Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně. Agronomická fakulta DIPLOMOVÁ PRÁCE

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO 2009 MICHAL ROHRER

2 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Využití molekulárních markerů pro studium genetické variability u rostlin Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Pavel Hanáček, Ph.D. Vypracoval: Michal Rohrer Brno 2009

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Využití molekulárních markerů pro studium genetické variability u rostlin vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. dne: podpis diplomanta:

4 PODĚKOVÁNÍ Rád bych poděkoval svému školiteli Ing. Pavlu Hanáčkovi, Ph.D.za vedení práce, trpělivost a za ochotu mi vždy cokoli vysvětlit a s čímkoli pomoci. Dále bych chtěl poděkovat Ing. Heleně Stavělíkové Ph.D. za vypěstování a morfologický popis rostlin a Mgr. Bc. Jaroslavě Cieslarové za pomoc se zpracováním rostlinného materiálu.

5 ABSTRAKT Práce je zaměřená na testování genetické variability 41 genotypů vybraných v kolekci genových zdrojů papriky (Capsicum annuum L.) pomocí 8 mikrosatelitínch markerů. Tři z mikrosatelitních markerů (Hpms 1-1, Hpms a Hpms 1-274) poskytovaly uniformní spektrum u všech analyzovaných genotypů papriky. U ostatních mikrosatelitních markerů bylo nalezeno od 2 do 8 alel. Celkem bylo detekováno 28 alel, což je v průměru 3,5 alely na lokus. Velikost amplifikovaných produktů byla v rozsahu párů bazí. Nejvíce alel bylo zjištěno pomocí primerů Hpms 1-5 (8 alel) a Hpms 2-21 (7 alel). Dle statistického vyhodnocení byl sestaven dendrogram podobnosti. Z rozdělení analyzovaných položek v dendrogramu je patrná vysoká míra podobnosti u některých genotypů a naopak je předpoklad, že u některých položek se stejnými nebo podobnými názvy se jedná o geneticky odlišné materiály. Molekulární data byla doplněna morfologickým popisem pro rod Capsicum. Tyto výsledky ukazují na možnost duplicity v aktuální kolekci genových zdrojů papriky. Klíčová slova: paprika, genetické zdroje, mikrosatelity SSRs, variabilita

6 ABSTRACT Within a collection of 41 genetic resources of red pepper genotypes (Capsicum annuum L.) genetic variability using 8 microsatellite markers was tested. Three of the microsatellite markers (Hpms 1-1, Hpms 1-168, and Hpms 1-274) provided uniform spectra in all analyzed genotypes. From 2 to 8 alleles were detected for the rest of microsatellite loci. Totally 28 alleles were detected, which means an average of 3.5 allele per one microsatellite locus. The size of amplified products was determined within the limits of base pairs. The highest number of different alleles was detected using Hpms 1-5 (8 alleles) and Hpms 2-21 primers (7 alleles). Based on statistical evaluation a dendrogram of similarity was constructed. Distribution of the analyzed genotypes in the dendrogram implies a high level of similarity within some genotypes and on the contrary there is a presumption of genetically different material within other genotypes of the same or similar name. Molecular data were complement with morphological measurement by descriptor lists for genus Capsicum. These results show the possibility of duplicities in the current collection of genetic resources of red pepper. Key words: pepper, genetic resources, microsatellites. SSRs, variability

7 Obsah 1 ÚVOD CÍL PRÁCE SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY MOLEKULÁRNÍ (DNA) MARKERY Polymorfizmus DNA Bodový polymorfizmus Repetitivní sekvence Typy DNA markerů Jednokopiové a vícekopiové sondy RFLP SSCP Mnohokopiové sondy SSR VNTR RAPD, AP-PCR, DAF DGGE SCAR AFLP CAPS Využití molekulárních markerů při studiu rostlinných geonomů a ve šlechtitelství Tvorba genetických map a selekce rostlin určitých genotypů Otisk DNA (fingerprint), identifikace odrůd Identifikace rostlinných patogenů Stanovení evolučních a fylogenetických vztahů BIOLOGICKÁ DIVERZITA Biologická diverzita, její uchování a využití Národní program konzervace a využití genofondu rostlin Česká genová banka kulturních rostlin Shromažďování genetických zdrojů Hodnocení genetických zdrojů... 30

8 Dlouhodobé uchování genetických zdrojů Typy kolekcí Genová centra MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ POUŽITÝ MATERIÁL Rostlinný materiál Ostatní materiál METODY ZPRACOVÁNÍ Výsadba a odběr vzorků Izolace DNA Agarózová elektroforéza Zkouška primerů PCR analýza Agarózová elektroforéza PCR produktů Analýza PCR produktů VÝSLEDKY A DISKUSE IZOLACE DNA PCR REAKCE KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA VYHODNOCENÍ ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM OBRÁZKŮ A TABULEK... 58

9 1 ÚVOD Genové zdroje rostlin jsou nenahraditelné a rozhodující nejen pro šlechtění zemědělských plodin, ale i pro zachování a rozšíření druhové a odrůdové diverzity v zemědělství, tvorbu krajiny a omezování negativních vlivů zemědělství na životní prostředí. Tyto genové zdroje jsou shromažďovány a uchovávány v genových bankách. V současné době je takto uchováno až 7 miliónů položek. Z toho asi semenných položek je shromážděno na 14 pracovištích v České republice. Tak velký počet uchovávaných vzorků vede k problémům při charakterizaci a udržování jednotlivých položek. Z těchto důvodů byl v 80. letech minulého století zaveden koncept core kolekcí, tj. menších souborů, zachovávajících na základě podrobného genetického, morfologického a agronomického popisu co největší genetické spektrum výchozí kolekce (Brown, 1989). Při sběru vzorků z různých zdrojů se může stát, že se do kolekce zařadí i již uchovávané vzorky, které jsou evidovány pod jiným číslem EVIGEZ (Český informační systém genových zdrojů). Tyto duplicitní položky zvyšují náročnost konzervace, zabírají místo vhodnějším vzorkům a protože je evidováno velké množství vzorků s nižší genetickou variabilitou, zvyšuje se genetická eroze. Genetická eroze ve svém důsledku vede ke snižování šlechtitelského pokroku a výrazně omezuje možnost reakce na požadavky pěstitelů a spotřebitelů. Ochrana a uchování genetické diverzity je základním kamenem trvale udržitelného a konkurenceschopného zemědělství. Na základě morfologického hodnocení nelze mnohdy přesně rozlišit, které vzorky jsou duplicitní. Fenotyp je ovlivněn vnějšími podmínkami a závisí na individuálním posouzení. Proto se v dnešní době pro studium genetické diverzity a variability čím dál více využívají biochemické a molekulární (DNA) markery. Vzhledem k vysokému stupni polymorfizmu a kodominantnímu charakteru dědičnosti se v rámci DNA markerů velmi dobře uplatňují mikrosatelitní markery (SSRs Simple Sequence Repeats). Využití detekce polymorfizmu mikrosatelitů pro studium genetické diverzity a variability bylo popsáno u řady rostlinných druhů mnoha autory, např. u hrachu (Haghnazari a kol., 2005), řepky (Li a kol., 2007) aj. 9

10 1.1 Cíl práce Cílem práce bylo zavést metodu pro detekci genetické variability v kolekci genových zdrojů papriky roční (Capsicum annuum L.) pocházejících z Výzkumného ústavu rostlinné výroby (VÚRV) a prověřit 41 genotypů paprik, u kterých byl předpoklad duplicity. 10

11 2 Současný stav řešené problematiky V současné době se v zemědělství, medicíně a jiných oborech čím dál více využívají bílkovinné a molekulární markery. V této kapitole se zaměřím na Molekulární (DNA) markery a jejich využití v analýze genomové variability. 2.1 Molekulární (DNA) markery Základními pomůckami používané ke studiu genetické diverzity v a mezi populacemi jsou genetické markery. Markery umožňují určovat, které alely jsou přítomné v populaci. Jejich využití lze charakterizovat: studování rozmnožovacích systémů (určit stupeň inbreedingu v populaci) měření toku genů a strukturu populace (určit stupeň migrace mezi populacemi) určení paternity k měření dědičnosti a fitness tvorba genetických map k hledání genů determinujících kvantitativní vlastnosti (např. kolik lokusů podmiňuje velikost těla, a podobně) uplatnění v konzervační genetice, ekologické a evoluční genetice, nebo ve šlechtění ( Polymorfizmus DNA Každá genetická variabilita má svůj podklad ve variabilitě DNA. To platí pro každou variabilitu detekovanou na fenotypové úrovni, tedy i pro biochemický, imunologický a morfologický polymorfizmus, pro bodové, chromozomální i geonomové mutace. Ve fenotypu se však projeví jen malá část variability DNA. Tato skutečnost je způsobena zejména tím, že exony kódujících genů eukaryotních organizmů tvoří zpravidla jen menší část, řádově několik procent genomové DNA, zbytek připadá na nekódující sekvence (introny, spacery). Fenotypově se však neprojeví i taková změna exonu, která z důvodu degenerace genetického kódu nevede ke změně aminokyseliny. Na úrovni DNA tedy existuje velké množství polymorfismů, jejichž detekce je možná jen metodami molekulární genetiky. 11

12 Bodový polymorfizmus Tento typ je způsoben polymorfismem (změnou v sekvenci bazí) v určitém místě DNA. Odhaduje se, že u eukaryot je polymorfní přibližně každý 500. nukleotid v kódujících sekvencích DNA a každý 50. v nekódujících sekvencích DNA. Mitochondriální DNA je cca 5 10 x častěji polymorfní než jaderná DNA. Definované polymorfní místo se chová jako mendelisticky děděný gen s kodominantní dědičností, jednotlivé varianty se vyskytují v určité frekvenci, která se může v různých populacích lišit. Příčinou bodového polymorfizmu je bodová mutace, většinou záměna nukleotidu (substituce) nebo dalece několika bazí Repetitivní sekvence V DNA se vyskytují sekvence jednotkové a repetitivní. Jednotkové jsou v geonomu přítomny v jedné nebo v několika málo kopiích. Patří sem geny, okrajové sekvence a spacery. Jako repetitivní se označují sekvence, které se v geonomové DNA vyskytují v mnoha kopiích. Za středně repetitivní se považují ty, které mají do 105 kopií, za vysoce repetitivní s počtem kopií nad 105. Rozlišujeme tandemové a rozptýlené repetice. Narozdíl od rozptýlených repetic, které se vyskytují po celém genomu, jsou tandemové repetice uspořádány za sebou. V posledních letech je intenzivně sledován a využíván výskyt satelitů. Satelitní DNA obecně je označení pro výskyt mnoha relativně krátkých sekvencí v genomu ve formě tandemových repetic, tzn. za sebou se opakujících nukleotidových motivů DNA. Podle své délky se rozdělují na: maxisatelity celková délka repetitivní DNA je nad 5 x 105 párů bazí. Na chromosomu jsou často lokalizovány v blízkosti centromery. minisatelity krátké hypervariabilní sekvence DNA, uspořádané rovněž jako tandemové repetice. Jsou tvořeny sekvencemi párů bazí. mikrosatelity jsou tvořeny 2 6 bázemi. Za příčinu vzniku polymorfizmu mikrosatelitních lokusů je pokládán nehomologický crossing-ower. Pokrok v oblasti biochemie a molekulární biologie umožnil aplikaci markerů založených na polymorfizmu DNA. Použití molekulárních markerů významně doplňuje různé klasické metody genetické analýzy. Molekulární markery jsou molekuly, které 12

13 identifikují přítomnost určitého genu a jím podmíněného znaku ve studovaném genotypu. DNA markery jsou založeny na polymorfizmu, tedy variabilitě v sekvencích DNA. Společným znakem DNA markerů je přímá schopnost detekce alelických variant v sekvenci nukleotidů. Jako DNA markery mohou být využity jen ty sekvence, které mají následující vlastnosti: vysoký polymorfizmus nejlépe kodominantní charakter dědičnosti častý výskyt v geonomu nezávislost na podmínkách prostředí snadné a rychlé testování vysoká reprodukovatelnost Charakteristiku DNA markerů lze shrnout do následujících bodů: jsou aplikovatelné u všech organismů, kde je zvládnutá technika izolace DNA nejsou závislé na podmínkách prostředí jejich počet je téměř neomezený DNA markery lze aplikovat i při minimálním množství biologického materiálu, jsou nedestruktivní pomocí DNA markerů lze charakterizovat i velmi raná ontogenetická stádia rostlin Princip DNA markerů je založen na: specifickém restrikčním štěpení analyzované DNA a následné hybridizaci se značenou sondou amplifikaci specifických fragmentů v in vitro podmínkách na různých kombinacích restrikčního štěpení Typy DNA markerů Podle cíle studia je třeba zvolit nejvhodnější typ markeru. Z hlediska použité metody se markery dělí na: Markery založené na hybridizaci DNA. DNA profily se vizualizují prostřednictvím hybridizace fragmentů DNA, štěpeného restrikčním enzymem, 13

14 se značenou sondou (Obr. 1). DNA sonda je fragment známého původu a sekvence. Markery založené na polymerázové řetězové reakci PCR (Polymerace Chin Reaction). Jsou to markery založené na in vitro amplifikaci určitých sekvencí DNA nebo lokusů prostřednictvím specifických i nespecifických primerů (nukleotidových sekvencí) za účasti termostabilního enzymu DNA polymerázy (Obr. 2). Amplifikované fragmenty se separují elektroforeticky a spektra jsou detekována po obarvení (např. ethidiumbromidem) nebo autoradiograficky 1 (Bednář a Vyhnánek, 2004). Obr. 1: Hybridizace 1 1 Autoradiografie je technika spočívající ve vystavení rentgenového filmu účinku radioaktivních částic. Používá se k určení distribuce radioaktivity v gelu, chromatogramu nebo tenkém řezu buňky ( 14

15 Obr. 2: Polymerázová řetězová reakce PCR Jednokopiové a vícekopiové sondy RFLP RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) markery jsou založeny na změnách v sekvencích DNA, ke kterým docházelo během evoluce. Tyto změny způsobují bodové mutace v místech štěpení restrikčními enzymy, inzerce nebo dalece, mohou být důsledkem nerovnoměrného crossing-overu v rámci určitého chromozomu (Řepková a Relichová, 2001). Analýza využívá délkového polymorfizmu restrikčních fragmentů analyzované DNA, který je detekován pomocí hybridizace s homologním fragmentem DNA sondou. Jednotlivé dílčí procesy techniky RFLP: izolace DNA restrikční štěpení elektroforetická separace získaných DNA fragmentů přenos rozdělených fragmentů z gelu na pevný nosič a jejich denaturace (Southern blotting) 15

16 hybridizace se značenou sondou detekce hybridní DNA (Bednář a Vyhnánek, 2004) RFLP markery byly u rostlin poprvé využity ke konstrukci genetických map. Jsou to kodominantní markery, které umožňují určit, zda je vázaný znak přítomen u určitého jedince v homozygotním nebo heterozygotním stavu. Nevýhodou je vysoká výchozí koncentrace DNA potřebná pro restrikční štěpení a Southernovou hybridizaci. Také radioaktivní značení sondy přináší určitá rizika. Byla však již vypracována řada neradioaktivních metod značení sondy. Analýza je časově dosti náročná a pracná a jen několik markerů má polymorfní charakter, což je nevýhodné především u blízce příbuzných druhů SSCP SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) je vhodná metoda pro analýzu genů zvláště při detekci bodových mutací a zjišťování DNA polymorfizmu. Je možné identifikovat heterozygotnost fragmentů DNA o stejné molekulové hmotnosti. Dále metoda SSCP umožňuje detekovat změny v několika nukleotidech, protože elektroforetická mobilita 2 jednořetězcové DNA se mění se změnou jeho obsahu GC bazí vlivem konformačních změn (Řepková a Relichová, 2001). Elektroforéza se provádí na polyakrylamidovém gelu. Pro optimální výsledky by měli být velikosti fragmentů v rozmezí bp. Počet detekovatelných mutací klesá s velikostí fragmentů. Citlivost je také závislá na koncentraci glycerolu v polyakrylamydovém gelu (Balogh a kol., 2004). SSCP je poměrně rychlá a jednoduchá metoda (Hestekin a Barron, 2006) Mnohokopiové sondy Biologická diverzita (Biodiverzita) zahrnuje celkovou proměnlivost živích organismů a ekosystémů. V této kapitole nastíním význam biodiverzity v zemědělství a ekologii. 2 Každá volná elektricky nabitá částice se v elektrickém poli pohybuje ve směru daném jeho nábojem a orientaci el. pole. Rychlost tohoto pohybu je závislá na náboji částice a na odporu prostředí ( 16

17 SSR SSR (Simple Sequence Repeats). Jako molekulární markery jsou použity sekvence mikrosatelitů. Při markerování nejsou detekovány konkrétní geny, ale opakující se motivy, které vykazují těsnou vazbu s konkrétními geny. Motivy nukleotidů, které se opakují x jsou označovány jako minisatelity. Pro detekci minisatelity při fingerprinringu je obvykle využívána digesce (rozpouštění za vyšší teploty) geonomové DNA a hybridizace se značenou sondou. Tandemové repetice 1 5 nukleotidů v počtu opakování 10 60x (GA)n, (A)n, (CAG)n, aj. jsou označovány jako mikrosatelity. Obvykle se takto polymorfní místa vyskytují v nekódujících oblastech, protože by měnily čtecí rámec odpovídajícího bílkovinného produktu (Bednář a Vyhnánek, 2004). Během posledních desetiletí se mikrosatelity staly nejrozšířenějším zdrojem genetických markerů. V dnešní době je dostupné velké množství dat sekvencí ze sekvenovaných eukaryotických organismů což urychlilo výzkum zaměřený na pochopení původu a funkce mikrosatelitů a hledání nových aplikaci použití (Sharma a kol., 2007). Mikrosatelitní markery se vyznačují následujícími vlastnostmi: vysoký stupeň polymorfizmu jsou relativně rovnoměrně zastoupeny po celém geonomu jsou kodominantní jsou založeny na PCR vyžadují minimální množství analyzované DNA (Bednář a Vyhnánek, 2004) Mikrosatelity jsou všudypřítomné. Nachází se v prokaryotech eukariotech i v nejmenších bakteriálních genomech (Gur-Arie a kol., 2000). Existence mikrosatelitů v eukariotickém genomu je známa již od 70. let 20. století (Bruford a kol., 1996). Velký počet a široký výskyt těchto sekvencí se vyskytuje u rozmanitého spektra organismů, od kvasinek až po obratlovce (Hamada a kol., 1982). Mutace mikrosatelitních markerů jsou většinou neutrální (ani výhodné, ani nevýhodné). To znamená že muže dojit k akumulaci mnoha mikrosatelitních mutaci v populaci. Výsledkem je přítomnost několika alel lišících se počtem opakování pro daný mikrosatelit i v lidské populaci. To dělá z mikrosatelitů užitečné genetické markery, neboť délka repetice může být snadno zjišťována pomocí amplifikace 17

18 metodou PCR, s oligonukleotidovými primery umístěnými v unikátní sekvenci obklopující repetici, a porovnání délky amplifikovaných fragmentů gelovou elektroforézou. Vyšetření založené na mikrosatelitech je relativně jednoduché a levné, a proto se široce využívá ve vazebných, asociačních a populačních studiích, pro DNA diagnostiku i pro forenzní účely. Výhodou mikrosatelitních markerů je vysoká míra informativnosti v rodokmenech. V rodokmenu je marker neinformativní tehdy, pokud je jeden rodič homozygotem, nebo pro ½ potomků, pokud jsou oba rodiče heterozygoti pro stejnou kombinaci alel. Pro pravděpodobnost, že je marker informativní, tedy platí: Budiž p(i) frekvence alely i v populaci, p(i)2 je pravděpodobnost, že je 1 rodič homozygot pro alelu i, 4p(i)2p(j)2 je pravděpodobnost, že oba rodiče budou heterozygoti pro alelu i a j. Potom se míra informativnosti daného polymorfizmu (polymorphism information content, PIC) bude rovnat: PIC = 1 n 2 pi i= 1 i= 1 j= i+ 1 Hlavní nevýhoda mikrosatelitů je omezená možnost paralelního vyšetření více markerů v jedné zkumavce (multiplexování). Nejvíce užívaný multiplex je DNA vyšetření pro forenzní účely, které obsahuje standardně 13 mikrosatelitních markerů (databáze CODIS na FBI). Multiplexní zpracování je možné díky použití 4 různých fluorescenčních barviv na značení primerů pro PCR a různé délce amplifikovaných fragmentů se stejnou barvou (různé alely mikrosatelitního markeru se obvykle liší jen o délku 1 nebo několika repetic, je tedy možné např. pro tetranukleotidovou repetici o 12 alelách navrhnout délku amplifikovaného fragmentu PCR na bp a pro druhou podobnou repetici atd., aby nedocházelo k překryvu ( Použití fluorescenčně značených primerů a laserové detekce značně zlepší účinek a automatizaci, ale použití fluorescenčně značených primerů je značně nákladné (Agarwal, a kol., 2008). Většina mikrosatelitů (30 67 %) jsou dinukleotidy. V genomu obratlovců se nejčastěji vyskytuje motiv (AC)n. Je 2,3-krát častější než (AT)n, druhý nejčastější typ dinukleotidů. Ostatní typy (tri-, tetra-, penta-, hexa-nukleotidy) jsou asi 1,5-krát méně časté v genomu obratlovců než dinukleotidy (Toth a kol., 2000). V lidském genomu se nachází mikrosatelit zhruba každých 6kb a CA repetice každých 30kb DNA (Beckmann a Weber, 1992). n n 2 p 2 i p 2 j 18

19 Mikrosatelity lze nalézt kdekoli v genomu a to jak v kódující tak i v nekódující sekvenci DNA (Toth a kol., 2000). V kódující sekvenci DNA jsou ale poměrně vzácné. U vyšších rostlin je to 7 10 % z celkového počtu mikrosatelitů (Wang a kol., 1994). Poměrně nízká frekvence mikrosatelitů v kódující oblasti DNA by se dala vysvětlit negativní selekcí při porušením čtecího rámce (Metzgar a kol., 2000). Klíčovou vlastností mikrosatelitů je jejich vysoká mutační rychlost a tím i jejich vysoký polymorfizmus v rámci druhu a populaci. Rychlost mutací je odhadována na na lokus za generaci (Ellegren, 2000), což je o několik řádů větší, než mutační rychlost nerepetitivní DNA 10-9 (Li, 1997). Díky jejich extrémní variabilitě (polymorfismu) a relativně snadné detekci, jsou považovány za jedny z nejvhodnějších genetických markerů. Mikrosatelity velmi rychle nahrazují metody spočívající na RFLP a RAPD ve většině aplikací v populační biologii, od identifikování příbuzných jedinců, až po odvozování demografických parametrů. Mikrosatelitní mapy jsou nyní dostupné téměř u všech organismů genetického a ekonomického zájmu, od člověka, myši, skotu, prasete, ovci, slepici, drozofilu, až po rajče, sóju, rýži a mnoho dalších ( Některé mutace mikrosatelitů mohou být škodlivé. Nejméně 20 různých neurologických poruch je způsobeno rozšířením SSRs. Příkladem je Huntingtonova choroba, která je způsobena zvětšením počtu kopií tripletu CAG (kóduje aminokyselinu glutamin). Gen pro bílkovinu huntingtin obvykle obsahuje 6 35 CAG opakování. Pokud se nalézá v tomto genu více než 39 opakování dojde k abnormálnímu skládání, štěpení a k chybné regulaci a funkci proteinu. To má u lidí za následek ztrátu poznávacích schopností (myslet, mluvit), změny v osobnosti (popudlivost, náladovost) a vede to až k demenci. Nejméně osm dalších smrtelných neurologických poruch je způsobeno rozšířením tripletu kódujícím glutamin (Fondon a kol., 2008). Prvním mechanismem, který přispívá k polymorfismu tandemových repetic je nerovnoměrný crossing-over. To je typické zvláště pro větší repetice. Malé mikrosatelitní repetice často mění svoji délku díky chybám při syntéze DNA, např. mechanismem "klouzání" polymerázy. Během polymerace může dojít díky termální fluktuaci k disociaci řetězců DNA. Následná reasociace řetězců je obvykle přesná a nedochází k žádné změně. Nicméně občas se mohou řetězce spárovat díky repetitivní sekvenci nepřesně. Buď pak vznikne klička na polymerovaném řetězci, což může vést k expanzi repetice (to je častější), nebo se prodlužující řetězec váže na templát více 19

20 distálně (vznikne klička na templátovém řetězci) s následným zmenšením repetice (Obr. 3). Některé repetice mohou tento pochod podporovat stabilizací přechodového stavu tvorbou vlásenkovité struktury z neúplné dvojité šroubovice, což platí zejména pro CAG/CTG repetici ( Během replikace DNA představují delší úseky opakujících se jednotek větší pravděpodobnost skluzu DNA polymerázy než kratší úsek (Eisen, 1999). Je předpokládán minimální práh počtu opakování jednotek mikrosatelitu u kterého není pravděpodobný skluz DNA polymerázy. Odhady skluzu při polymerázové řetězové reakci (PCR) prokázaly že tento práh je 4 8 jednotek u (CA/GT)n a (A/T)n motivů (Shinde a kol., 2003). Skluz DNA polymerázy během replikace DNA je pravděpodobně převažující mutační mechanizmus u mikrosatelitů (Schlötterer a Tautz, 1992). Obr. 3: Skluz DNA polymerázy 20

21 VNTR Metoda VNTR (Variable Numer Tandem Repeats) kombinuje sondy, které jsou hybridizovány s membránami obsahujícími DNA, která byla štěpena restrikčními enzymy. Polymorfizmus je způsoben rozdíly v počtu opakování RAPD, AP-PCR, DAF Markery RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AP-PCR (Arbitrairy Primed PCR) a DAF (DNA Amplification Fingerprinting) využívají jednoho nebo více syntetických oligonukleotidů různé délky jako hraniční sekvence pro specifická nebo nespecifická místa v geonomu. Většinou jde o dominantní markery, které neodliší heterozygoty od dominantních homozygotů. Metoda RAPD je založena na možnosti cyklické amplifikace DNA fragmentů. Reakce probíhá za přítomnosti jednoho krátkého oligonukleotidů (8 10 nukleotidů) s náhodně vybranou sekvencí bazí, geonomové DNA, směsi nukleotidů DTP, reakčního pufru a termostabilní DNA polymerázy. Reakce probíhá v programovatelném termocykleru. RAPD na rozdíl od specifické PCR nevyžaduje znalost cílových sekvencí DNA. Informativní charakter RAPD markerů lze zvýšit další modifikací, kterou umožňuje metoda RAMPO (Random Amplified Microsatellite Polymorphism). V první fázi je genomová DNA amplifikována pomocí jednoho náhodného primeru nebo pomocí dvojce primerů komplementárních k sekvenci mikrosatelitů. Po elektroforetické separaci produktu amplifikace a jeho přenesení na membránu se provádí hybridizace se značenou mikrosatelitovou sondou (Řepková a Relichová, 2001). Hlavní nevýhodou této metody je, že analýza je závislá na reakčních podmínkách, takže se může lišit v dvou různých laboratořích (Agarwal a kol., 2008). DAF je modifikovaná RAPD. Na rozdíl od RAPD je produkt PCR separován v polyakrylamidovém gelu a vizualizován po barvení stříbrem. Primery jsou až 5 nukleotidů dlouhé a vytváří komplexní spektrum. Aplikace metody je vhodná především pro získání genomového otisku (tzv. fingerprint) DGGE DGGE (Denaturing Gradient Gel-Electrophoresis) umožňuje rozlišit dva fragmenty podobné nebo stejné délky. Rozdíly i v jedné bázi mají za následek různou migraci fragmentu a v důsledku toho se tvoří polymorfní fragmenty. Proto je tato metoda velice vhodná pro autogamní druhy (Řepková a Relichová, 2001). Částečně 21

22 denaturovaná DNA vytvoří rozvětvené molekuly, čímž se sníží mobilita DNA v gelu. Pro denaturaci se používají chemická činidla (formamid a močovina) začleněná do akrylamidového gelu tak, aby se vytvářel denaturační gradient. Elektroforéza se provádí při stálé teplotě obvykle mezi C (Jany a Barbier, 2008). Tato metoda byla úspěšně použita např. u pšenice a ječmene. Jeden nebo dva primery postačily k rozlišení dvou linií. Metoda je také vhodná při fylogenetické analýze a identifikaci odrůd SCAR U metody SCAR (Sequence Characterised Amplified Regions) se využívá polymorfního RAPD markeru (DNA fragmentu), který je klonován a sekvencován. 22 až 24 nukleotidů je využito k určení nových primerů pro amplifikaci dalšího fragmentu. V tomto případě jde o specifický marker vhodný pro amplifikaci určitého lokusu. Tyto markery jsou lépe reprodukovatelné v porovnání s RAPD AFLP Metoda AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) kombinuje postupy jak RFLP tak PCR. Jejím klíčovým rysem je schopnost analýzy DNA oblastí rozmístěných náhodně po celém genomu (Mueller a Wolfenbarger, 1999). Uskutečňuje se v několika krocích a je založena na detekce fragmentů DNA získaných štěpením restrikčními endonukleázami prostřednictvím PCR amplifikace. V prvním kroku se provede štěpení rostlinné genomové DNA restrikčními endonukleázami. Používají se dvě restrikční endonukleázi, často a vzácně štěpící rostlinou DNA, např. EcoRI a MseI. V dalším kroku se provádí ligace adaptérů, což jsou krátké většinou radioaktivně značené oligonukleotidy, které jsou komplementární k vytvořeným restrikčním místům rostlinné DNA. Dále se provede amplifikace fragmentů s primery, které se komplementárně vážou na sekvence adaptérů a sousední selektivní nukleotidy. Následuje elektroforéza v polyakrylamidovém gelu a autoradiografie. Spektrum fragmentů je možné získat bez předcházející znalosti sekvence a počet fragmentů detekovaný v jedné reakci je vyladěn sadami specifických primerů. Metoda je vhodná především k detekci polymorfizmu u blízce příbuzných genotypů (Řepková a Relichová, 2001). 22

23 CAPS Markery CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) jsou založené na polymorfizmu oblastí DNA pro nasedání restrikčních endonukleáz. Prvním krokem při identifikaci těchto markerů je polymerázová řetězová reakce specifická pro určité sekvence. Avšak produkt amplifikace nemá různou délku fragmentů u různých ekotypů. Polymorfizmus se projeví až po štěpení restriktázou, jestliže primery při PCR ohraničují polymorfní restrikční místo. Řada CAPS markerů byla doposud vytvořena především u modelového objektu A. thaliana Využití molekulárních markerů při studiu rostlinných geonomů a ve šlechtitelství Použití molekulárních markerů v zemědělství a hlavně ve šlechtitelství usnadňuje práci a šetří čas. Lze tak kupříkladu analyzovat genotypy v raných stádiích ontogenetického vývoje Tvorba genetických map a selekce rostlin určitých genotypů Různé metody založené na amplifikaci prostřednictvím specifických i nespecifických primerů se ve stále širší míře uplatňují v aplikovaném výzkumu v oblasti šlechtění rostlin. Dnes již existují molekulární genetické mapy téměř u všech kulturních rostlin. Jsou identifikovány markery některých důležitých znaků. První rostlinné molekulární genetické mapy byly sestaveny u kukuřice, rajčete, bramboru, dále u rýže a huseníku. Genetické mapování představuje přiřazení molekulárního markeru k vazbovým skupinám. Každá vazbová skupina odpovídá určitému chromozomu a lokalizace je dána mapovou délkou v cm (centimorgany). Pro genetické mapování jsou používány zejména sondy jedinečné nebo sondy s nízkým počtem opakování, protože dávají málo dobře vyhodnotitelných pruhů. Zpočátku byla většina genetických map založena na RFLP, popř. RAPD. V současné době se při genetickém mapování stále častěji uplatňují mikrosatelitové markery. Důvodem je zejména jejich vysoký stupeň polymorfizmu, velká variabilita ve srovnání např. s RFLP markery a jednoduché screenování pomocí PCR. Navíc pro analýzu stačí 50 až 100 ng DNA. U mikrosatelitů je polymorfizmus dán zejména rozdílem v počtu opakování základního motivu, ale také 23

24 změnami v okolí mikrosatelitu. Mikrosatelitové lokusy s více než 10 opakováními tak mají obvykle více alel. Byl vypracován postup, který umožňuje poměrně rychlou detekci polymorfizmu. Genomová DNA jedinců mapované populace se amplifikuje v PCR pomocí primerů, které jsou odvozeny ze sekvencí obklopujících vybraný mikrostatelitový lokus. Po rozdělení produktů amplifikace na agarózovém nebo PPA (polyakrylamidovém) gelu lze polymorfizmus daného mikrosatelitového lokusu vyhodnotit běžnými postupy segregační a vazbové analýzy. Populace určená pro hodnocení je složena s F2 rostlin homozygotních pro určitou recesivní mutaci. Spočítáme chromozomy, ve kterých má SSR popř. CAPS marker alelu ekotypu A, a počet chromozomů, ve kterých má marker alelu ekotypu B. Rostliny, u nichž je marker v homozygotním stavu pro alelu A, počítáme jako 2 A chromozomy, heterozygoty počítáme jako 1 A chromozom a 1 B chromozom, homozygoty pro B počítáme jako 2 B. Četnost rekombinantů r mezi sledovaným genem a markerem vypočítáme jako odhad počtu B chromozomů z celkového počtu chromozomů (%). Při zjišťování mapové vzdálenosti musíme počítat s interferencí. Odhad mapové vzdálenosti v jednotkách centimorganech (cm) je dán např. Kosmabiho funkcí ve tvaru: r D = 25ln 100 2r r - četnost rekombinace (%) U několika rostlinných genomů byly sestaveny genetické mapy založené alespoň z části na mikrosatelitových markerech huseníček rolní, sója luštinatá, ječmen setý, kukuřice setá, rýže setá, lilek rajče a citrus. Mikrosatelitové markery mají však i své nevýhody. Tento marker je potřeba nejprve získat, a to se neobejde bez přípravy genomové knihovny, částečného sekvenování a syntézy primerů. Mikrosatelitový marker se nejčastěji získává prohledáváním známých sekvencí obsažených v různých databázích (např. EMBL, GenBank u většiny rostlin je zde uloženo málo informací; výjimkou je modelová rostlina huseníček rolní, rýže, kukuřice) nebo izolací z různých typů knihoven DNA. Lokalizované markery je možné využít při identifikace různých znaků, které mají význam ve šlechtění rezistence k původcům různých chorob, výnosy, tolerance k biotickým i abiotickým stresům, kvalita semen apod. Byla zjištěna vazba s celou 24

25 řadou genů jak s monogenní tak polygenní dědičností. Tyto molekulární markery je možné využít při detekci určitých genů u nových genotypů, které byly získány např. hybridizací, transgenozí apod. Molekulární markery se využívají i při identifikaci a mapování genů kódujících kvantitativní znaky. Polygenní typ dědičnosti má řada zemědělsky důležitých znaků, jako je třeba rezistence vůči chorobám, tolerance vůči suchu, chladu a mrazu, výnosy. Pro mapování těchto znaků je výchozí křížení mezi dvěma inbredními liniemi, které se liší ve sledovaných kvantitativních znacích. Markery se geneticky a molekulárně analyzují v segregující populaci. Molekulární markery pomocí metody kráčení po chromozomu mohou sloužit jako výchozí bod při izolaci genů, se kterými jsou v těsné vazbě Otisk DNA (fingerprint), identifikace odrůd Molekulární markery se často využívají při zjišťování genetické variability v rámci druhů nebo i mezi druhy. Stávají se tak nástrojem pro taxonomickou klasifikaci. Pokud je k dispozici určitý počet markerů, je možné rozlišit i různé odrůdy v rámci druhu, popř. šlechtitelsky významné genotypy. Sleduje se polymorfizmus (záměny bazí, změny v počtu opakování repetic) mezi testovanými vzorky. Pro tento cíl se využívají různé typy molekulárních markerů. Zvláště sondy hybridizující s repetitivní DNA mohou vytvářet vysoce specifické otisky DNA. Tyto postupy umožňují zjistit hybridní charakter odrůd a slouží tak ke kontrole čistoty osiva a k ochraně práv šlechtitelů - konvence UPOV (Řepková a Relichová, 2001). Použití molekulárních markerů v semenářství a právní ochraně odrůd je mj. závislé na genotypové heterogenitě posuzované odrůdy. Z tohoto hlediska jsou nejméně problémové odrůdy typu čistá linie a klon. Pro typy odrůd, u kterých je předpokládaná určitá genotypová heterogenita (populace, syntetické odrůdy, hybridní odrůdy u allogamních rostlin a složitější typy hybridů než Sc), je použití DNA markerů mnohdy značně diskutabilní. Významnou oblastí využití DNA markerů je detekce kvalitativních parametrů zrna obilovin. Mezi využitelné markery kvality náleží geny determinující proteosyntézu zásobních bílkovin, které určují vhodnost ke zpracovatelskému využití. Existence mnohočetného alelismu v genetické determinaci prolaminových bílkovin a jejich molekulárně genetická analýza nabývá stále většího významu pro predikci technologické kvality zrna pšenice, ječmene, tritikale aj. (Bednář a Vyhnánek, 2004). 25

26 RFLP byly prvním typem markerů, které byly využity při studiu genetické diverzity u rostlin. Byly úspěšně aplikovány u ječmene, kukuřice a pšenice. 214 odrůd pšenice se podařilo rozdělit do 53 skupin na základě polymorfizmu v oblasti organizátoru jadérka (NOR). Alely Nor byly lokalizovány na chromozomech 1B a 6B. 98 RFLP sond bylo použito k objasnění genetických vztahů u australských pšenic. RAPD markery vykazují nižší úroveň polymorfizmu ve srovnání s RFLP, proto se např. u obilovin, jež mají velký genom, nevyužívají. Zde jsou vhodnější AFLP markery Identifikace rostlinných patogenů Molekulárních sond lze využít i pro identifikaci rostlinných patogenů (bakteriálních, houbových, virů a viroidů). Diagnostika různých patogenů je ve šlechtění rostlin nezbytností. Kromě klasických biologických metod je stále aktuálnější využití metod molekulární biologie. Viroidy jsou nejmenší autonomně se replikující patogeny a jsou známé pouze u rostlin, u nichž vyvolávají závažná onemocnění. Jsou to jednovláknové kruhové molekuly RNA, které mají délku 240 až 380 nukleotidů. Molekulární sondy pro jejich detekci jsou založené na kopiích cdna, které jsou radioaktivně značeny a ty umožňují detekci viroidů v rostlinných pletivech metodou DNA-RNA hybridizace, nebo RNA- RNA hybridizace Stanovení evolučních a fylogenetických vztahů (příbuznosti genotypů) Metody molekulární biologie umožňují získat podrobné informace o genetické struktuře přírodních populací. RFLP i PCR markery lze využít při rekonstrukci fylogenetických vztahů u různých druhů. Často se pracuje se sondami pro repetitivní sekvence. Jejich homologní kopie byly často detekovány jen u nejblíže příbuzných druhů. Sledují se evoluční vztahy určitých druhů s jejich planými předky. Pro studium fylogenetických vztahů na mezidruhové úrovni se často využívá chloroplastová DNA. Dendrogramy fylogenetických vztahů v rámci rodu byly zkonstruovány např. u r. Solanum, Glycine, Brassica (Řepková a Relichová, 2001). 26

27 2.2 Biologická diverzita Biologická diverzita (Biodiverzita) zahrnuje celkovou proměnlivost živých organismů a ekosystémů. V této kapitole nastíním význam biodiverzity v zemědělství a ekologii Biologická diverzita, její uchování a využití Zemědělská výroba jako biologický proces je založena na využívání živých organismů, jejichž genetický potenciál a jeho realizace do značné míry rozhodují o výsledku hospodaření. Současné odrůdy zemědělských plodin jsou pěstovány v monokulturách většinou geneticky zcela uniformních (homozygotních) jedinců na obrovských plochách, čímž dochází ke snížení genetické diverzity zemědělských plodin (v literatuře je tento jev označován jako genetická eroze). Snižování genetické diverzity plodin a rozšiřování monokultur má za následek vývoj a rozšiřování různých druhů a ras patogenů. Genetická rozmanitost existující v rámci starých i nově šlechtěných odrůd je nenahraditelným zdrojem pro šlechtění. Z těchto tzv. genetických zdrojů (GZ) přenášejí šlechtitelé cenné znaky a vlastnosti do nových odrůd s vyšší produktivitou, kvalitou a dalšími požadovanými vlastnostmi. Biologická rozmanitost druhů a odrůd tak má zásadní význam přímo pro zemědělskou výrobu, neboť je zárukou její stability, menší závislosti na vstupech agrochemikálií a energií a je jedním ze základních předpokladů setrvalého rozvoje zemědělství. Genetické zdroje rostlin zahrnují genetickou diverzitu: tradičních (krajových) odrůd šlechtěných odrůd (moderních i starších, již registrovaných) experimentálních a šlechtitelských linií planých druhů příbuzných kulturním druhům Všechny tyto materiály jsou shromažďovány v kolekcích a vytvářejí genofond zemědělských plodin. Strategický význam genofondů zemědělských plodin (i hospodářských zvířat) deklaruje mezinárodní Úmluva o biologické rozmanitosti - CDB (Convention 27

28 on Biological Diversity; Rio de Janerio, 1992) a dále dokument Globální Plán Akcí FAO (Globál Plan of Action, 1996). Česká republika přijala úmluvu o biologické rozmanitosti do svého právního řádu Sdělením Ministerstva zahraničních věcí č. 134/1999 Sb., dále přijetím a realizací Zákona o genetických zdrojích rostlin a mikroorganismů (č. 148/2003 Sb.) a jeho prováděcí vyhlášky č. 458/2003 Sb. Ministerstvo zemědělství ČR (MZe ČR) zajišťuje v souladu s touto úmluvou domácí potřeby i mezinárodní závazky při uchování a využívání biodiverzity v zemědělství v rámci Národního programu konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin, zvířat a mikroorganismů významných pro výživu, zemědělství a lesní hospodářství, který sestává ze tří samostatných částí: Národní program konzervace a využívání genetických zdrojů lesních dřevin Národní program konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin a mikroorganismů významných pro výživu a zemědělství (se dvěma podprogramy pro genetické zdroje rostlin; agrobiodiverzitu a genetické zdroje mikroorganismů) Národní program ochrany a využití genetických zdrojů hospodářských a užitkových zvířat, ryb a včel Národní program konzervace a využití genofondu rostlin MZe ČR schválilo nový Národní program konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin a agrobiodiverzity ( ), který je součástí (podprogramem) komplexního projektu Národní program konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin, zvířat a mikroorganismů významných pro výživu, zemědělství a lesnictví a který navazuje na předchozí Národní program ( ). Účelem nového národního programu je organizačně a věcně zabezpečit uchování a setrvalé využívání genetických zdrojů rostlin, které se nalézají na území České republiky, ve smyslu Úmluvy o biologické rozmanitosti (č Sb.) a Zákona o genetických zdrojích rostlin a mikroorganismů (č. 148/2003 Sb.). Národní program zajišťuje: shromažďování genetických zdrojů (včetně sběrových expedic) dokumentaci genetických zdrojů charakterizaci a hodnocení genetických zdrojů regeneraci genetických zdrojů 28

29 konzervaci (dlouhodobé uchování) genetických zdrojů služby uživatelům Cílem programu je zejména: zachovat a rozšiřovat kolekce genetických zdrojů vytvořit předpoklady pro efektivní a setrvalé využívání genetických zdrojů ve šlechtění a v biotechnologiích a pro využívání agrobiodiverzity v zemědělské praxi prostřednictvím mezinárodní spolupráce a reciprocity služeb zabezpečit přístup domácích subjektů ke genetickým zdrojům, relevantním informacím a technologiím v zahraničí garantovat mezinárodní závazky ČR na úseku genetických zdrojů rostlin a agrobiodiverzity Program koordinuje Genová banka Výzkumného ústavu rostlinné výroby Praha, konzultačním a poradním orgánem je Česká rada genetických zdrojů kulturních rostlin, jejímiž členy jsou zástupci MZe ČR, Genové banky, kurátoři kolekcí, šlechtitelé a další specialisté. Organizace odpovědné za jednotlivé kolekce zabezpečující rozšiřování těchto kolekcí, jejich uchování (u generativně množených druhů ve spolupráci s Genovou bankou VÚRV Praha), dokumentaci, charakterizaci, hodnocení a regeneraci. U vegetativně množených druhů jsou organizace udržující tyto kolekce genovými bankami (tzv. polní genové banky, in vitro nebo kryo banky) a jsou odpovědné za jejich dlouhodobé uchování. Generativně množené druhy se uchovávají standardně ve formě semen, která jsou dlouhodobě uložena v Genové bance VÚRV Praha. Pro evidenci kolekcí genetických zdrojů rostlin slouží v ČR centrální dokumentační systém EVIGEZ (evidence genetických zdrojů), který je provozován genovou bankou VÚRV Praha. Každoročně je dokumentace obohacována o: pasportní data položek zařazených do kolekce (dostupná z URL popisná data po víceletém cyklu hodnocení 3 3 K hodnocení popisných znaků se využívá Klasifikátoru, který je zpracován pro každý rostlinný druh (rod) samostatně. Hodnocené morfologické znaky a biologické vlastnosti jsou specifické pro daný druh genetického zdroje. 29

30 skladované údaje, které zaznamenává genová banka a které se týkají uchovávaných semenných vzorků ve skladu GB Počet shromážděných genetických zdrojů dosáhl v roce 2003 celkem 45,7 tisíc položek, z toho generativně množené druhy představují 82,2 % a vegetativně množeným druhům patří 17,8 % položek Česká genová banka kulturních rostlin Genová banka koordinuje, metodicky řídí nebo sama zabezpečuje následující úseky práce s rostlinným genofondem: shromažďování genetických zdrojů a průběžné rozšiřování jejich kolekcí hodnocení genetických zdrojů dokumentací informací o genetických zdrojích tvorba databází dlouhodobé uchování genetických zdrojů v živém stavu pro jejich případné šlechtitelské, výzkumné nebo výukové využití Shromažďování genetických zdrojů Významnými genetickými zdroji jsou vysoce sbalancované genotypy nově povolovaných odrůd, do kterých byla nakombinována řada pozitivních vlastností a znaků. Z tohoto důvodu se věnuje čs. GB této skupině genových zdrojů značně intenzivně. Nové odrůdy jsou získávány buď nákupem nebo bezplatnou výměnou. Starší odrůdy které jsou uloženy v jiných genových bankách, jsou získávány bezplatnou výměnou v souladu s rezolucí FAO z r Za stejných podmínek též genová banka genové zdroje poskytuje. Předpisy a podmínky pro distribuci vzorků jsou specifikovány zákonem č. 148/2003 Sb. Plané formy a krajové odrůdy jsou získávány sběrovými expedicemi, které na území ČR pomáhá genová banka organizovat. Řešitelé se účastní pravidelně i zahraničních sběrových expedic Hodnocení genetických zdrojů Této činnosti se věnuje genová banka u následujících plodin: ozimá a jarní pšenice, ozimý ječmen slunečnice, pohanka, proso, ozimé a jarní tritikale a laskavec. GZ ostatních plodin jsou hodnoceny na spolupracujících řešitelských pracovištích Národního programu na základě smlouvy s GB. 30

31 Dlouhodobé uchování genetických zdrojů Čs. GB byla uvedena do provozu v průběhu roku GB má celkovou kapacitu 93 tisíc semenných vzorků. Dlouhodobé skladování semenných vzorků v GB je zajišťováno následujícím způsobem. Vzorek je před přijetím do GB podroben kontrole čistoty, klíčivosti a zdravotního stavu. Odpovídají-li semena požadovaným parametrům, jsou vysušena na 4 8 % vlhkosti (podle druhu rostliny) a uložena v hermeticky uzavřených obalech (sklenice 370 ml nebo 210 ml v případě drobných semen) v chlazených komorách Typy kolekcí Podle šíře působnosti: národní kolekce (plodinové, druhové) mezinárodní (druhové) kolekce (pracoviště GZR v České republice jsou pověřena mezinárodní gescí za uchování populací česneku, kolekce lnu a slunečnic) Podle způsobu využití: základní kolekce původní československé odrůdy, významné a ohrožené genetické zdroje; doba skladování let, teplota skladování -18 C aktivní kolekce veškeré genetické zdroje v čs. kolekcích; doba skladování let, teplota skladování -5 C, u citlivých druhů -18 C bezpečnostní duplikace vybraná část základní kolekce (materiály místního původu, významné a ohrožené GZR) je uložena v jiné genové bance jako záloha pro případ poškození, teplota skladování -18 C pracovní kolekce vzorky s nedostatečným množstvím semen, sběrový materiál, kterému ještě nebylo přiděleno národní evidenční číslo (ECN) nebo vzorky, které ještě nebyly nebo nejsou na počátku hodnocení; krátkodobé skladování, teplota skladování max. 5 C Technologie skladování umožňuje u velké většiny druhů uschování semene po dobu let bez přesevů. Cyklicky (po 5 10 letech) je hodnocena životnost semene a stav zásoby semen je monitorován databází evidenčního systému genové banky. V případě negativních výsledků kontroly životnosti nebo zaregistrování poklesu 31

32 zásoby semen na kritickou mez je vyrozuměn řešitel kolekce, aby příslušnou kolekci v co nejkratší možné době doplnil Genová centra Jako genová centra jsou označovány oblasti vzniku kulturních rostlin (centra původu plodin). Centra původu plodin jsou zeměpisné oblasti, odkud druhy pocházejí, kdežto centra diverzity jsou charakterizována rozsáhlou genetickou variabilitou mezi genotypy pěstovaných plodin a příbuzných druhů. Centra původu a diverzity mohou, ale nemusí být identická. Genetická diverzita (různorodost) vznikla a stále vzniká mutacemi, kombinacemi a rekombinacemi, zatímco environmentální adaptace (přizpůsobení klimatickým podmínkám) a náhodný genetický drift formují rozložení genetické diverzity v čase a prostoru. Vavilov (1935) se domníval, že stupeň mnohotvárnosti je také ukazatelem toho, jak dlouho se která plodina v určité oblasti pěstuje čím déle se pěstuje, tím je mnohotvárnější. Centra genetické různorodosti tedy byla i centra původu druhů. Jednalo se zejména o podhůří, např. Himaláje, Hindúkuše a Apenin a oblasti Blízkého východu a Balkánu. V každém centru se vyvinuly nejen obiloviny, ale i další plodiny. Žukovskij (1971) později vymezil dvanáct geografických genových center vzniku kulturních rostlin na světě: Čína Japonsko Indonésie Indočína Austrálie Indie Střední Asie Přední Asie Oblast Středozemního moře Afrika Evropa a Sibiř Střední Amerika Jižní Amerika Severní Amerika 32

33 Později bylo zjištěno, že oblasti s maximální variabilitou druhu nemusí být identické s centry původu. Například v Etiopii má sice pšenice největší variabilitu, ale nebyl zde nalezen žádný z primitivních předků, a proto je pravděpodobné, že byla do Etiopie introdukována (Bednář a Vyhnánek, 2004). 33

34 3 MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ Analýza genetické variability v kolekci genových zdrojů papriky roční (Capsicum annuum L.) byla prováděna v laboratořích na ústavu biologie rostlin na Mendelově zemědělské a lesnické univerzitě v Brně. 3.1 Použitý materiál Důležité je pracovat se sterilními nástroji a materiálem, aby bylo zabráněno kontaminaci cizorodou DNA a tím zkreslení výsledků analýzy. Cizorodá DNA by mohla zapříčinit nadbytečně amplifikované fragmenty při PCR analýze Rostlinný materiál Pro analýzu variability SSR markerů bylo použito 41 genotypů papriky roční (Capsicum annuum L.), které byly vypěstovány v izolačních klecích na pozemcích Výzkumného ústavu rostlinné výroby v Olomouci (Tab. 1). Tab. 1: Přehled analyzovaných genotypů papriky roční (Capsicum annuum L.) Př. Číslo EVIGEZ Název Př. Číslo EVIGEZ Název 1 09H Tetenyi 22 09H Aufrechte Cayenne 2 09H Kalocsai Furzer (Edes) 23 09H Aufrechte Cayenne 3 09H Kalocsai Furzer (Edes) 24 09H Bogyisloi 4 09H Kalocsai Furzer (Edes) 25 09H Bogyiszloi 5 09H Vinedale 26 09H Bogyiszloi 6 09H Vinedale 27 09H Bogyiszloi Vastaghusu 7 09H Astrachanskij 28 09H Japan Madarszem 8 09H Astrachanskij 29 09H Japan Madarszen 9 09H Astrachanskij 30 09H Japan madarszen 10 09H Astrachanskij 31 09H Japan madarszen 11 09H Astrachanskij 32 09H Tetenyi 12 09H Astrachanskij H Tetenyi 13 09H Hatvani 34 09H Tetenyi 14 09H Japan Madarszen 35 09H Tetenyi 15 09H Hatvani Csemege 36 09H Vinedale 16 09H Hatvani 37 09H Japan Hontakka 17 09H Hatvani 38 09H Japan hontakka 18 09H Konservnyj Belyj H Japan hontakka 19 09H Vinedale 40 09H Konservnyj Belyj H Aufrechte Cayenne 41 09H Konservnyj Belyj H Aufrechte Cayenne 34