Základy hmotnostní spektrometrie. Ústav molekulární patologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany Hradec Králové

Transkript

1 Základy hmotnostní spektrometrie Ústav molekulární patologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany Hradec Králové

2 Historie Koichi Tanaka vyvinul MALDI techniku Tanaka K., Waki H., Ido Y., Akita S., Yoshida T.: Rapid Commun. Mass Spectrom , 151 Tanaka K. JB Fenn vyvinul ionizaci elektrosprejem Fenn JB., Mann M., Meng CK., Wong SF., Whitehouse CM.: Science 1989, 246, 64 Fenn J.B. Oba získali Nobelovu cenu v roce 2002 v oboru chemie

3 Princip Hmotnostní spektrometrie (MS) je fyzikálně-chemická metoda, která určuje hmotnosti atomů, molekul a molekulových fragmentů po jejich převedení na ionty. Přístroj se nazývá hmotnostní spektrometr.

4 Princip MS vypovídá o primární struktuře analyzované látky Neposkytuje informace o sekundární či terciální struktuře proteinu Odhaluje posttranslační a chemické modifikace proteinů (fosforylace, glykosylace, oxidace.) a může určit i místo modifikace Může určit izotopový poměr prvků ve vzorku např. 13 C/ 12 C, 34 S/ 32 S, 18 O/ 16 O - kvantifikace

5 Princip Umožňuje analýzu komplexních směsí Změření molekulové hmotnosti, kontrola kvality Identifikaci proteinů Odhaluje mutace a DNA sekvenační chyby Možnost analýzy nekovalentních komplexů

6 Vlastnosti hmotnostní spektrometrie Citlivá Specifická Rychlá Jednoduchá interpretace dat

7 Popis přístroje Experimentální uspořádání 1. Iontový zdroj 2. Hmotnostní analyzátor 3. Detektor 4. Řídící počítač

8 Součásti MS systému Atmosphere Vacuum System Sample Inlet Ionisation Method Mass Analyser Detector Data System

9 MALDI-TOF hmotnostní spektrometry MALDI-TOF Voyager (Applied Biosystems) 4800 MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems) Ultraflex III MALDI TOF/TOF (Bruker)

10 Princip Ionizace 1.Měkké techniky ionizace Energetický přebytek dodaný molekule je malý a fragmentace primárně vzniklého iontu je malá. 2. Tvrdé techniky ionizace Dodaná energie postačuje k rozsáhlejší fragmentaci primárně vzniklého iontu.

11 Typy ionizace - nárazem elektronů (EI) -působením elektrostatického pole (FI, FD) - chemickou ionizací (CI) - nárazem rychlými atomy nebo ionty (FAB) - ionizací fotony - ionizací 252 Cf - elektrosprejem, termosprejem (ESI) - ionizace laserem za přítomnosti matrice (MALDI)

12 Hmotnostní analyzátory Umožňují rozdělit v čase nebo prostoru směs iontů o různých hmotnostech. Typy analyzátorů Průletový analyzátor (TOF) Kvadrupólový analyzátor (jednoduché, trojnásobné) Iontová past Hybridní (Q-TOF, Q-trap, trap-tof, trap-icr, ) Tandemové (TOF-TOF, QQQ) FT- ICR MS, ORBITRAP

13 Detektor Poskytuje analogový signál úměrný počtu dopadajících iontů. Dělí se do dvou skupin 1. Detektory pro přímá měření detekují el. proud vznikající přímým dopadem stanovovaných iontů (měření izotopového zastoupení prvků při zjišťování stáří hornin) 2. Násobičové detektory využívají efekt násobení elektronů uvolněných z první konverzní dynody po dopadu iontů (nejčastěji používané detektory v MS, poskytují měřitelný signál pro jednotlivé ionty)

14 Ionizace

15 MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Metoda využívá ionizace laserem pulsní technika UV (N 2 ) IR (CO 2 ) zkoumaná látka je kokrystalyzována v pevné matrici, která je ozářena krátkým laserovým pulsem (3 ns) dojde ke vzniku iontů (neutrálních, kladně i záporně nabitých) jejich proud je usměrněn do analyzátoru z doby letu (TOF)

16 MALDI-TOF MS - ionizace MALDI destička Laser 1.Vzorek (A) je smíchán s matricí (M) ausušen (vykrystalizován) na MALDI destičce AH 2. Laserový výstřel ionizuje molekuly matrice. 3. Molekuly vzorku jsou ionizovány přenosem protonu z matrice: MH A M AH 20 kv Ground Variable Grid Grid

17 MALDI ionizace Měkká ionizace Malá nebo žádná fragmentace Jednou nabité ionty [MH] ; [M-H] - Lze měřit proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy, syntetické polymery Analýza komplexních sloučenin Rychlá příprava vzorku & analýza Tolerantní k detergentům a solím Jednoduchá interpretace dat Spojený s TOF analyzátorem

18 ESI - ionizace elektrosprejem Měkká ionizace Technika pro disperzi kapalin a aerosolů On-line spojení HPLC a hmotnostního spektrometru Vznik vícenásobně nabitých iontů [MzH] z,[mzh] z- Pro jeden analyt se ve spektru objevují série píků, které odpovídají iontům téže látky, o stejné molekulové hmotnosti M, s rozdílným počtem nábojů z. Výskyt iontů - aduktů analytu se sodnými ionty [MzNa] z a draselnými ionty [MzK] z (pokud je vzorek zasolený) Není tolerantní k detergentům a solím (před analýzou je nutné přečištění a odsolení vzorku) Spojení s různými typy analyzátorů

19 ESI MS intaktního proteinu

20 ESI - ionizace elektrosprejem Výhody Díky přítomnosti analytu ve více iontech srůzným nábojem lze snadno určit náboj iontů Nevýhody Snížení citlivosti díky rozdělení signálu mezi více píků a menší přehlednost spekter složitějších směsí.

21 Při ionizaci elektrosprejem probíhají čtyři základní procesy 1) vznik nabitých kapek na konci sprejovací kapiláry 2) zmenšování nabitých kapek v důsledku odpařování rozpouštědla a jejich opakovaný rozpad (Coulombické štěpení) 3) uvolnění iontů do plynné fáze z malých, vysoce nabitých kapek 4) sekundární děje, kterých se účastní ionty v plynné fázi

22 ESI - ionizace elektrosprejem - Sprejovací kapilára Taylorův kužel Coulombické štěpení Elektrony Oxidace - Zdroj vysokého napětí Elektrony Zmenšování kapek v důsledku odpařování rozpouštědel Redukce

23 Foto ESI Kapilára Vstup do MS

24 Hmotnostní analyzátory

25 TOF analyzátor Ionty o stejné energii nebo o stejném impulsu mají rychlosti závislé na hodnotách efektivní hmotnosti m/z Ionty jsou vypuštěny do urychlovacího pole a se získanou energií postupují analyzátorem rychlostí v, takže dráhu d proletí za dobu t Mezi dvěma ionty rozdílných hmotností je tedy diference v dobách letu t = k ( m 1 /z - m 2 /z)

26 TOF analyzátor Umožňuje měřit v lineárním, reflektronovém a PSD módu Lineární mód měření proteinů (přímá dráha letu, cca 1m) Reflektronový mód měření peptidů (dráha letu je prodloužena pomocí reflektronového iontového zrcadla, cca 2-3m) Post-Source Decay (PSD) kombinace reflektronového módu s fragmentací mateřských iontů (informace o sekvenci peptidů)

27 Průletový analyzátor (TOF) kv Letová trubice Detektor Zdroj iontů

28 Průletový analyzátor (TOF) kv Letová trubice Detektor Zdroj iontů Lehčí ionty doletí k detektoru rychleji než ionty těžší.

29 MALDI MS spektrum proteinů

30 Lineární mód Reflektronový mód

31 Charakteristika reflektronový mód Vysoké rozlišení (až ) a přesnost ( ppm) Vysoká citlivost (fmol = mol) Teoreticky neomezené rozmezí m/z Téměř současná detekce všech iontů: zisk úplného spektra vjednom ionizačním pulsu

32 Kvadrupólový analyzátor (Q) Dynamický analyzátor, dělení iontů je dosaženo jejich průchodem mezi čtyřmi kovovými tyčemi Tyče jsou paralelně rozmístěny na kružnici, na protilehlé tyče je vloženo vždy stejné napětí, které je kombinací stejnosměrné (U) a střídavé (V) složky Napětí vložená na dva páry tyčí jsou zvolena v daném časovém okamžiku tak, aby mezi tyčemi proletěly pouze ionty s hodnotou m/z vurčitém omezeném intervalu, případně s jedinou hodnotou m/z. Zbylé ionty jsou vyneseny ven z elektrického pole a zachyceny na tyčích kvadrupólu.

33 Kvadrupólový analyzátor (Q) Schematické znázornění kvadrupólového analyzátoru snaznačením dráhy iontů. Příčný průřez kvadrupólovým analyzátorem

34 Kvadrupólový analyzátor (Q) Současnou, plynulou změnou hodnot U a V jsou postupně analyzovány všechny ionty ve zvoleném rozsahu m/z Kvadrupól funguje jako laditelný filtr sloužící ke skenování spektra ve zvoleném rozsahu Je-li na tyče přivedena pouze střídavá složka napětí, kvadrupólový analyzátor propouští všechny ionty nezávisle na jejich efektivních hmotnostech. V tomto režimu se analyzátor používá jako iontový vodič.

35 Kvadrupólový analyzátor (Q) Výhody relativně rychlý záznam celého spektra lineární stupnice m/z není přítomen magnet Nevýhody nízké rozlišení nízký rozsah m/z (2 4 kda) diskriminace iontů s vyšším m/z

36 Kvadrupólový analyzátor (Q) Použití při analýzách anorganických a lehkých či středně těžkých organických sloučenin analýza peptidů a proteinů je výhodná především ve spojení s ESI, kde je hodnota m/z generovaných iontů snížena díky vyššímu počtu nábojů dosahují také výborných výsledků při měření kvantity analytů jsou vhodné pro spojení GC/MS a HPLC/MS umožňují měření v tandemovém uspořádání hmotnostního spektrometru lze použít stejné hmotnostní analyzátory, např. QqQ trojitý kvadrupól nebo kombinace hmotnostních analyzátorů, např. Q-TOF kvadrupól a průletový analyzátor

37 Kvadrupólový analyzátor (Q) Využití trojitého kvadrupólu pro strukturní analýzu peptidů a jiných lehkých a středně těžkých biomolekul pracuje tak, že v prvním kvadrupólovém filtru je izolován prekurzor (mateřský iont) druhý kvadrupól pracuje v režimu iontového vodiče a slouží jako kolizní cela vdůsledku srážek s molekulami kolizního plynu (např. helium, argon) dochází ke kolizně indukované disociaci (CID) za vzniku dceřinných iontů, které jsou pak analyzovány posledním, třetím, kvadrupólem

38 Iontová past (IT) je v podstatě trojrozměrný kvadrupól skládá se z prstencové střední elektrody s hyperbolickým průřezem a dvou kruhových elektrod rovněž s hyperbolickým průřezem, které prstenec volně uzavírají na prstenec je vloženo kombinované stejnosměrné (U) a radiofrekvenční (V) napětí dochází ke stabilním oscilacím iontů v pasti všechny ionty nad určitou hodnotu m/z odpovídající amplitudě vysokofrekvenčního napětí mají trajektorie, které je udržují uvnitř pasti

39 Iontová past (IT) do iontové pasti je zaváděno hélium ( tlumící plyn) He tlumí oscilace iontů a udržuje je ve středu pasti při zvyšování vysokofrekvenční amplitudy se ionty s rostoucí hodnotou m/z postupně stávají nestabilními a jsou vypuzovány z pasti a detekovány. Kvadrupólová iontová past

40 Iontová past (IT) Výhody umožňuje strukturní analýzy bez nutnosti jakéhokoli rozšíření přístroje vybraný iont lze v pasti uchovat, následně ho podrobit fragmentaci do druhého (MSMS) nebo více (MSn) stupňů teoreticky mohou komerční iontové pasti mít MS 10, prakticky jsou detekovány ionty asi do MS 4 a výjimečně do MS 7 poměrně vysoká rychlost skenování (~10 3 Da/s) umožňuje dosažení izotopového rozlišení do m/z ~ 2 4 kda vyššího rozlišení lze dosáhnout za cenu snížení rychlosti skenování spektra nebo rozsahu m/z

41 Iontová past (IT) Výhody měřící rozsah iontové pasti byl původně 650 Da, ale dalšími úpravami bylo dosaženo až Da a rozlišovací schopnosti FWHM až standardně se vyrábějí iontové pasti s rozsahem Da ve spojení s ESI (poskytující vícenásobně nabité ionty) je iontová past vynikajícím nástrojem proteomiky

42 Iontová past (IT) Lineární iontová past vsoučasné době dochází k přechodu od klasické kvadrupólové (trojrozměrné) pasti k pastím lineárním (linear trap, LT) LT jsou tvořeny kvadrupólem, který je ze všech stran uzavřen víčky ionty jsou nejprve akumulovány v potenciální jámě mezi víčky iontového vodiče pracujícího v kvadrupólovém režimu a později vypouštěny ve směruosynebopřes otvory v tyčích kvadrupólu nejvýznamnější výhodou lineární pasti, ve srovnání s trojrozměrnou, je výrazně účinnější akumulace iontů, vyšší iontová kapacita, tím i vyšší dynamický rozsah, a více operačních režimů vhodné pro měření posttranslačních modifikací proteinů (fosforylace)

43 Tandemový hmotnostní spektrometr tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS), případně hmotnostní spektrometrie n-tého stupně (MS n ), slouží k bližší charakterizaci analyzované látky, např. určení aminokyselinové sekvence nebo lokalizace posttranslačních modifikací obsahují dva hmotností analyzátory sériově spojené kolizní celou v prvním analyzátoru dojde k rozlišení prekurzorových (mateřských) iontů a k výběru jednoho z nich tento prekurzor je podroben fragmentaci v kolizní cele a vzniklé produktové (dceřinné) ionty jsou rozlišeny v druhém analyzátoru

44 Příprava vzorků pro MS Předseparační techniky rozdělení analyzované látky (1D, 2D ELFO,HPLC, caplc, MudPIT HPLC.) Dělení jak proteinových tak i peptidových směsí

45 2D-PAGE a MALDI-TOF Postup přípravy vzorků Separovaný Protein Proteasa Proteolytické peptidy MALDI-TOF MS spektrum proteolyt. peptidů

46 Štěpení proteinů Enzymové proteolýza, nejpoužívanější enzym je trypsin Chemické nejsou běžné, používají se jako doplňkové např. BrCN - bromkyan se používá pro štěpení ve vodě nerozpustných nebo membránových proteinů Molekulová hmotnost vzniklých peptidů se pak měří na hmotnostním spektrometru

47 Proteolytické enzymy - proteázy Katalyzují exotermní hydrolýzu peptidových vazeb v proteinech a peptidech Výhody jejich použití vysoká specifita minimalizované vedlejší reakce dobrá účinnost štěpení Podmínky použití, důležité je dodržení: ph reakčního pufru poměru enzym/substrát teptoty doby inkubace pokud je to nutné provádí se: redukce disulfidových vazeb (např. DTT) alkylace reaktivních cysteinů (např. jodacetamid)

48 Proteolytické enzymy - proteázy Klasifikace proteinázy -působí na proteiny (nevyžadují přítomnost volných konců susbstrátů) peptidázy -působí na malé oligopeptidy (vyžadují alespoň jeden konec substrátu volný a to v blízkosti místa štěpení) endopeptidázy - katalyzují hydrolýzu peptidových vazeb uvnitřřetězce a tvoří peptidy o různé délce exopeptidázy - katalyzují hydrolytické odštěpení koncové aminokyseliny N-koncové (aminopeptidázy) C-koncové (karboxypeptidázy)

49 Peptidázy Endopeptidázy se získávají: z orgánů trávicího traktu obratlovců (pankreas - chymotrypsin, trypsin, žaludek - pepsin) krve (thrombin) sleziny (kathepsiny) rostlinného materiálu (papain, ficain, bromelain) mikroorganismů (Glu-C, pronase, thermolysin) Exopeptidázy se získávají: pankreatu rostlin mikroorganismů

50 Tabulka enzymů a chemických látek používaných pro štěpení proteinů

51 Trypsin v proteomice nejpoužívanější serinová endopeptidáza štěpí v mírně alkalickém prostředí (ph 7.8) štěpí specificky peptidové vazby na C-konci kladně nabitých zbytků argininu a lysinu, pokud nenásleduje prolin doba štěpení 4-24 hodin teplota při štěpení 37 C methylovaný trypsin štěpí 30 minut při 58 C poskytuje definované peptidové fragmenty dobře se ionizují výhodná velikost pro MS analýzu

52 jeden z možných typů trypsinu je hovězí trypsin má Mw 24 kda, ph 9.4 trypsin je výhodný pro štěpení v polyakrylamidovém gelu, je schopný difundovat póry gelu k proteinu větší molekuly peptidáz nejsou schopny do gelu difundovat ze stérických důvodů vzhledem k vysoké specifitě štěpení jsou tvořeny databáze obsahující proteiny s teoretickými trypsinovými peptidy včetně jejich m/z hmotností využití k identifikaci proteinů metodou peptide mass fingerprinting (peptidové mapování) Nevýhody Trypsin malá termostabilita (při vyšší teplotě klesá aktivita) autolýza (autolytické peptidy trypsinu ruší MS analýzu) štěpí pouze v optimálním ph Modifikace trypsinu (methylace, acylace) zabraňují jeho autolýze a termolabilitě.

53 Chymotrypsin serinová endopeptidáza někdy nahrazuje nebo doplňuje trypsin vhodný pro štěpení proteinů v roztoku i gelu specifita štěpení je na rozdíl od trypsinu nízká peptidovou vazbu štěpí na C-konci v místě: F (phenylalanin), Y (tyrosin), W (tryptophan), L (leucin), I (isoleucin), V (valin), M (methionin) pokud nenásleduje prolin

54 Glu-C serinová endopeptidáza produkt bakterie Staphylococcus aureus štěpí peptidové vazby na C-konci kyseliny glutamové případně kyseliny asparagové (3000x pomaleji) Lys-C serinová endopeptidáza produkt bakterie Lysobacter enzymogenes štěpí peptidové vazby na C-konci lysinu

55 Použití enzymů v proteomice studium glykosylace (Glu-C, Asp-N) lokalizace fosforylačních míst (elastáza) analýza peptidů s disulfidovými vazbami (Glu-C, Lys-C, thermolysin) peptidové mapování (Asp-N, Arg-C, Glu-C, Lys-C - striktní specifita) proteinové modifikace včetně posttranslačních (pronáza), poskytuje krátké peptidy - nevhodná pro peptidové mapování strukturní změny v proteinech na základě izotopové výměny vodík/deuterium, analýza O-glykosylace proteinu (pepsin, peptidázy)

56 Enzymatické štěpení vzorku Trávicí enzym trypsin umožňuje specifické štěpení peptidové vazby u kladně nabitých zbytků. Trypsin štěpí peptidové vazby na C-konci kladně nabitých zbytků argininu a lysinu, není-li následující zbytek prolin. -Phe-Trp -Met -Gly-Ala -Lys - Leu - Pro - Met - Asp - Gly - Arg -- Cys - Trypsin

57 Matrice Matrice slouží jako rozpouštědlo analytu, takže jeho molekuly jsou dostatečně zájemně separovány a jejich intermolekulární působení je redukováno na minimum Matrice musí absorbovat v UV oblasti (pokud používáme N 2 laser) a musí být málo těkavá (to souvisí s čerpací rychlostí vakuového systému) Matrice musí vytvořit co nejjemnější směsné krystaly U matric je důležitá přítomnost -OH skupin, které zajišťují ionizaci analytů. Pokud jsou -OH skupiny nahrazeny za CH 3 CO- skupiny, matrice ztrácí svou funkci

58 Vzorce a názvy matric

59 Krystaly vzorku a matrice SA na MALDI destičce Brucella melitensis CAPM 6374 Burkholderie pseudomallei CAPM 3462 Francisella tularensis CAPM 5541

60 MALDI-TOF MS Výběr matrice Název matrice α-kyano-4-hydroxyskořicová kys. (CHC) Analyzovaná látka Peptidy, proteiny < 10 kda, karbohydráty, lipidy 3,5-dimetoxy-4-hydroxyskořicová kys. (SA) 2,5-dihydroxybenzoová kyselina (DHB) 3-hydroxypikolinová kyselina (3-HPA) Proteiny, peptidy > 10 kda, glykoproteiny Neutrální karbohydráty, syntetické polymery, peptidy, proteiny, glykopeptidy, lipidy, glykoproteiny Oligonukleotidy, glykoproteiny 3,4-dihydroxyskořicová kyselina (CA) Proteiny, oligonukleotidy

61 Interpretace spekter Metoda peptidového mapování (PMF) Voyager Spec #1 MC[BP = , 39593] E % Intensity Mass (m/z)