Predikce diabetu 1.typu a výsledky studie mapující buněč. ěčnou reaktivitu proti diabetogenním autoantigenům

Transkript

1 Predikce diabetu 1.typu a výsledky studie mapující buněč ěčnou reaktivitu proti diabetogenním autoantigenům

2 Úvod Etiopatogeneticky je zásadní role při vzniku diabetu 1.typu (T1D) připisována autoreaktivním T lymfocytům (polarizace ve směru Th1).

3 Úvod - pokračov ování prediabetes záchyt protilátek manifestace diabetu CYTOKINY T-lymf Makrofágy, Tc B-lymf ICA, GAD65A, IAA, IA2A t CYTOKINY β buňka β buňka

4 Standardizovaná incidence diabetu 1.typu pro děti ve věku 0-14 let (/ /rok) připraveno podle Cinek O., Šumník Z. a Vavřinec J.Dětský diabetes mellitus v České republice: stále více a čím dál dříve.čas.lék.čes., 2005, 144, pp

5 Co dělat? d Vyléčit neumíme, léčit umíme, ALE Zabránit vzniku neumíme, ALE nicméně v každém případě musí být opatření cílená na prevenci realizována nejpozději ve fázi prediabetu proto také predikce

6 Program predikce diabetu 1.typu Určení (ne)přítomnosti rizikových alel diabetogenních genů (HLA molekuly II.třídy), cca 40%genetické vnímavosti k T1D určení celoživotního rizika pro vznik T1D Protilátky proti GAD65, IA2 určení středně-krátkodobého rizika pro vznik T1D

7 Kategorie genetického rizika DM 1 u prvostupňových ových příbuzných p českých diabetických dětíd 11% 11% 21% 35% 22% Velmi vysoké Zvýšené Průměrné Snížené Velmi nízké Cinek O.

8 3 Ab n = Abs n = Abs n = Verge et al. Diabetes, 1996;45;926 Progression to Diabetes vs Number of Autoantibodies (GAD, ICA512, Insulin) Percent not Diabetic Abs 2 Abs 1 Ab ,5 5 7, ,5 15 Years of Follow-up

9 Co ale ty T lymfocyty?

10 Problém detekce autoreaktivních lymfocytů četnost autoreaktivních T-lymfocytů v periferní krvi buněk / 1 mil

11 The Immunology of Diabetes Society

12 Název projektu: DETEKCE ANTI-INZULÁRNÍ T BUNĚČNÉ ODPOVĚDI U PACIENTŮ S DIABETEM 1.TYPU A U JEJICH PRVOSTUPŇOVÝCH PŘÍBUZNÝCH Číslo projektu: NR Doba řešení: Poskytovatel: IGA MZ ČR Hlavní řešitel: MUDr.Kateřina Štechová, PhD., Laboratoř autoimunitních onemocnění Pediatrické kliniky UK 2.LF, Praha Spoluřešitel: Doc.MUDr.František Saudek, DrSc., Klinika diabetologie Centra diabetologie IKEM, Praha

13 Anotované cíle projektu Hlavní cíl: Zavést a standardizovat laboratorní metodu umožňující sledovat přítomnost a intenzitu T buněčné odpovědi zaměřené proti nejdůležitějším známým diabetogenním autoantigenům. Cílem bylo zlepšení diagnostiky osob potenciálně ohrožených vznikem diabetu (z okruhu prvostupňových příbuzných pacientů) a zlepšení sledování efektu imunointervenčních postupů. Vedlejší cíl: Ověřit, zda by popsaná metoda byla využitelná i v dalších aplikacích: Sledování průběhu (stavu T buněčné imunity) po transplantaci pankreatu (včetně event. transplantace ostrůvků) V diagnostice autoimunitního procesu u dospělých pacientů s diabetem 1.typu (LADA diabetes) Hypotéza: cytokinová diagnostika umožní zachytit patologickou Th1 odpověď vůči diabetogenním autoantigenům (IFN-gamma x IL-4)

14 2003 Proliferační test aktivace T lymfocytů intracelulární stanovení cytokinů + stanovení povrchových markerů T lymfocytů FACS stanovení aktivačních markerů tetramerová analýza ELISPOT, ELISA

15 Uspořádání studie Čerstvě izol. PBMNC + autoantigeny Klin.a anamn.data Reakce? Typ a intenzita. Autoprotilátky, C peptid, HLA typ. Inkubace a pak protein microarray analýza cytokinů z kult.supernatantu (+ ELISPOT a ELISA)

16 (Auto)antigeny GAD 65 GAD a.a IA-2/R2 a.a Proinsulin, B ř. a.a.9-23 (Hsp277 a.a ) PHA jako pozitivní kontrola IDS

17 Také ELISPOT +IL-4 Také ELISA Pos Pos Neg Neg GCSF GM-CSF GRO GRO -alfa Pos Pos Neg Neg GCSF GM-CSF GRO GRO -alfa IL-1alfa IL-2 IL-3 IL-5 IL-6 IL-7 IL-8 IL-10 IL-1alfa IL-2 IL-3 IL-5 IL-6 IL-7 IL-8 IL-10 IL-13 IL-15 IFN-gamma MCP-1 MCP-2 MCP-3 MIG RANTES IL-13 IL-15 IFN-gamma MCP-1 MCP-2 MCP-3 MIG RANTES TGF-beta1 TNF-alfa TNF-beta blank blank blank blank Pos TGF-beta1 TNF-alfa TNF-beta blank blank blank blank Pos

18 Soubor Skupina recentní záchyt diabetu Plánovaný počet vyšetření na celou dobu řešení projektu Počet osob, které vstoupily do projektu Příbuzní (rodiče 116, sourozenci 91) zdravé kontroly transplantovaní Finálně statisticky hodnocení 60 bez autoprotil. +10 s protilátkami

19 Vstupní kritéria ria žádné další přidružené autoimunitní choroby (kromě diabetu) nebo imunopatie náběr mezi 8. a 9. hodinou ráno nepřítomnost jakýchkoliv známek infekčního onemocnění nepřítomnost větší fyzické zátěže 24h před odběrem krve vpřípadě pacientů s čerstvou manifestací diabetu byl náběr proveden 7 dní od stanovení diagnózy za předpokladu normalizace parametrů vnitřního prostředí (ionty, parametry acidobazické rovnováhy) a za předpokladu, že klinik nehodnotil diabetickou ketoacidózu při záchytu choroby jako těžkou (ph 7,1). U pacientů s diabetem byl náběr proveden při glykémii v rozmezí 4-10 mmol/l.

20 Statistická analýza Jelikož data nevykazovala normální rozložení, byly pro analýzu užity neparametrické metody. V rámci statistického vyhodnocení bylo v první fázi byla ověřována hypotéza, zda existuje vliv příslušnosti vyšetřované osoby k určité skupiny na produkci cytokinů a chemokinů vorganismu. Hodnocení bylo provedeno Kruskal Wallisovým testem. Hladina významnosti byla zvolena α=0,05. Pokud byla nalezen statisticky významný rozdíl mezi všemi čtyřmi skupinami, bylo přistoupeno k mnohonásobnému porovnání (jednotlivé skupiny mezi sebou). Mnohonásobné porovnání bylo provedeno Mann Whitney U testem s následnou korekcí hladiny významnosti za signifikantní byly považovány hodnoty p<0,05/6, tj. p<0,0083. Pro proměnné, které statisticky významně odlišují porovnávané skupiny, bylo snahou nalézt také hladinu, na které jsou skupiny nejlépe odlišeny. Pro nalezení takového bodu byly použity ROC křivky.

21 Výsledky Produkce cytokinů a chemokinů se mezi sledovanými skupinami lišila a to jak bazální tak i po specifické stimulaci. Naprosto se svými výsledky vydělila skupina prvostupňových příbuzných s pozitivní alespoň jednou autoprotilátkou, tedy skupina, kterou je z hlediska brzkého vzniku diabetu 1.typu riziková.

22 DRL+vs DV Cytokin (chemokin) Mann- Whitney U test (exact p-hodnota) Sensitivita Specificita Plocha pod křivkou P-hodnota pro ROC křivku GCSF p=0,001 0,833 1,0 0,944 p=0,006 GM-CSF p=0,001 0,889 0,75 0,8958 p=0,015 IL-1 alfa p=0,003 0,833 1,0 0,9583 p=0,005 IL-2 p=0,003 0,61 1,0 0,8958 p=0,015 IL-3 p<0,001 0,889 1,0 0,972 p=0,004 IL-5 p<0,001 0,778 1,0 0,9514 p=0,006 IL-7 p=0,002 0,833 0,75 0,8819 p=0,019 IL-13 p<0,001 0,944 1,0 0,972 p=0,004 MIG p=0,001 0,833 0,75 0,889 p=0,017 TGF beta p=0,003 0,667 1,0 0,8403 p=0,037 TNF alfa p<0,001 0,889 1,0 0,9514 p=0,006

23 ROC křivka pro IL-5 DV vs DRL+ ROC křivka pro IL-13 DV vs DRL+

24 %intenzity IL-5 a IL-13 %intenzity p=0,002 p<0,001 p=0,002 p<0,001 (oba) p=0,001

25 IL-5 a IL-13 korelace D DV DRL DRL (HR) IL-5 IL-3 (r=0,883), IL-2 (r=0,834) a IL-6 (r=0,803) IL-1alpha (r=0,880) IL-10 (r=0,879), MCP-1 (r=0,846), TNF-alpha (r=0,823) IL-8 (r=0,941) IL-13 IL-1alpha (r=0,931), TNF-beta (r=0,873) a IL-7 (r= 0,846)

26 IFN-gamma P=0,006 P=0,003 %intenzity spotu P=0,006

27 Změna reaktivity po specifické stimulaci jednotlivými autoantigeny Po stimulaci směsí diabetogenních autoantigenů byly zjištěny následující statisticky signifikantní rozdíly (pozn.byl použit Wilcoxonův párový neparametrický test, kdy za signifikantní je považováno p<0,05: u pacientů s diabetem byl významný pokles v produkci IL-3 (p=0,008) a IL-15 (p=0,038). U příbuzných bez protilátek byl signifikantní pokles IL-1 (p=0,013) a MCP-2 (p=0,045). U příbuzných s protilátkami byl pozorován signifikantní nárůst produkce IL-6 (p=0,043). Ve skupině zdravých kontrol nebyly pozorovány statisticky signifikantní rozdíly mezi bazální produkcí a produkcí po stimulaci autoantigeny.

28 Odpověď na stimulaci jednotlivými autoantigeny uváděny průměrné hodnoty pro TNF-beta v pg/ml Skupina NK GAD65-1 GAD65-2 GAD65-3 GAD65 IA2 peptid PI peptid Směs D auto ag DV DRL DRL HR

29 Rozdílná reaktivita proti jednotlivým autoantigenům u příbuzného s pozitivními autoprotilátkami stanovená metodou ELISA IFN gamma (pg/ml) TNF beta (pg/ml) IL4 (pg/ml) IL6 (pg/ml) IL10 (pg/ml) bazální produkce produkce stimulovaná směsí autoantigenů GAD65-1 GAD65-2 GAD65-3 Celá molekula GAD65 proinzulín tyrozinfosfatáza IA HIGH HIGH 53

30

31 Srovnání jednotlivých metod cytokinové a chemokinové detekce Proteinová micrroarray ELISPOT ELISA Největší přednost(i) Simultánní detekce mnoha parametrů, ideální screeningová metoda Detekce na úrovni jedné buňky Kvantitativní výsledek v konkrétní koncentraci Největší zápor(y) Proveditelnost Dostupnost kitů (v ČR) U některých látek vyšší detekční limit, metoda není kvantitativní Pracnost, každý cytokin nutno analyzovat zvlášť (s duálními kity nakonec nebyla dobrá zkušenost) Každý cytokin nutno analyzovat zvlášť Není obtížná, Pro záznam výsledku nutný scanner nebo digitální fotoaparát a program analýzy obrazu. Z uvedených metod subjektivně nejpracnější, poněkud problémy s analýzou (nutný alespoň nějaký program analýzy obrazu, ideálně ELISPOT reader, ale je drahý) Není obtížná, nutný ELISA reader, ten je ale většinou běžně dostupný Dobrá, spektrum nabízejících firem je ale úzké Špatná, ale dobrá vrámci EU Široká nabídka od mnoha firem

32 Další výstupy projektu Reaktivita PBMC na polyklonální aktivátor (PHA) Vliv dalších faktorů na produkci cytokinů a chemokinů posuzovaný pomocí proteinové microarray Pohlaví Genetické riziko Věk Pozitivita autoprotilátek, C peptid, FPIR Denní doba (Ráno vs odpoledne) Pohybová zátěž Vliv stavu metabolismu a glykémie na výsledek Reaktivita čerstvě izolovaných PBMC vs kryoprezervovaných Změna reaktivity v čase Transplantovaní

33 Děkuji za pozornost