Identifikace proteinu (z gelu nebo z roztoku)

Transkript

1 LC/MS a CE/MS v proteomické analýze OBSAH Příklad jednoduché analýzy Separční techniky MS techniky Identifikace proteinů Určení molekulové hmotnosti Analytická výzva Mgr. Martin Hubálek, Ph.D. Ústav organické chemie a biochemie AVČR, v.v.i. hubalek@uochb.cas.cz 1 Příklad jednoduché proteomické analýzy Identifikace proteinu (z gelu nebo z roztoku) LC MS/MS analýza peptidové směsi (tryptického digestu) Porovnání MS/MS spekter proti vybrané databázi 2

2 Přehled analýzy 3 Výsledek analýzy Score % Cov Accession # Name Species Peptides (95%) sp P20347 CPI1_SOLTU Cysteine protease inhibitor 1 Solanum tuberosum 287 MKSINILSFLLLSSTLSLVAFARSFTSENPIVLPTTCHDDDNLVLPEVY DQDGNPLRIGERYIINNPLLGAGAVYLYNIGNLQCPNAVLQHMSIPQFL GEGTPVVFVRKSESDYGDVVRVMTVVYIKFFVKTTKLCVDQTVWKVNDE QLVVTGGKVGNENDIFKIMKTDLVTPGGSKYVYKLLHCPSHLGCKNIGG NFKNGYPRLVTVDDDKDFIPFVFIKA 4

3 Jednotlivé části analýzy separace Nano HPLC Kolona: Aclaim PepMap Rozměr: 75 um x 150 mm Stacionární fáze: C18 Velikost částic: 3um Velikost pórů: 100A Mobilní fáze: A Voda, 0,1% kys. mravenčí B Acetonitril, 0,1% kys. mravenčí Průtok: 300 nl/min Gradient: 100 analýza MS Nano ESI Hybridní MS přístroj TripleTOF Uspořádání: kvadrupol kolizní cela TOF Akvizice dat: IDA (information dependent acquisition) Identifikace proteinů SW: Protein Pilot Databáze: proteiny Solanum tuberosum z databáze Uniprot Separační systémy pro peptidy a proteiny Gelová Elektroforéza: HPLC: 1D SDS PAGE 2D isoelektrická fokusace, SDS PAGE RP- na C18, gradient acetonitrilu a vody s přídavkem HCOOH nebo CH 3 COOH, většinou v nano- nebo mikro- měřítku SEC gelová chromatografie IE iontově výměnná na silném katexu (SCX kolony), gradient soli při ph~3 na slabám anexu (WAX) separační metody možno kombinovat ve 2D systémech buď on-line, nebo off-line 6

4 Kapilární elektroforéza chemicky modifikované kapiláry, kyselina octová v methanolu Aplikace: Characterizace glykosylovaných biofarmak Analýza celých proteinů 7 Běžné rozhraní používající sheath liquid - LODs mezi 30 and 100 nm sheathless CE-MS - LODs in the low-nm range Haselberg, R., Ratnayake, C. K., de Jong, G. J., Somsen, G. W., J. Chromatogr. A 2010, 1217, Fig. 3 BPE obtained with sheath-liquid CE MS of a mixture of insulin (1), carbonic anhydrase II (2), ribonuclease A (3) and lysozyme (4) (each 50 μg/ml) using the conventional ESI source and a sheath liquid of (A) 100 mm acetic acid (ph 3.1) and (B) isopro... Fig. 5 (A) BPE obtained with sheathless CE MS of a mixture of insulin (1), carbonic anhydrase II (2), ribonuclease A (3) and lysozyme (4) (each 5 μg/ml) using the nanoesi source. (B) Mass spectra obtained in the apices of peak 1 4. (C) Baseline signal and... 8

5 MS analýza Iontové zdroje pro peptidy a proteiny MALDI: tvoří se hlavně jednou (výjimečně 2-3 x) nabité ionty. Matrice: kyselina a-hydroxyskořicová, kyselina sinapová, kyselina 2,5- dihydroxybenzoová ESI, nanoesi: tvoří se vícenásobně nabité ionty, distribuce nábojových stavů závisí na ph Hmotostní analzátory pro peptidy a proteiny Jednoduché TOF (ve spojení s MALDI) Hybridní analyzátory (dnes častější) QTOF, LIT Orbitrap, IT FTICR Důležitá disociace 9 Disociace vyvolaná srážkou - CID CID (Collision Induced Dissociation) - metoda fragmentace iontů (MS/MS technika) založená na srážkách iontů s neutrálními částicemi (helium nebo argon). Po srážce dochází k rychlému převedení translační energie na energii vibrační a k její rychlé distribuci po všech kovalentních vazbách. Dochází ke štěpení nejslabších vazeb (zejména peptidových vazeb). Při CID fragmentaci peptidů vznikají zejména b a y ionty Modifikující funkční skupiny (posttranslačních modifikací) se většinou odštěpují a nelze je detekovat Nejběžnější typ fragmentace, na všech běžných typech přístrojů 10

6 Disociace vyvolaná srážkou - CID Vznik iontů série b a y při CID. Odštěpení modifikací při CID. 11 Disociace záchytem elektronu - ECD ECD (Electron Capture Dissociation) - metoda fragmentace iontů (MS/MS technika) založená na interakci vícenásobně nabitých iontů s nízkoenergetickými (termálními) elektrony v plynné fázi. Tvoří se ionty s lichým počtem elektronů, který díky přebytku energie fragmentují. [M + 3H] 3+ + e - [M + 3H] 2+ [M + 3H] 2+ [C+2H] 1+ + [Z+H] 1+ ion c ion z Při ECD fragmentaci peptidů vznikají zejména c a z ionty Nedochází ke štěpení modifikujících funkčních skupin (posttranslačních modifikací) Technicky lze uskutečnit pouze na FT ICR instrumentech 12

7 Disociace záchytem elektronu - ECD Vznik iontů série c a z při ECD. Při reakci se tvoří hypervalentní radikály RNH 3, které dále disociují. 13 Disociace záchytem elektronu - ECD 14

8 Disociace přenosem elektronu - ETD ETD (Electron Transfer Dissociation) - metoda fragmentace iontů (MS/MS technika) založená na interakci vícenásobně nabitých iontů s radikál-anionty s dostatečně nízkou elektronovou afinitou, které slouží jako donor elektronů. Mechanismus fragmentace je obdobou ECD. [M + 3H] 3+ + A - [M 3H] 2+ + A [M + 3H] 2+ [C+2H] 1+ + [Z+H] 1+ ion c ion z Při ETD fragmentaci peptidů vznikají zejména c a z ionty Nedochází ke štěpení modifikujících funkčních skupin (posttranslačních modifikací) Technicky lze uskutečnit na iontových pastech, Q-TOFu 15 Disociace přenosem elektronu - ETD ETD na lineární iontové pasti 16

9 Disociace přenosem elektronu - ETD ETD reagenty: fluoranthen anthracen azobenzen 2,2 -bichinolin 17 Multifotonová disociace infračerveným zářením - IRMPD IRMPD (InfraRed MultiPhoton Dissociation) - metoda fragmentace iontů (MS/MS technika) založená na interakci iontů s fotony infračerveného záření. Paprsek IR laseru vstupuje do prostoru ICR cely nebo iontové pasti. Ionty absorbují energii fotonů a jsou excitovány do vyšších vibračních stavů až dojde k fragmentaci vazeb, obdobně jako u CID. Spektra jsou podobná CID. -na pastech není omezení v nízkých hmotách (pod 1/3 m/z prekurzoru) -vyšší účinnost oproti CID, výhoda u fosfopeptidů CID IRMPD pro ICR, iontové pasti 18

10 Disociace za zdrojem - PSD PSD (Post Source Decay) - metoda založená na fragmentaci metastabilních iontů v driftovací trubici TOF analyzátorů s reflectronem. Během letu trubicí ionty prekurzoru fragmentují. Fragmenty mají stejnou rychlost jako prekurzor, ale různou kinetickou energii. V TOFu nemohou být rozlišeny (dopadají na detektor ve stejnou dobu), ale v reflektronu ano. Využívá se korelace mezi kinetickou energií fragmentů a jejich hmotností. 19 Identifikace proteinů pomocí MS 20

11 MS MSMS 1 MSMS 2 MSMS 3 FraTu ACN vz.3 Q : TOF MS ES+ BPI e Q : TOF MSMS ES BPI e ; Q : TOF MSMS ES BPI Q : TOF MSMS ES BPI ; Time % % % % FraTu ACN vz.3 Q (28.609) 1: TOF MS ES % FraTu ACN vz.3 Q (28.609) 1: TOF MS ES % MS m/z m/z % MS zoom in Smoothing and deisotoping ,721, FraTu ACN vz Q (28.750) 2: TOF MSMS ES MSMS m/z 21 Fragmentace iontů peptidů Při fragmentaci dochází ke štěpení vazeb mezi aminokyselinami a vznikají iontové série označované písmeny. Štěpení peptidové vazby v hlavním řetězci odpovídají ionty typu (série) b a y, štěpením za peptidovou vazbou vznikají ionty typu (série) c a z. Immoniové ionty usnadňují interpretaci přímá informace o aminokyselině v sekvenci 22

12 MSMS scoring function The comparison of theoretical and experimental MS/MS spectra is performed by scoring function and the score (ideally complemented by p value) is used to recognize the correct peptide from the database. Reliable peptide identification can be then considered for protein identification. FraTu ACN vz.3 Q (28.750) 2: TOF MSMS ES % Match of an experimental spectrum with a peptide sequence Intense peaks should match As many as possible peaks should match Series of contiguous matches m/z 23 MS/MS sekvenování V CID MS/MS spektrech se vyskytují série b a y iontů. Ionty v obou sériích se od sebe liší o zbytky (rezidua) aminokyselin. Součet b a y iontu mínus 1 dává molekulový adukt: b+y-1 = (M+H) + 24

13 MS/MS sekvenování 25 Pokrytí sekvence, spolehlivost identifikace Pokrytí sekvence část sekvence vyjádřená v procentech, která je podložena experimentálními daty (identifikovanými peptidy). Větší množství identifikovaných peptidů = vyšší spolehlivost identifikace proteinu. Pokrytí sekvence u bottomup maximálně 40-90%. 26

14 enzymatické štěpení proteinů Vhodný enzym štěpí specificky za malým počtem aminokyselin. Trypsin nejčastěji používaný, štěpí za Arg a Lys, poskytuje relativně krátké peptidy vhodné pro MS/MS. Bazické skupiny (kromě His) jsou na C-konci řetězce, což vede ke vzniku dobře interpretovatelných MS/MS spekter. Příklad: PPKAYEVRIVTKMVAVGICR PPK + AYEVR + IVTK + MVAVGICR Lys-C specificky štěpí za Lys, produkuje delší peptidy než trypsin, obtížnější interpretace MS/MS spekter (Arg uvnitř řetězců). Glu-C méně specifické štěpení v závislosti na ph za Glu nebo i za Asp, obtížnější interpretace MS/MS spekter (Arg, Lys uvnitř řetězců). Asp-N štěpí na N-konci Asp Chymotrypsin málo specifické štěpení za hydrofobními kyselinami, obtížnější interpretace MS/MS spekter (Arg, Lys uvnitř řetězců). 27 De novo sekvenování peptidů De novo sekvenování - způsob přímé interpretace MS/MS spekter peptidů. Hledají se ionty stejných sérií, které se vzájemně liší o zbytky aminokyselin. Ze spektra lze přímo odečíst sekvenci aminokyselin. Lze provádět ručně nebo za pomoci softwaru. výhodou je možnost identifikace peptidů a proteinů, které nejsou v databázích. 28

15 peptidové mapování Peptidové mapování (Peptide Mass Fingerprinting, PMF) - metoda identifikace proteinů založena na tom, že každý protein po specifickém štěpení poskytuje unikátní soubor peptidů. Protein se naštěpí na peptidy a změří se MS spektrum této směsi (nejčastěji MALDI, ale i ESI). Hmotnosti (m/z) iontů peptidů jsou pak srovnávány s teoretickými hodnotami vypočítanými z proteinových nebo DNA databází (štěpení in silico ). databáze Identifikace 29 Top-down analýza proteinů Top-down proteomika - Intaktní proteiny jsou ionizovány pomocí ESI (nanoesi) a zachyceny v ICR cele nebo iontové pasti spektrometru. Následuje fragmentace, nejčastěji metodou ECD nebo ETD. Vyžaduje instrument s velkou rozlišovací schopností. Middle-down proteomika proteiny jsou enzymaticky štěpeny na velké peptidy (5 20 kda), které jsou dále sekvenovány metodami top-down. 30

16 Databáze proteinových sekvencí Existuje celá řada databází, některé poskytují celou řadu doplňujících informací o proteinech. UniProt Knowledgebase kombinovaná databáze Swiss-Prot (anotovaná) proteinová sekvenční databáze s minimálními redundancemi) a TrEMBL (překlad nukleotidové sekvenční databáze EMBL). ExPASy Proteomics Server portál věnovaný analýze proteinů, nástroje pro MS, odkazy, 2D SDS PAGE. National Center for Biotechnology Information portál veřejně přístupných databází s molekulárně-biologickými informacemi a softwarovými nástroji pro analýzu dat Určení molekulové hmotnosti: MALDI Při MALDI ionizaci se proteiny nabíjí malým počtem nábojů, většinou jedním nebo dvěma. S vyjímkou analyzátorů s velmi vysokým rozlišením nelze pozorovat oddělené izotopické píky, ale jen jejich obalovou křivku. Měříme tak průměrnou hmotnost. 32

17 Vliv solí na spektra peptidů a proteinů Odsolení vzorku SPE na C18, C4 (ZipTip) MALDI spektrum vzorku peptidu s vysokou koncentrací solí Přítomnost solí ve vzorku se projeví tvorbou aduktů, nejčastěji s Na +, K +. Pokud analyt obsahuje kyselé funkční skupiny (karboxyl, fosfát apod.) může dojít k výměně kyselých protonů za tyto ionty. Spektra jsou komplikovaná, snižuje se odezva -> zasolené vzorky je nutno čistit (pro ESI bez HPLC, MALDI). 33 Určení molekulové hmotnosti: ESI a nanoesi Biomolekuly (proteiny, oligonukleotidy..) obsahují větší množství center (funkčních skupin), na kterých může dojít k ionizaci (protonizaci, kationizaci, deprotonizaci). V ESI a nanoesi spektrech poskytují tyto látky řadu píků, které odpovídají různým nábojovým stavům téže molekuly. 34

18 Určení molekulové hmotnosti: ESI a nanoesi = určení nábojového stavu (z) u některého iontu z lze určit z izotopického klastru ze vzdálenosti sousedních píků Molekula o hmotnosti M se nabije z-krát protonem, pík iontu ve spektru je na m z : M zh z m z tj. M z( m z H ) Pro dva sousední píky ve spektru (j,k) platí: M z j ( m j H ) ( z j 1)( m k H ) z j mk m k H m j z k m j H m m vzorce pro výpočet nábojového stavu dvou sousedních iontů ve spektru k j 35 Určení molekulové hmotnosti: počítačová dekonvoluce V praxi se využívá počítačových dekonvolučních algoritmů, které změřené ESI spektrum převedou na spektrum jednou nabitých iontů (tj. ve spektru po dekonvoluci je pouze ion [M+H] +. naměřené spektrum spektrum po dekonvoluci 36

19 Určení hmotnosti z ESI spektra - cvičení jed taipana (Oxyuranus) Jaká je mol. hmotnost peptidu? z j mk m k H m j z k m m j k H m j 37 Určení hmotnosti z ESI spektra - cvičení 38

20 De-novo sekvenování cvičení Jaká je sekvence peptidu?! součet reziduí v sérii = (M+H) + 39 De-novo sekvenování cvičení LGSEVYHNLK (M= ) 40

21 Nejen jeden protein Analýza proteinů ve směsi s ostatními 41 Proteomika Proteomika je vědní obor, který se zabývá studiem proteinů, jejich struktury a funkcí. Proteom zahrnuje všechny proteiny (včetně modifikovaných), které jsou součástí daného organismu nebo systému v daný časový úsek. Složení proteomu je dynamické a závislé na okamžitém stavu organismu. DNA genomika RNA transkriptomika proteiny proteomika metabolity metabolomika 42

22 Proteomická analytická výzva 1. Komplexita velké množství proteinů 2. Velký dynamický rozsah koncentrace proteinů V celém v séru, v tkáních, v buňce 43 Komplexita proteomu Příklad: člověk (Jensen O.N., Curr. Opin. Chem. Biol., 2004, 8, 33-41, PMID: ). 44

23 Referenční interval pro 70 proteinových analytů v plasmě. Anderson N L, and Anderson N G Mol Cell Proteomics 2002;1: Rozdíl 12 řádů 46

24 Používané separační a analytické metody v proteomice (2 D elektroforézanebo LC/MS/MS) mají dynamický rozsah Jak vyřešit? Aclaim PepMap 75 um x 150 mm C18, 3um, 100A

25 15 cm, 125 min 25 cm, 125 min 25 cm, 185 min 49 XIC Extracted Ion Chromatogram (0.05 Da) m/z m/z cm, 125 min cm, 125 min cm, 185 min šířka píku (50%) 50

26 Spectra Proteins Detected 15 cm, 125 min Distinct Peptides Spectra Identified % Total Spectra Spectra 25 cm, 125 min Proteins Detected Distinct Peptides Spectra % Total Identified Spectra Spectra 25 cm, 185 min Proteins Detected Distinct Spectra % Total Peptides Identified Spectra cm, 125 min, 5% DMSO Spectra Proteins Detected Distinct Spectra % Total Peptides Identified Spectra cm, 185 min, 5% DMSO Spectra Proteins Detected Distinct Spectra % Total Peptides Identified Spectra

27 Používané separační a analytické metody v proteomice (2 D elektroforézanebo LC/MS/MS) mají dynamický rozsah Jak vyřešit? Frakcionace vícedimensionální chromatografie Obohacení skupin analytů Afinitní chromatografie protilátky Chelatační chromatografie Phospho Lektiny glykoproteiny Jiné MS metody Selected Reaction Monitoring (metoda s největším dynamickým rozsahem 5řádů) 53