice separační efektivita sub 2 um částic při 4050% tlaku (nebo 100% 3 um) Ascentis Express Sigma Kinetex Phenomenex Poroshell Agilent Technologies 0.5 um 3 um 1.7 um 0.5 um

22 Organická rozpouštědla pro mobilní fázi parametry vizkozita souvisí s protitlakem při separaci UVcutoff omezuje rozsah UV detekce index polarity nízká polarita rychlejší eluce (vhodné pro čištění kolon) cena používaná rozpouštědla acetonitril nejčastěji používaný, nízký UVcutoff i protitlak methanol nízká cena, vyšší protitlak ethanol nepoužívá se (kvůli protitlaku) isopropanol čištění kolon při nízkém průtoku (vysoký protitlak) aceton vysoká absorbance v UV oblasti (někdy se používá pro zjištění mrtvého retenčního objemu) tetrahydrofuran vysoká cena

23 Chromatografické metody HPLCRP 1 10, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,150 8,20 1 December06 #38 [modified by OBSLUHA] smes 9peptidu UV_VIS_1 mv 8,40 8,60 8,80 9,00 9,20 9,40 9,60 1 9,80 10,00 10,20 6,54 7,00 7,50 2 December06 #39 [modified by OBSLUHA] hemoglobin digest UV_VIS_1 mv 8, , , , , , ,430 Rozdělení směsi 9ti peptidů UV detekce 19 23, ,677 Rozdělení tryptického digestu hemoglobinu UV detekce 8,50 9,00 2 9,50 10,00 10,68 min 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0 37,5 40,0 42,5 45,0 47,5 50,0 52,5 56,0

24 Iontově výměnná chromatografie separace probíhá na základě afinity nabitých proteinových/peptidových částic ke stacionární fázi eluce probíhá vyplavením pufru o větší iontové síle krokově gradientově kationtově výměnná (SCX, WCX) aniontově výměnná (SAX, WAX)

25 Gelová chromatografie Gel Permeation Chromatography (GPC) také Size Exclusion Chromatography (SEC) větší částice se pohybují rychleji než malé, které jsou brzděny interakcí s póry gelu spíše jako hrubá frakcionace

26 Afinitní chromatografie Affinity Chromatography (AC) vazba proteinu přes specifickou vazebnou schopnost substrát protilátka využíváno např. pro odstranění proteinů o veliké koncentraci ze séra Až 20 nejkoncentrovanějších (albumin, immunoglobuliny) purifikaci proteinových komplexů prekoncentraci glykoproteinů (lektiny)

27 Ukázka specificity separačních technik

28 Vícedimenzionální chromatografie možné kombinace Iontově výměnná + na reverzní fázi SCXRPLC, WAXRPLC Gelová permeační + na reverzní fázi SECRPLC Afinitní + na reverzní fázi ACRPLC Na reverzní fázi + kapilární elektroforéza RPLCCE

29 Vícedimenzionální chromatografie princip kombinace SCXRP nástřik SCX kolona 1. dimenze trap RP odpad pumpa pumpa peptidová směs RP kolona 2. dimenze MS (ESI) štěpení proteinová směs (celý lysát, frakce)

30 Vícedimenzionální chromatografie kombinace SCXRP Benefit: Sensitive Drawback: Not Robust

31 Aplikace vícedimenzionální chromatografie SCXRPLC Kvasinky 1484 proteinů (Washburn et al, Nat. Biotech, 19, 2001, ) Nano 2DLC 100 fmol BSA proteinů E.coli / analýzu (celkem 500) (Nagele et al, J.Chromatogr. A, 1009, 2003, )

32 Aplikace vícedimenzionální chromatografie Analýza HMEC (human mammary epithelial cells) Lyzát celých buněk Gelová permeační chromatografie Digesce (trypsin) 6 frakcí 1574 proteinů SCX separace RP separace 114 frakcí (NET evaluace) 5836 jedinečných peptidů MSMS spekter (LCQ Thermo Finnigan) peptidů Jacobs et al., J. Proteome Res, 2004, Vol 3, No.1

33 Gelová elektoforéza Gel electrophoresis (GE) jako matrice pro separaci se používá polyakrylamid pro separaci proteinů agaróza pro separaci nukleových kyselin lze ji provádět jak za nativních, tak i denaturujících podmínek (dithiothreitol DTT, dodecylsulfát sodný SDS) dvě základní varianty jednodimenzionální (1DGE) často používaná ve formě SDSPAGE dvojdimenzionální (2DGE) zde se jako první separační krok používá isoelektrická fokusace je to metoda schopná rozdělit velmi složité směsi bílkovin

34 Polyakrylamidová gelová elektroforéza se dodecylsulfátem sodným Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDSPAGE) Cathode () O 3 S O 3 S O 3 S SO 3 SO 3 SO 3 protein molecule O 3 S O 3 S SO 3 SO 3 O 3 S SO 3 O 3 S O 3 S SO 3 SO 3 SDS Anode (+)

35 SDSPAGE

36 Isoelektrická fokusace Isoelectric Focusing (IEF) Anode (+) Cathode () (a) COOH NH 3 + (b) COO NH 2 (c) COO NH ph gradient pi

37 IEF praktické provedení isoelektrická fokusace separace proteinů v závislosti na isoelektrickém bodě IPG proužky imobilizovaný ph gradient různý gradient ph 310, 47, 611, 4,55,5

38 Dvojdimenzionální gelová elektroforéza (2DE) schéma postupu IEF SDS PAGE MS analýza +

39 Druhá dimense + 2DE princip metody První dimense pi pi 10 _ Polyakrylamidový gel

40 2DE vizualizace proteinů Vizualizace proteinů: Citlivost Kompatibilita s identifikací Dynamický rozsah Stříbření Modření koloidní coomasie modří (Coomassie Brilliant Blue) Fluorescenční barvení Sypro Ruby

41 2DE relativní kvantifikace

42 DIGE Differential gel electrophoresis Modifikace 2DE vzorky označené různou flourescenční barvou CY2, CY3, CY5 různé maximum excitační energie

43 Nativní elektroforéza Elektroforéza bez denaturačních činidel a detergentů Zachovává aktivní konformaci proteinů Lze testovat aktivitu Lze purifikovat velké komplexy Modrá nativní elektroforéza Blue native (BN) Coomasie modř, udává proteinům negativní náboj V kombinaci s SDSPAGE 2D BN/SDS PAGE

44 2D BN/SDSPAGE membránových proteinových komplexů E. coli J.P. Lasserre et al. Electrophoresis 2006, 27,

45 Kapilární elektroforéza Capillary electrophoresis (CE) vhodné pro polární látky relativně vysoké rozlišení obvykle detekce UV nebo vodivostním detektorem offline spojení s MALDI (např. dávkovací zařízení Probot) užší výběr kompatibilních pufrů online spojení s ESI není obvyklé a bývá komplikovanější omezení v množství nanášeného vzorku některé látky silně interagují se stěnou kapiláry (proteiny)

46 Schéma kapilární elektroforézy vyhodnocení signálu separační kapilára detektor vzorek dávkování elektrolyt (pufr) elektrolyt (pufr) ~ V zdroj napětí

47 Free Flow Electrophoresis Metoda založená na principu isoelektrické fokusace v roztoku Vysoké rozlišení Odpadá problém s precipitací proteinů v gelu Obdobný princip ROTOFOR ZOOM

48 Separace organel frakcionace Analýza subproteomu Cytoplasma Membrány G Bakterie Vnější Vnitřní Mitochondrie, chloroplasty Fagozómy, jiné buněčné váčky Jádro

49 Frakcionace Ultracentrifugace Diferenciální centrifugace různé sedimentační schopnosti organel Zónální centrifugace gradient Sacharóza, ClCs

50 Průtoková cytometrie Flow cytometry měření více charakteristik jednoduchých částic, často buněk (0,2150 um) relativní velikost (FSC) relativní granularita (SSC) relativní intenzita fluorescence skládá se z: fluidní systém transport částic do místa osvětlení laserem optický systém lasery, filtry, doprava signálu do detektoru elektronický systém konverze detekovaného světla a zpracování signálu (někdy i separace jednotlivých částic)

51 Schéma zařízení pro průtokovou cytometrii sheath sample nozzle hydrodynamic focusing stained cells fluorescence scattered light light source droplet generation deflected droplets sorted cells waste sorted cells

52

53 Mass Spectrometer Ion Source Mass Analyzer Detector % Recorded Spectrum m/z

54 Membránová separace dialýza přívod čistého rozpouštědla semipermeabilní membrána vzorek odvod difuzátu

55 Inhibition of plant amine oxidases by a novel series of diamine derivatives polyamines (i.e. putrescine, spermidine and spermine) are involved in cell growth and differentiation their levels are controlled by biosynthesis (ornithine decarboxylase, spermidine synthase, spermine synthase) and biodegradation (quinoprotein copper containing amine oxidases CAOs; flavoprotein polyamine oxidases PAOs) CAOs act on primary amino groups of diamines (diamine oxidases), PAOs act on secondary amino groups both CAOs and PAOs show up their own spectrum of inhibitors isolation of oat polyamine oxidase (OPAO) and its partial denovo sequencing using MALDITOF/TOF mass spectrometry characterization of newly synthesized diamine derivatives and measurement of their dual inhibition toward CAOs and PAOs

56 Improved isolation of polyamine oxidase from oat seedlings (OPAO) Purification step Volume (ml) Total activity (nkat) Total protein (mg) Specific activity (nkat/mg) Enrichment factor (fold) Yield (%) Crude extract Protamine precipitation (NH 4 ) 2 SO 4 60% sat., dialysis DEAEcelullose chromatography SPSepharose FF chromatography Hydroxyapatite chromatography Mono S column Chromatography Improved isolation resulted in: higher enzyme activity, higher enrichment factor, lower yield avoiding acetone precipitation (= risk of enzyme denaturation)

57 1D SDS PAGE of isolated OPAO kda ~ 56 kda