Hmotn mot o n s o t s n t í n sp sp kt k r t ometr t ie

Transkript

1 MALDI-TOF MS typizace rodu Aeromonas Andrea Teshim (Vávrová) 1,2 PřF MU, Brno Spoluautoři: RNDr. Ludmila Tvrzová, Ph.D. 1 RNDr. Ivo Sedláček, CSc. 2 RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. 3 Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D. 3 Ing. Matej Lexa, Ph.D. 4 (1) Oddělení mikrobiologie, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity, Brno, Česká republika (2) Česká sbírka mikroorganismů, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity, Brno, Česká republika (3) Oddělení funkční genomiky a proteomiky, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity, Brno, Česká republika (4) Oddělení informačních technologií, Fakulta informatiky Masarykovy univerzity, Brno, Česká republika 1/20

2 Hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice Matrix-assisted assisted laser desorption/ionization time of flight MS Analytická technika Aplikace: Detekce a analýza biomolekul Identifikace proteinů, struktury, protein.interakcí Rychlá chemotaxonomie založená na detekci biomarkerů 2/20

3 Význam metody MALDI TOF pro taxonomii mikroorganismů Potřeba jasných a rychlých výsledků identifikace neznámých vzorků zařazení do rodů, druhů Významná je autentizace a identifikace kmenů Př.rod Aeromonas druhy druhů (Stackebrandt, Donohue a kol., 2005) Výhoda MALDI MS : při rozlišení dvou chemotaxonomicky a fenotypicky neodlišitelných druhů (Př. B. anthracis a B. cereus) 3/20

4 Rod Aeromonas častý izolát klinického a veterinárního materiálu, podmíněný patogen, maso, mléko, ryby, zelenina, plody moře, vodní prostředí»nový systém klasifikace! --- řád Aeromonadales»heterogenita a genetická proměnlivost v rámci rodu»klinika: sekreční faktory: cytotoxiny, enterotoxiny, aerolyzin, proteázy, siderofory povrchové faktory: fimbrie, membr.proteiny, S vrstva, pouzdro, LPS A. caviae mírné průjmy, Lac+, nehemolitická A. hydrophila -dyzenterie A. jandaei, A. trota, A. schubertii Infekce ran, septikémie, gastroenteritidy, endokarditidy, meningitidy, pneumonie, osteomyelitidy, konjunktivitidy Rezistence k Amp Aeromonas hydrophila» Diagnostika: : selektiv.půda s Amp, TCŽS, alkal.pepton.voda, KA - mukózní kolonie, ox+, kat+, lac (mimo A.caviae),, Glu+, Gas+, stringβ hemol. 4/20

5 Cíle Ověřit diferenciační schopnost MALDI MS pro bakterie rodu Aeromonas na typových kulturách a izolátech z prostředí Cellulitis Snaha získat : reprodukovatelná spektra - odlišnosti mezi kmeny > autentizace, identifikace Aeromonas hydrophila 5/20

6 MALDI MS analýza Spot na MALDI desce Vzorky:~ buňky: celobuněčné preparáty prostředí, klinika, potraviny Destička MALDI kokrystalizace matrice se vzorkem N 2 laser 337nm excitace UV, absorbce E laseru hluboké vakuum 10-6 Pa Ionizace molekul uvolnění protonovaných molekul [M+H] + analytu 6/20

7 Matrice Struktura hl.typů matric Deriváty kys.benzoové a skořicové: CHCA α-kyano-4-hydroxyskořicová (do ~ 5000Da) SA sinapová sdhb gentisová (vysokomolekulární látky), sdhb v 20% ACN s 1% TFA a.i sdhb FA SA CHCA m/z Vliv matrice na kvalitu signálu»rozpustná ve stejném rozpouštědle jako vzorek, v nadbytku ke vzorku»neměla by se vzorkem reagovat»absorbce vln.délky laseru»fotostabilita 7/20

8 Technika charakterizuje biomarker poměrem m/z částice Měří se doba letu a intenzita signálu Zobrazení jako spektrum ionizovatelných částic bakteriálního proteomu v přítomnosti matrice Schéma metody MALDI TOF 8/20

9 Výstupní spektrum Výška píku = koncentrace proteinu v místě odstřelu (není kvantitativní metodou) Závisí také na krystalizaci, ionizačních vlastnostech vzorku aj. a.i. 500 A. hydrophila A. media ssp. 3653T dhakensis 7146T 400 Pík = hodnota m/z m /z 9/20

10 Optimalizace metody Hustota suspenze bakt.vzorku Test konzervačních vlastností acetonitrilu vliv délky zamražení Test typu použité matrice dle poměru signál/šum Test okyselení matrice Test reprodukovatelnosti, opakovatelnosti 10/20

11 Analyzované kmeny: CCM 4363 T CCM 4707 T CCM 4491 T CCM 7231 CCM 4582 T CCM 7243 T CCM 4354 T CCM 4528 CCM 7146 T CCM 7232 T CCM 7147 T CCM 7244 CCM 4355 T CCM 3653 T CCM 7245 T CCM 7233 T CCM 4124 T CCM 7020 T CCM 1307 CCM 7246 T A. allosaccharophila A. bestiarum A. caviae A. caviae A. encheleia A. enteropelogenes A. eucrenophila A. hydrophila ssp.hydrophila A. hydrophila ssp.dhakensis A. hydrophila ssp.hydrophila A. hydrophila ssp. ranae A. ichthiosmia A. jandaei A. media A. molluscorum A. salmonicida ssp.achromogenes A. salmonicida ssp.masoucida A. salmonicida ssp.pectinolyticapectinolytica A. salmonicida ssp.salmonicidasalmonicida A. salmonicida ssp.salmonicidasalmonicida CCM 4103 T A. salmonicida ssp. smithia CCM 4356 T A. schuberttii CCM 7234 T A. simiae CCM 2807 T A. sobria CCM 4368 A. trota CCM 4359 T A. veronii bv. veronii CCM 1242 A. veronii bv. sobria CCM 4708 A. popoffii CCM 2280 A. hydrophila ssp.hydrophila CCM 4243 T A. allosaccharophila CCM 4232 T A. caviae CCM 1242 A. veronii P 1753 A. encheleia P 1767 A. encheleia P 1669 = CCM 7406 A. encheleia P 1688 = CCM 7408 A. encheleia P 1292 A. encheleia P 1700 A. encheleia P 1290 A. encheleia P 660 A. popoffii CCM 7330 A. popoffii P 666 A. popoffii P 1909 A. encheleia P 1769 A. encheleia P 658 A. popoffii P 655 A. popoffii P 667 A. popoffii 11/20

12 a.i Srovnání srovnání uvnitř rodu A. caviae A. trota A.allosaccharophila A. schuberttii A. eucrenophila A. sobria m/z

13 a.i Srovnání uvnitř rodu Vz Vz m/z

14 Srovnání mezi rody Aeromonas,Pseudomonas, Sphingomonas a.i Aeromonas bestiarum CCM 4707T Pseudomonas fluorescens CCM 2115T => Sphingomonas CCM m/z 14/20

15 a.i. 800 P 1669 Opakovaná kultivace Analýza Analýza m/z

16 MALDI MS dendrogram spektrální analýzy příbuznosti 17ti druhů rodu Aeromonas (Donohue et al., 2005) Journal of Microbiological Methods Volume 65, Issue 3, June 2006, Pages /20

17 Dendrogram příbuznosti 42 kmenů rodu Aeromonas získaný klastrovou analýzou A. schuberttii A. encheleia A. encheleia A. eucrenophila 17/20 A. bestiarum A.salmonicida A. salmonicida A.sobria A. allosacch. A.veronii bv.veronii A.veronii bv.sobria A.media A.jandaei A.hydrophila ssp.hydrophila A.caviae A.trota

18 Shrnutí Optimalizace metody na sbírkových kmenech pro identifikaci izolátů Zisk reprodukovatelných spekter z různých kultivací za stejných podmínek srovnatelné výstupy Vytvoření dendrogramu příbuznosti 46ti kmenů rodu Aeromonas pomocí klastrové analýzy Byl stanoven MS profil rodu Aeromonas 18/20

19 Výhody Srovnání s biochem., fenotypizač. a metodami MB: Vysoká rychlost a jednoduchá příprava vzorku Malý objem vzorku Reprodukovatelný výstup Rychle vyvíjející se metodika tvorby databází Možnost srovnání s informacemi sekvenování genomu, proteinů Možnost kombinace s dalšími metodami Šetření chemikáliemi 19/20

20 Poděkování RNDr. Ludmila Tvrzová, PhD. odborná pomoc při práci RNDr. Ivo Sedláček, CSc. - odborná pomoc při práci RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. konzultant, vyhodnocení spekter Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D. - analýza vzorků, vyhodnocení spekter Ing. Matej Lexa, Ph.D. statistické zpracování výsledků