Současné metody sekvenování nukleových kyselin Bakalářská práce

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Současné metody sekvenování nukleových kyselin Bakalářská práce Vedoucí práce: prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D. Vypracoval: Jiří Navrátil Brno 2017

2 ZADÁNÍ

3 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem práci na téma Současné metody sekvenování nukleových kyselin vypracoval samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb.,o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:.... podpis

4 PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych chtěl poděkovat prof. RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D, vedoucímu bakalářské práce, za odborné vedení, cenné rady, připomínky a čas, který mi byl z jeho strany poskytnut při zpracování této bakalářské práce. Dále bych chtěl poděkovat své rodině a přítelkyni Sabině, kteří mi poskytli další připomínky a korekturu k této bakalářské práci.

5 ABSTRAKT Bakalářská práce se zabývá popisem jednotlivých technik sekvenování nukleových kyselin. Na základě analýzy a syntézy poznatků z odborných zdrojů byly v teoretické části popsány charakteristiky jednotlivých metod, stručná historie, výhody a nevýhody, jejich případné modifikace a uplatnění do budoucna, přičemž zvláštní zřetel je kladen také na princip, na kterém tyto metody fungují. Speciální kapitola je vyhrazena také Projektu lidského genomu, jež je označován za největší milník v historii celého sekvenování. V praktické části byl osekvenován genom živočicha z řádu Lepidoptera. Celý proces zahrnoval extrakci DNA, její přečištění, amplifikaci, zhodnocení kvality na agarózovém gelu, sekvenaci a v neposlední řadě také analýzu výstupních dat pomocí specializovaného softwaru. Klíčová slova: DNA sekvenování, Projekt lidského genomu, Nukleové kyseliny, Amplifikace, Sekvenování nové generace. ABSTRACT The Bachelorʹs thesis deals with the description of the techniques of nucleic acids sequencing. Based on an analysis and synthesis of findings in scientific resources, the characteristics of the methods, a brief history, advantages and disadvantages, possible modifications and future applications are described in the theoretical section, whereas special reference is placed on the principle on which these methods work. A special chapter is devoted to the Human Genome Project, which is considered the greatest milestone in the history of sequencing. In the practical section, animal genome of order Lepidoptera was sequenced. The entire process included DNA extraction, its purification, amplification, evaluation of quality on an agarose gel, sequencing and, last but not least, an analysis of the output data using specialized software. Keywords: DNA sequencing, Human Genome Project, Nucleic acids, Amplification, Next-Generation Sequencing.

6 Obsah 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED První generace Maxam-Gilbertova metoda sekvenování Sangerovo sekvenování Druhá generace /Roche pyrosekvenování Solexa/Illumina SOLiD Ion Torrent DNA Nanoball HeliScope Polonator Třetí generace SMRT Oxford Nanopore Čtvrtá generace MATERIÁL A METODIKA Izolace DNA z tkání Amplifikace DNA Reakční směsi pro PCR Teplotní profily PCR Gelová elektroforéza Sekvenace DNA DISKUZE... 40

7 5.1 Diskuze k teoretické části Diskuze a výsledky z praktické části ZÁVĚR Seznam litaratury Seznam obrázků Seznam tabulek Seznam zkratek Seznam příloh Přílohy... 58

8 1 ÚVOD V historii genetiky bychom asi jen těžko hledali důležitější postavu než brněnského mnicha a vědce Johanna Gregora Mendela. Jeho práce, kterou představil v roce 1865, popisuje objev pravidel, podle kterých funguje dědičnost znaků u organismů. Definoval dědičné faktory, které dnes známe pod pojmem geny a popsal jejich různé formy, nyní označované jako alely. Jeho práce byla znovu objevena v roce 1900 a na tento rok také datujeme vznik genetiky jako vědy. Mendel je tedy označován za otce genetiky. Genetikům trvalo přibližně dalších 50 let, než se jim podařilo prokázat existenci nukleových kyselin, komplexních molekul, které se skládají z jednotlivých nukleotidů. V roce 1953 se Francisi Crickovi a Jamesi Watsonovi podařilo objasnit strukturu DNA. S informacemi, že jeden nukleotid se skládá z fosfátu, cukru a dusíkaté báze se postupně dopracovali k objevu, který jim o devět let později zajistil zisk Nobelovy ceny za lékařství. Podstatou tohoto objevu bylo popsání molekuly DNA a to, že se skládá ze dvou vláken nukleotidů, které jsou k sobě vzájemně komplementární. Objasnění struktury DNA odstartovalo novou éru genetiky a položilo další otázky. Vědci se začali zabývat pořadím jednotlivých nukleotidů, tak jak jsou v organizmu uspořádány za sebou a zjišťování tohoto pořadí dnes nazýváme sekvenování. První sekvenace DNA byla provedena před více než 40 lety a od té doby prošla tato disciplína obrovským technologickým vývojem. První velký boom lze spatřovat v podobě první generace, ve které se používaly primitivní a mnohdy i nebezpečné metody s minimálním ziskem výstupních dat. Na pomezí první a druhé generace se odehrál třetí a zatím poslední velký milník v genetice Projekt lidského genomu. Jednalo se o velice ambiciózní a poměrně drahý projekt, jehož výsledkem bylo určení sekvence přibližně tří miliard nukleotidových párů DNA člověka. Druhá generace přinesla revoluci z hlediska automatizace sekvenátorů, které byly méně závislé na lidské činnosti, a především díky výpočetní technice bylo možno zpracovat dosud neviděné množství dat. Třetí generace spočívá v sekvenování celých molekul, mnohdy bez nutnosti amplifikace. Poslední generací, o které se v poslední době hovoří, je čtvrtá generace. Ta představuje sekvenování in situ a doposud se nachází spíše v experimentální fází. Ačkoliv byla značná část genomů jak rostlinných, tak živočišných již víceméně úspěšně osekvenována, samotné sekvenování má do budoucna stále obrovský potenciál. 8

9 2 CÍL PRÁCE Cílem bakalářské práce je zpracování uceleného přehledu o současných metodách a významu sekvenování nukleových kyselin a dále také osekvenování části genomu motýla (Lepidoptera). V rámci bakalářské práce byly formulovány následující dílčí cíle: Charakterizovat jednotlivé generace sekvenování včetně nejdůležitějších metod, které pod ně spadají. Charakterizovat klady a zápory jednotlivých metod a popsat princip, na kterém tyto metody fungují, přičemž pokud je to možné, popsat i dílčí kroky. Stručně popsat Projekt lidského genomu, jakožto největšího milníku v dosavadní historii sekvenování. Diskutovat jednotlivé metody z hlediska přínosu, současného rozšíření a budoucího potenciálu. Osekvenovat vzorek tkáně neznámého motýla (Lepidoptera) a určit jeho druh. V rámci samotné sekvenace homogenizace vzorku, izolace DNA, přečištění vzorku, amplifikace, otestování přítomnosti DNA na elektroforéze a sekvenace. Zpracovat výstupní surová data pomocí specializovaného softwaru. 9

10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 První generace Takzvaná první generace sekvenování, která se objevila v 70. letech minulého století, zahrnovala dvě hlavní metody sekvenování nukleových kyselin. První z nich byla Maxam-Gilbertova metoda, objevená a pojmenovaná po amerických molekulárních biolozích Allanu M. Maxamovi a Walteru Gilbertovi (Griffiths, 2012). Dle Munshi (2012) se tato metoda nazývá také chemické sekvenování či analýza putovních bodů (z angl. wandering-spot analysis). Heather a Chain (2016) uvádějí, že se jednalo o první rozšířenou metodu a můžeme tedy zároveň s jejím publikováním datovat i vznik první generace sekvenování. Druhá byla Sangerova metoda (někdy také nazývaná jako dideoxy metoda), kterou popsal anglický biochemik Frederick Sanger (Griffiths, 2012) Maxam-Gilbertova metoda sekvenování V letech vytvořili Allan Maxam a Walter Gilbert metodu sekvenování DNA, která byla založená na chemických modifikacích a štěpení DNA ve specifických místech (Munshi, 2012). Princip metody Pro účely sekvenování jsou vyžadovány molekuly DNA, které jsou buď jednořetězcové, nebo dvouřetězcové a které jsou označeny na jednom konci pomocí radioaktivního 32 P. Může se jednak jak o 5ʹ konec, který je značen v naprosté většině případů, tak o 3ʹ konec. Restrikční fragment jakékoliv délky, který je značen na obou koncích musí projít další úpravou. Příkladem je molekula DNA ošetřená alkalickou fosfatázou, která odstraní koncové fosfáty a následně dojde ke značení 32 P pomocí transferu z γ-značených ATP s polynukleotid kinázou. Následně je na výběr ze dvou postupů: a) dvouřetězcové molekuly jsou naštěpeny druhým restrikčním enzymem, pomocí polyakrylamidového gelu rozděleny a izolovány pro sekvenaci, nebo b) je tato dvakrát značená molekula denaturována, jednotlivé řetězce rozděleny na polyakrylamidovém gelu a izolovány pro sekvenaci (Maxam a Gilbert, 1977). Po radioaktivním značení, obvykle následují různé chemické úpravy, které vedou k selektivnímu odstranění bází. Hydrazín odstraňuje báze z pyrimidinů (cytosin a thymin), zatímco hydrazín v přítomnosti vysokých koncentrací solí může odstranit pouze 10

11 báze cytosinu. Kyselina pak může být použita pro odstranění bází z purinů (adenin a guanin). Pro tyto účely je často využíván dimethylsulfát, který působí zejména na guanin a touto kyselinou je rovněž ovlivňován i adenin, avšak v daleko menší míře. Následně je použit piperidin, který štěpí fosfodiesterovou vazbu abazických míst a vznikají tak fragmenty o různých velikostech (Heather a Chain, 2015). Série takto vzniklých radioaktivních fragmentů jsou vedle sebe naneseny na polyakrylamidový gel (Munshi, 2012). Standardně je používán 8 % polyakrylamidový gel. Ale ještě před nanesením vzorků je provedena před-elektroforéza při napětí 1000 voltů (dále jen V) po dobu dvou hodin, přičemž samotná elektroforéza probíhá při napětí 200 V. Vzhledem k radioaktivnímu značení jednotlivých fragmentů pomocí 32 P je nakonec nutné gel nasnímat na rentgenový film (Maxam a Gilbert, 1977). Určení sekvence Určení sekvence z rentgenového filmu (viz obr. 1) probíhá podle následujícího postupu, kdy se začíná od spodní části levého gelu a postupuje směrem nahoru. Pokud je v prvním sloupci přítomen band, jedná se o adenin, pakliže je band přítomen ve druhém sloupci, jedná se o guanin. Bandy, které jsou vedle sebe ve třetím i čtvrtém sloupci ukazují na cytosin, pokud však chybí band ve třetím sloupci a je přítomen band pouze ve čtvrtém sloupci, jedná se o tymin. Tímto způsobem postupujeme směrem nahoru, dokud jsou od sebe jednotlivé bandy dobře rozlišitelné. Následně přejdeme na gel vpravo a pokračujeme ve čtení opět směrem vzhůru. Následná kontrola může být provedena díky komplementárním vláknům (Maxam a Gilbert, 1977). Obrázek č. 1: Autoradiografický snímek sekvenačního gelu s komplementárními řetězci 64 bp fragmentu DNA (zdroj: Maxam a Gilbert, 1977) 11

12 Maxam a Gilbert (1977) považovali za hlavní výhodu své metody jednoduchou proveditelnost a možnost celý chemický proces snadno kontrolovat. Uvedli také, že jednou z velkých výhod metody je rovnoměrné rozložení materiálu napříč sekvencí. Další výhodu spatřovali v útoku na všechny báze, což zajistí, že jsou nakonec všechny zobrazeny na rentgenovém filmu. Z dnešního pohledu je tato metoda zastaralá a až na výjimky se nepoužívá. Velkou nevýhodou této metody je zejména délka čtecího rámce, která se u původní metody pohybovala okolo 100 nukleotidů (dále jen nt). Další nevýhodou je časová náročnost a práce s vysoce nebezpečnými chemikáliemi, které vyžadují speciální zacházení. Největší nevýhodou však zůstává výskyt nekompletních reakcí, které způsobují rozšíření jednotlivých bandů. Vzhledem k elektroforetické disperzi je nutné ukončit odečet z gelu, resp. rentgenového filmu daleko dříve a nemůžeme tak získat kompletní sekvenci (França et al., 2002). Tato metoda prošla určitými inovacemi, přičemž jednou z nich bylo použití pouze jednoho sloupečku v elektroforetickém gelu (Ambrose a Pless, 1987) a další z nich byla dvousloupečková elektroforéza (Negri et al. 1981) Sangerovo sekvenování Sangerova metoda sekvenování, někdy také nazývaná jako metoda koncových terminátorů, je oproti Maxam-Gilbertově metodě efektivnější. Používá se méně toxických chemikálií a v neposlední řadě je nutné daleko menší množství radioaktivity (Munshi, 2012). Dle França (2002) je tato metoda nazývána též dideoxynukleotidová metoda. Bezpochyby se jedná o nejdůležitější metodu celé sekvenační historie. Od osekvenování genomu bakteriofága phix174 (kolem 5000 bází DNA), přes sekvenování několik megabází velkých genomů bakterií, až po skoro kompletně osekvenované genomy eukaryot včetně člověka. To jsou vše milníky, na kterých má zásluhu právě Sanger a jeho metoda (Janitz, 2008). Princip metody Celé sekvenování začíná u jednořetězcového vlákna DNA. Do blízkosti 3ʹ konce tohoto vlákna nasedá radioaktivně značený 32 P primer, který musí být dostatečně dlouhý, aby se navázal na unikátní místo v řetězci. Primer musí odpovídat známé sekvenci DNA, 12

13 buď se využívá přímo cílové sekvence, nebo častěji sekvence přilehlého vektoru (Cantor a Smith, 1999). V dalším kroku je použita DNA polymeráza, která prodlužuje řetězec, resp. primer navázaný na jednořetězcový DNA templát (Hutchinson, 2007). Při prodlužování vlákna se mohou do řetězce inkorporovat deoxynukleotid trifosfáty (dále jen dntps), nebo dideoxynukleosidtrifosfát (dále jen ddntp), který ukončí aktivitu DNA polymerázy (França et al., 2002). Blokování prodlužování řetězce je dáno zejména absencí volné 3ʹ-OH skupiny, která je nutná pro správnou funkci DNA polymerázy. Jednotlivé 2ʹ,3ʹ-dideoxynukleosidtrifosfáty, též zvané terminátory se liší pro každou bázi. Pro adenin se jedná o 2ʹ,3ʹ-dideoxyadenozintrifosfát (dále jen ddatp), pro thymin 2ʹ,3ʹ-dideoxytymidintrifosfát (ddttp), pro cytosin 2ʹ,3ʹ-dideoxycytidintrifosfát (dále jen ddctp) a nakonec pro guanin 2ʹ,3ʹdideoxyguanozintrifosfát (dále jen ddgtp). Výše uvedené 2ʹ,3ʹ-dideoxynukleosidtrifosfáty budou každý v jiné sekvenační směsi, a proto nám vzniknou čtyři různé soubory fragmentů o různých délkách, které budou zakončeny stejnými bázemi podle použitých 2ʹ,3ʹ-dideoxynukleosidtrifosfát (Snustad a Simmons, 2009). Při následné SDS-PAGE se využívá toho, že malé fragmenty putují v gelu rychleji směrem od katody k anodě a dostávají se tak níže, resp. dále, než velké fragmenty (Magdeldin, 2012). Do čtyř sloupečků jsou naneseny produkty ze čtyř reakcí v závislosti na použitém terminátoru (ddatp, ddgtp, ddttp, ddctp). Pruhy na gelu, které jsou detekovány radiograficky odpovídají různě dlouhým řetězcům, lišícím se vždy právě o jeden nukleotid. Samotné určení z radiografického snímku (viz obr. 2) je prováděno od spodní strany gelu směrem k horní straně, resp. od anody ke katodě (Snustad a Simmons, 2009). 13

14 Obrázek č. 2: Autoradiografický snímek polyakrylamidového gelu a odečet sekvence (zdroj: Sanger, 1977) Modifikace Sangerova sekvenování Další vývoj Sangerovy metody byl poznamenán dvěma technologickými průlomy. Prvním z nich byl objev z roku 1986, o který se postaral Caltech team (vedený Leroyem Hoodem) ve spolupráci s Applied Biosystems (dále jen ABI). Tato společnost vymyslela automatizovaný přístroj, který detekoval jednotlivé fluorescenčně značené terminátory (ddntps). Navíc mohly být produkty naneseny do jediné jamky, protože každý terminátor emitoval specifickou fluorescenční barvu. Druhým objevem byla v roce 1990 kombinace fluorescenční detekce s elektroforézou v kapiláře (Janitz, 2008). Human genome project a Sangerovo sekvenování V roce 1985 zorganizoval profesor Sinsheimer setkání, na kterém byla diskutována proveditelnost a přístup k osekvenování lidského genomu. Výsledkem tohoto setkání byl jeden z nejkontroverznějších a nejambicióznějších projektů v historii biologické vědy Human genome project (dále jen HGP) (Zwart, 2015). Projekt byl oficiálně zahájen 1. října 1990 Jamesem Watsonem v pozici ředitele. V roce 1992 došlo k odstoupení Watsona a jeho nahrazení Francisem Collinsem. Ve stejném roce odstoupil z HGP Craig Venter, který byl nespokojen s velkým množstvím byrokracie a mocenskou strukturou. Téhož roku založil vlastní projekt na sekvenování lidského genomu, který nazval Institute of Genomics Research, dnes známý jako společnost Celera (Zwart, 2015). 14

15 Obrázek č. 3: Očekávaný vývoj cen a dokončení sekvenování lidského genomu na konci druhé fáze (zdroj: Cantor a Smith 1999, upraveno) Historii HGP lze rozdělit do třech hlavních fází. První fáze zahrnovala především vývoj a implementaci nových metod a je datována od roku 1988, kdy James Watson nastoupil do funkce a za její konec je považována rezignace Watsona v roce Druhá fáze se odehrávala v letech 1993 až 1998, kdy byl ve funkci Watsonův následovník Francis Collins. HGP byl rozdělen do 23 přirozených podjednotek, které reprezentovaly jednotlivé lidské chromozomy. V tomto období bylo sekvenování lidského genomu v plném proudu a podílelo se na něm velké množství různě velikých laboratoří z celého světa. V roce 1998 byla přes veškerou snahu osekvenována pouze 4 % lidského genomu a cena za jednu bázi byla stále velice vysoká (viz Obr. č. 3). Téhož roku došlo k velkému zvratu a nástupu třetí fáze. Craig Venter, který upustil od Sangerova sekvenování s fluorescenčně značenými terminátory deklaroval, že dokáže se svým projektem osekvenovat lidský genom dříve než mezinárodní konsorcium pro sekvenování lidského genomu (z angl. International Human Genome Sequencing Consortium, dále jen IHGSC). Tím započala válka nebo také závod o to, kdo jako první osekvenuje lidský genom. Venter spoléhal na automatické sekvenační stroje a celogenomové shotgun metody (Zwart, 2008). Značené urychlení celého Venterova projektu nastalo díky automatickému sekvenátoru ABI PRISM 3700 od firmy PE Biosystems (dnes Applied Biosystems) (Venter, 2001). Dokončení sekvenace lidského genomu je datováno na únor roku 2001, kdy Craig Venter (2001) v časopise Science a vědci z IHGSC v časopise Nature (Lander, 2001) zveřejnili výsledky své dosavadní práce. 15

16 3.2 Druhá generace Souběžně s vývojem Sangerovy dideoxy metody se objevila nová technologie, která připravila půdu pro první DNA sekvenátory nové generace. Tato metoda se od metod první generace výrazně lišila tím, že již nevyužívala radioaktivně nebo fluorescenčně značených nukleotidů před samotnou vizualizací na elektroforetickém gelu. Místo toho využili vědci nově objevené luminiscentní metody založené na syntéze pyrofosfátu, která funguje na dvou enzymatickém procesu, ve kterém je ATP sulfuryláza využita k přeměně pyrofosfátu na ATP. Ten následně slouží jako substrát pro luciferázu, čímž je produkováno světelné záření přímo úměrné množství pyrofosfátu (Nyrén a Lundin, 1985). Tento přístup se používal k odvození sekvence pomocí měření produkce pyrofosfátu uvolněného při promytí nukleotidu přes DNA navázanou na pevnou fázi (Hayman, 1988). Tato pyrosekvenační metoda měla dle Nyréna a Lundina (1985) řadu výhod. Například bylo možné použití přirozených nukleotidů namísto silně modifikovaných dntps použitých v metodě řetězcových terminátorů a bylo možné vše pozorovat v reálném čase namísto zdlouhavé elektroforézy. Pozdější vylepšení zahrnovala navázání DNA na paramagnetické kuličky a enzymatickou degradaci neinkorporovaných dntps, která snížila potřebu zdlouhavých promývacích kroků. Pyrosekvenování bylo později patentováno biotechnologickou společností 454 Life Sciences založenou Jonathanem Rothburgem. Právě díky této firmě se jedná o první komerčně úspěšnou technologii sekvenování nové generace (dále jen NGS) (Heather a Chain, 2016). Emulzní PCR Klasická polymerázová řetězová reakce (dále jen PCR) je technika využívaná k amplifikaci malého množství templátu DNA. Technika je využívána v mnoha vědních oborech jako je molekulární biologie, biologie a fylogenetika. Nejmenší množství DNA templátu, které je k PCR potřeba je jediná molekula. V praxi je však aplikace PCR na jedinou molekulu velice složitá. Z toho důvody vzniklo mnoho různých modifikací PCR, jejichž úkolem byla amplifikace právě jedné jediné molekuly. Mezi takové metody řadíme například nested PCR, booster PCR, Homo-primer PCR, micro-tas a v neposlední řadě také emulzní PCR (dále jen empcr), která je využívána v řadě NGS metod (Nakano et al., 2003). 16

17 Ačkoliv se empcr skládá ze dvou kroků, je jednodušší než ostatní typy PCR používané k amplifikaci jediné molekuly. V prvním kroku se směs obsahující DNA templát emulguje do olejné fáze, ve které proběhne PCR. Amplifikace však proběhne pouze v kapkách, které obsahují DNA templát. V kapkách bez templátu žádná amplifikace neprobíhá. První krok končí ve chvíli, kdy jsou veškeré substráty v amplifikovaných kapkách vyčerpány. Substráty z nevyčerpaných kapek jsou následně využity v další amplifikaci. Následně se emulze centrifuguje za účelem sjednocení kapek, přičemž poté je proveden druhý krok (Nakano et al., 2003). Při empcr používané u pyrosekvenování jsou přítomny dva primery komplementární k fragmentům. Jeden je v roztoku, zatímco druhý přímo na kuličce. To usnadňuje výběr fragmentů s oběma adaptéry, A i B, a současně slouží k vyloučení fragmentů, které by měly dva adaptéry A, nebo dva adaptéry B. Vzhledem k chování Poissonova rozdělení je nemožné dosáhnout optimálního rozdělení knihovny, rovnoměrně na všechny kuličky. Ve skutečnosti bude mít pouze 1/3 kuliček poměr jedna molekula na jednu kuličku. U zbylých 2/3 budou kuličky buď bez molekul, nebo na nich bude více než jedna molekula (Buermans a Dunnen, 2014) /Roche pyrosekvenování Princip detekce pyrofosfátu, na kterém je tato sekvenační metoda založená byl poprvé popsán v roce 1985 (Nyrén a Lundin, 1985). První systém schopný sekvenace na tomto principu byl pak popsán o tři roky později (Hayman, 1988). Tato technologie byla následně zdokonalována týmem, který působil ve Stockholmu a mezi jehož členy patřili například M. Ronaghi, M. Uhlen i P. Nyrén. Nakonec byla tato technika zkomercializována a bylo možné paralelně analyzovat až 96 vzorků v jedné mikrotitrační destičce (Ansorge, 2009). V roce 2005 byl firmou 454 Life Science (později firma Roche) uveden na trh první sekvenátor nové generace. Jednalo se zároveň o první technologii NGS, která osekvenovala lidský genom. Ověření účinnosti a přesnosti této technologie proběhlo na genomu Mycoplasma genitalia, který má velikost bp. Sekvenátor osekvenoval 96 % genomu s 99,96 % přesností, to vše během jediného runu (Masoudi-Nejad, Narimani a Hosseinkhan, 2013). 17

18 Výhodou sekvenačního systému 454/Roche je délka čtení (maximálně 1 kb), což je výhodou při mapování a de novo sekvenování, či pro metagenomické aplikace. Délka runů, která se pohybuje kolem jednoho dne, je rovněž velice příznivá (roche.com, 2017). Nevýhodou je relativně nízká kapacita (1 milion čtení, 700 Mb sekvenačních dat) a především vysoká cena chemie. Dále vysoká chybovost v homopolymerech (Van Dijk et al., 2014). Největší nevýhodou tohoto systému je však to, že firma Roche ukončila v roce 2016 pro své sekvenátory podporu (roche.com, 2017). Princip metody V sekvenační metodě 454 je genomická DNA nejprve fragmentována na menší části a následně jsou krátké adaptéry ligovány na 3ʹ a 5ʹ konce jednořetězcových vláken DNA fragmentů. Tyto DNA fragmenty z obou stran pokryté adaptéry jsou následně smíchány s malými, streptavidinem potaženými kuličkami, které mají asi 28 µm v průměru (Masoudi-Nejad, Narimani a Hosseinkhan, 2013). Kuličky jsou obvykle z agarózy a na jejich povrchu jsou oligonukleotidy, které jsou komplementární ke specifickým sekvencím adaptérům na fragmentech (vždy k jednomu), takže každá kulička asociuje s jedním fragmentem (Mardis, 2008). Následuje emulzní PCR, při které jsou vodní kapky obsahující kuličky a PCR reaktanty vloženy do oleje. Amplifikace je nezbytná pro získání dostatečně intenzivního světelného signálu při detekci v následujících krocích (Ansorge, 2009). Po skončení emulzní PCR jsou jednotlivé kuličky, obsahující miliony amplifikovaných fragmentů, preinkubovány v DNA polymeráze. Následně jsou jednotlivé kuličky umístěny do jamek na speciální destičce. Jamky jsou navrženy tak, aby do každé z nich mohla být umístěna maximálně jedna z kuliček. Poté jsou jamky zaplněny velkým množství malých, přibližně 1 µm velkých kuliček. Tyto kuličky nesou enzymy sulfurylázu a luciferázu, jež jsou nutné pro pyrosekvenaci. Následná centrifugace zajistí, že jsou všechny enzymy v těsném kontaktu s kuličkou pokrytou DNA fragmenty. Samotné pyrosekvenování je pak zahájeno postupným přidáváním čtyř nukleotidů (Masoudi-Nejad, Narimani a Hosseinkhan, 2013). Inkorporace každého nukleotidu vyvolá proces uvolnění anorganického pyrofosfátu (dále PPi) v množství, které je přímo úměrné počtu inkorporovaných nukleotidů. ATP sulfuryláza kvantitativně převede PPi na ATP za přítomnosti APS. Generovaná ATP pohání luciferázu, která umožňuje přeměnu luciferinu na oxyluciferin. Tím je uvolněno vi- 18

19 ditelné světlo, jehož intenzita je přímo úměrná množství ATP. Generované a zaznamenané světlo je reprezentováno pomocí různých píků v pyrogramu, který je shodný s elektroforeogramem v dideoxy sekvenování. Každý pík je přímo úměrný množství inkorporovaných nukleotidů. Například tři inkorporované dgtp nukleotidy budou zaznamenány jako trojnásobně vysoký pík. Apyrása je nukleotid-degradující enzym, který nepřetržitě degraduje ATP a neinkorporované dntp v reakční směsi. Mezi jednotlivými inkorporacemi je časový interval přibližně jedné minuty, umožňující degradaci ATP. Tím je zajištěno, že v jeden moment se inkorporuje právě jeden nukleotid (Gharizadeh, Mehran a Nyrén, 2007) Solexa/Illumina Další milník v sekvenování nové generace se datuje k roku 2006, kdy byl na trh uveden druhý masivně paralelní sekvenační systém. Technologie je založená na SBS a využívá čtyřbarevné reversibilní terminační nukleotidy. Tato technika byla poprvé popsána v roce 2001 malou firmou Solexa, která byla později odkoupena firmou Illumina, pod jejíž značkou se přístroje prodávají dodnes (Stranneheim a Lundeberg, 2012). Historie samotné technologie však začala již v polovině devadesátých let minulého století. Vědci Shankar Balasubramanian a David Klenerman, tehdy využívali fluorescenčně značené nukleotidy k pozorování pohybu polymerázy na úrovni jediné molekuly, při syntéze DNA imobilizované k povrch. Vzhledem k tomu, že Univerzita měla bohatou historii v oblasti výzkumu DNA a působilo zde i mnoho světových vědců jako byli Todd, Watson, Crick nebo Sanger. To přivedlo Balasubramaniana a Klenermana k myšlence využití jejich přístupu při sekvenování. Řada diskuzí a pokusů vedla v roce 1997 k přístupu zvanému sekvenování syntézou SBS, na kterém je celé Illumina sekvenování postavené (illumina.com, 2017). Nespornou výhodou Illumina sekvenování je jeho vedoucí pozice na trhu NGS. Díky tomuto faktu je naprostá většina protokolů pro přípravu knihoven kompatibilní právě s tímto systémem. Dále nabízí Illumina nejvyšší kapacitu sekvenování a nejnižší cenu za osekvenovanou bp. Délka čtení až 300 bp je navíc kompatibilní s většinou aplikací. Nevýhodou Illumina sekvenování je technická náročnost nanášení vzorku, to je dáno náhodným rozptylem klastrů napříč celou reakční komůrkou a koncentrace tedy musí být důsledně kontrolována. Příliš velká koncentrace a překrývající se klastry zapříčiní špat- 19

20 nou kvalitu vygenerované sekvence. Dalším problémem je požadavek na sekvenční komplexnost. Vzorky s nízkou komplexností jako jsou například 16S metagenomické knihovny musí být zředěny nebo smíchány s refereční PhiX knihovnou pro vytvoření diverzity (Van Dijk et al., 2014). Princip metody Celý proces SBS začíná přípravou vzorku, která obvykle zahrnuje několik kroků. Vše začíná extrakcí a purifikací DNA z tkání nebo jiných vzorků, následuje fragmentace DNA, oprava roztřepených konců, přidání adaptérů s ligázami nebo transferázami pro připojení k pevné fázi, připojení polymerázy a klonální amplifikace DNA, která vygeneruje až milióny identických kopií molekul DNA vázaných na povrchu komůrky (Fuller et al., 2009). Příprava knihovny je klíčovým prvkem pro Illumina sekvenování. Samotná společnost nabízí na svých stránkách řadu protokolů, které jsou určeny jak pro malé laboratoře, které chtějí sekvenovat pouze určité úseky genomů, tak pro velké laboratoře, zabývající se celogenomovým sekvenováním. Nabízeny jsou například protokoly pro přípravu knihoven pro metody jako jsou celogenomové sekvenování, celotranskriptomové sekvenování, cílené DNA a RNA sekvenování a mnoho dalších. Je možné použití mnoha druhů vzorků jako jsou buněčné linie, krve, čerstvé tkáně, tkáně zalité v parafínu, vzorky fixované formalinem aj. (illumina.com, 2017). Shendure a Hainlee (2008) však uvádějí, že knihovny je možné konstruovat jakýmkoliv způsobem, jehož výsledkem je vytvoření fragmentů s napojenými adaptéry. Tyto adaptéry umožní připojení fragmentů na komůrku, na které proběhne můstková (angl. bridge) PCR. Můstková amplifikace Můstková amplifikace je reakce probíhající na povrchu reakční komůrky. V prodeji jsou obvykle již hotové a upravené komůrky, které jsou osázeny dvěma různými oligonukleotidy, které jsou komplementární k adaptérům na fragmentech a obvykle jsou značeny jako p5 a p7. 20

21 V prvním kroku můstkové PCR je sekvenační knihovna, s jednořetězcovými fragmenty a připojenými adaptéry, které jsou naneseny na povrch reakční komůrky. Jednotlivé fragmenty se následně napojí ke svým komplementárním oligonukleotidům. V dalším kroku se jednotlivé fragmenty ohýbají a jejich druhé adaptéry nasedají na své komplementární oligonukleotidy. Při tomto ohybu vytvářejí fragmenty tzv. most, proto můstková PCR. Cyklické opakování denaturace, annealing a elongace, podobně jako u klasické PCR, vede k tvorbě klastru, tedy miliónů kopií jediné molekuly v reakční komůrce. Tento proces známý též jako klastrování probíhá automaticky v části přístroje zvané cbot TM, nebo ve speciálním klastrovacím modulu (illumina.com, 2017). Při samotném sekvenování je čten vždy pouze jeden nukleotid z fragmentu, během opakujících se cyklů. Během těchto cyklů se fluorescenčně značené dntp začleňují do rostoucího řetězce. Každý ze čtyř dntp (A, C, T, G) má specifickou fluorescenční značku, která slouží k jeho identifikaci a chová se jako reverzibilní terminátor, který zabraňuje inkorporaci více nukleotidů zaráz. Po snímání se fluorescenční skupina odštěpí, reverzibilní terminátor deaktivuje a templátové řetězce jsou připravené na cyklus další inkorporace. Sekvence je čtena pomocí mnoha fluorescenčních signálů při prodlužování řetězce v každém klastru. Během sekvenování však může dojít k předběhnutí nebo zpoždění inkorporujících se dntp. Během několika cyklů se tyto chyby nastřádají a může dojít ke snížení signálu a zvýšení šumu, který snižuje kvalitu čtení (Buermans a den Dunnen, 2014). Vývoj a portfolio sekvenátorů Illumina V roce 2008 představila společnost Illumina, vylepšenou verzi (Genome Analyzer II) svého předchozího přístroje. Tento sekvenátor má až trojnásobný výkon ve srovnání s původní verzí. Byl zaveden par-end modul, nová optika a komponenty kamer, které umožňují snímat DNA klastry daleko efektivněji a na větších plochách. Přístroj zvyšuje množství výstupních dat z 1 Gb na 3 Gb za jeden run, přičemž je snímáno přes padesát milionů čtení z jediné komůrky. Doba trvání jedné třiceti šesti cyklové analýzy byla snížena na dva dny pro single-read a čtyři dny pro paired-end (Ansorge, 2009). V současné době, o takřka deset let později, je tento sekvenátor dávno překonán. Illumina nabízí celé řady sekvenátorů jako například MiniSeq, MiSeq, NextSeq, HiSeq, Hi- Seq X či NovaSeq. Jednotlivé přístroje se liší svým zamřením. Přístroj MiSeq FGx nachází své uplatnění v kriminalistice či testování mitochondriální DNA, NextSeq

22 v oblasti cytogenetických studií a cíleného resekvenování. Řada MiniSeq má dobu sekvenace 4-24 hodin a maximální výstup 7,5 Gb, i to se však může zdát málo v porovnání s řadou NextSeq, která je schopná do 30 hodin osekvenovat 120 Gb při 400 milionech čtení (illumina.com, 2017). V letošním roce zveřejnila společnost Illumina svůj záměr na tvorbu nových sekvenátorů řady NovaSeq a zároveň uvedla, že s jejich nástupem se cena za osekvenování kompletního lidského genomu sníží až na 100$ (Herper, 2017). Lee et al. (2016) uvádí, že nejnovější technologie sekvenování a řadu sekvenátorů TruSeq od společnosti Illumina, je již možné zařadit do třetí generace sekvenování SOLiD Prototyp této sekvenační metody byl vyvinut na Harvarské univerzitě a Lékařském institutu Howarda Hughese a publikován v roce O dva roky později byl sekvenátor SOLiD, který funguje na tomto principu, uveden na trh. V té době se jednalo teprve o třetí vysokokapacitní sekvenátor uvedený na (již tehdy) vysoce konkurenční trh (Kircher a Kelso, 2010). Název Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection (zkráceně SOLiD) je možné přeložit jako sekvenování pomocí ligace oligonukleotidů a detekce (Türktaş, 2015). Metoda původně spadala pod firmu Agencourt Personal Genomics, která byla následně odkoupena firmou Applied Biosystems a v současné době je součástí firmy Life Technologies sídlící v Kalifornii (Masoudi-Nejad et al., 2013). Výhodou systému je, že má druhou největší kapacitu na trhu, hned za systémem Illumina. Dále je SOLiD považován za systém s nejmenším počtem chyb čtení, přičemž přesnost je přibližně 99,94 %. Tato vyšší přesnost v porovnání s ostatními sekvenátory je dána zejména tím, že každá báze je čtena dvakrát. Buermans a den Dunnen (2014) uvádějí, že přidáním dalšího re-primingového cyklu by bylo možné tuto přesnost teoreticky ještě zvýšit. Na rozdíl od ostatních metod, SOLiD využívá DNA ligázu a specifický postup pro sekvenování amplifikovaných fragmentů. V přístroji jsou dvě reakční komůrky, resp. skleněné destičky, které mohou být dále rozděleny na několik částí. Délka čtení je obvykle bp a výnos jednoho runu je 2-4 Gb DNA sekvencí dat (Mardis, 2008). 22

23 Naopak nevýhodou systému jsou krátká čtení, jejichž maximum se pohybuje na 75 nukleotidech a zároveň relativně dlouhý čas nutný k sekvenování. Systém SOLiD není příliš vhodný pro de novo sekvenování a vzhledem k tomu, že je daleko méně rozšířený než například konkureční Illumina, existuje pro něj daleko méně kitů a protokolů (Van Dijk et al., 2014). Systém SOLiD je stejně jako systém Illumina schopný generovat paired-endová čtení. Nicméně kvůli principu sekvenování pomocí ligace je maximální délka čtení omezena na výše uvedených 75 bází pro čtení 1 a 35 bází pro čtení 2. Ačkoliv je celkový počet čtení srovnatelný se sekvenátorem Illumina HiSeq, celkový výstup v Gb za jeden run je pouze poloviční, vzhledem ke kratším délkám čtení (Buermans a Dunnen, 2014). Princip metody Příprava in vitro sekvenační knihovny pro metodu SOLiD zahrnuje fragmentaci vzorku DNA na požadovanou velikost, opravu konců a ligaci P1 a P2 adaptéru na konce jednotlivých fragmentů (Valouev et al., 2008). Specifický proces napojí adaptéry obklopené fragmenty se speciálními 1 µm velkými, paramagnetickými kuličkami. Ty jsou pokryty oligonukleotidy, jež jsou komplementární k adaptérům na koncích DNA fragmentů. V následujícím kroku je použita empcr k amplifikaci fragmentů na jednotlivých kuličkách. Po amplifikaci jsou kuličky kovalentně naneseny na skleněnou destičku, která je následně umístěna na fluidní kazetu v sekvenátoru. V systému SOLiD jsou takovéto skleněné destičky dvě. Jedna přijímá sekvenační reaktanty a druhá je snímána (Mardis, 2008). Veškerá chemie v sekvenační technologii SOLiD je založena na ligaci. Sekvenční primer je hybridizován na adaptér P1 na imobilizované kuličce a pool unikátně značených oligonukleotidů obsahuje všechny možné varianty komplementárních bází pro templátovou sekvenci. Při sekvenování metodou SOLiD dochází ke čtení DNA přes spletité schéma sekvenování pomocí ligace. Po připojení kuliček s templátem na reakční komůrku dochází nejprve k hybridizaci primeru, který je komplementární k adaptéru a následuje hybridizace oktamerových sond. První dva nukleotidy těchto sond reprezentují šestnáct dinukleotidových kombinací. Báze 3-5 jsou degenerované a báze 6-8 rovněž degenerují a obsahují fluorescenční barvivo pro identifikaci báze jedna a dva. Čtyři různé kombinace dinukleotidů jsou značeny stejnou flourescenční značkou. Díky použití čtyř různých fluorescenčních skupin, je možné označit všech šestnáct dinukleotidových značek (Buermans a den Dunnen, 2014). 23

24 Jak již bylo řečeno výše, tyto detekční oligonukleotidy jsou hybridizovány k templátu a dokonale nasedající sekvence se ligují k primeru. Po snímání jsou nesyntetizovaná vlákna odmyta a fluorofory jsou odstraněny. Další cyklus začíná pět bazí po vláknu směrem od místa nasedání primeru. Po sedmi takových sekvenčních cyklech je první primer odstraněn a na řadu přichází druhý primer. Ten začíná na místě n-1 a je hybridizován k templátu. Nakonec je všech pět sekvenačních primerů (n, n-1, n-2, n-3 a n-4) využito pro sekvenaci. Ve finále je inzert sestávající ze 35 bazí osekvenován dvakrát, což zvyšuje kvalitu čtení (Myllykangas, Buenrostro a Ji, 2012). Vzhledem k tomu, že metoda založená na ligaci v systému SOLiD vyžaduje komplexní panel značených oligonukleotidů a sekvenační proces probíhá přes relativně hodně kroků, je interpretace surových dat značně komplikovaná (Valouev et al., 2008). Myllykangas, Buenrostro a Ji (2012) podotýkají, že právě díky této složitosti a sekvenování každé báze dvakrát, dosahuje SOLiD tak přesných výsledků Ion Torrent Tato metoda sekvenování je v podstatě totožná s metodou 454/Roche. Hlavním rozdílem je, že se při inkorporaci nukleotidu neuvolní pyrofosfát, ale proton (Van Dijk et al., 2014). Dle Rothberga et al. (2011) se jedná se o první sekvenační metodu, která nevyžaduje žádnou optickou techniku, speciálně upravené nukleotidy či enzymy. Polovodičové sekvenování, jak je tato metoda také nazývána, představuje cenově dostupný a rychlý způsob sekvenování. Systém Personal Genome Machine (dále jen PGM) využívá řadu polovodičových čipů, které jsou schopné zaznamenat inkorporovaný nukleotid pomocí detekce změny ph, která nastane při uvolnění vodíkových iontů (dále protonů) z přirozených nukleotidů (Rodríguez-Epeleta, Hackenberg a Aransay, 2012). Hlavní výhodou této sekvenační metody je absence optického systému, který je obvykle velice nákladný a sběr dat pomocí něj časově náročný. Další kladem je využití nemodifikovaných nukleotidů, což umožňuje připojení více než jedné báze v případě po repetitivních oblastí. Generovaný signál se nezvyšuje dokonale lineárně s množstvím připojených bází. Stejně tak je tomu i v případě klasického pyrosekvenování s metodou 454/Roche, kde je těžké správně sekvenovat homopolymery delší než sedm bází. Další výhodou tohoto typu pyrosekvenování je rychlost. Během dvou až tří hodin je PGM schopný vygenerovat až 24

25 jednu gb dat s až pěti a půl miliony čtení a průměrnou délkou čtení 200 bp. Celkový objem sekvenování je do budoucna odhadován na stovky gb při více než tří set milionech čtení a průměrnou délkou čtení 200 bp. Množství dat, které bude Ion Torrent schopný osekvenovat, bude přímo úměrné kvalitě a vývoji nových čipů (Morey et al., 2013). Velikost fragmentů, které je možné touto metodou sekvenovat byla nejprve 100 bp a následně byla vylepšena až na 400 bp (Masoudi-Nejad et at., 2013). Princip metody Fragmenty o průměrné délce 200 bp jsou pomocí adaptérů napojeny na kuličky a amplifikovány pomocí empcr. Po dokončení amplifikace jsou vybrány kuličky, které obsahují amplifikovanou DNA naneseny na sekvenační čip. Kuličky, které jsou prázdné jsou odstraněny (Buermans a den Dunnen, 2014). Nejprve je čip s DNA templátem zaplaven prvním nukleotidem, například adeninen. Pokud dojde k jeho inkorporaci do DNA vlákna, uvolní se vodíkový ion, jehož náboj změní ph roztoku. Tato změna je detekována citlivým tranzistorem umístěným pod jamkami a je zaznamenána jako změna napětí pomocí vrstvy iontů na tomto tranzistoru. Toto napětí je zobrazeno ve formě peaků. Přes několik kroků tedy dochází k převodu chemického signálu (ph) na digitální informaci zobrazenou na výstupním zařízení. Čip se postupně zaplavuje jedním nukleotidem za druhým. Pokud nedojde k inkorporaci po přidání nukleotidu, pak není zaznamenána žádná změna napětí, a v důsledku toho nebude zaznamenána žádná báze. V případě, že jsou v řetězci přítomny dvě po sobě jdoucí, stejné báze na DNA vlákně, napětí bude dvojnásobně silné a v důsledku toho budou zaznamenány dvě báze (Masoudi-Nejad et at., 2013). Obrázek č. 4: Záznam inkorporace nukleotidů u metody Ion Torrent (zdroj: 0%94-when-watson-meets-moore/, upraveno) 25

26 3.2.5 DNA Nanoball Systém CGA, jak je tato sekvenační metoda také nazývána je od společnosti Complete Genomics. Jedná se o první vysokokapacitní sekvenační technologii, která je pro veřejnost dostupná pouze jako služba a její stroje není možné zakoupit. CGA technologie je založena na přípravě kruhových DNA knihoven a na tzv. amplifikaci valivého kruhu, angl. rolling circle amplification (dále RCA). Pomocí RCA jsou generovány DNA nanokuličky, které jsou uspořádány na pevném nosiči (Drmanac et al., 2009). Firma Comeplete genomics, původně založená v roce 2006, byla v roce 2013 odkoupena čínskou firmou Beijing Genomics Institute. Velkou výhodou oproti ostatním sekvenačním metodám je to, že pozdější cykly nejsou nijak závislé na těch předchozích. Pokud tedy jeden cyklus selže, interpretace ostatních bází v DNB není nijak ovlivněna (completegenomics.com, 2017). Naopak hlavní nevýhodou tohoto systému je délka čtení, která je limitována přípravou vzorku (Rodríguez-Ezpeleta, Hackenberg a Aransay, 2012). Dle Moreyho et al. (2013) je další nevýhodou množství PCR cyklů, které je při této sekvenační metodě nutné provést. Princip metody Nejprve je vzorek DNA fragmentován na fragmenty o velikosti bp. Následně jsou na oba konce DNA fragmentů napojeny univerzální adaptory, které jsou označované jako Ad1L a Ad1R. Vzorek projde amplifikací společně s Ad1 komplementárními primery a je stočen do kruhu. Tento produkt je pak zpracován restrikčním enzymem, který interně z Ad1R naseká 13 bp a udělá produkt opět lineárním. Následují tři opakování, během kterých se připojují adaptéry k nově vzniklým fragmentům, na ty následně působí restrikční enzym a vzorky se opět stáčejí do kruhu. Konkrétně dochází k napojení adaptérů Ad2L a Ad2R, jež se opět napojí na konce nově vzniklých fragmentů, vzorek je zpracován restrikčním enzymem 13 bp od Ad2L a linearizován. Tento postup se zopakuje ještě s adaptéry Ad3L a Ad3R, přičemž použitý restrikční enzym EcoP15 naseká DNA v 26 bp od místa adaptéru Ad3L a 26 bp od adaptéru Ad2R. V posledním kroku, při přípravě vzorků pro CGA, jsou přidány adaptéry Ad4L a Ad4R a je provedena PCR, produkty se opět dostávají do kruhové formy, ale na rozdíl od předchozích kroků nejsou linearizovány. Takový vzorek je opět amplifikován, tentokrát pomocí RCA za použití DNA Phi29 polymerázy. Vzhledem k adaptérům, Ad1, Ad2, Ad3 a 26

27 Ad4, které byly přidávány v průběhu celého procesu přípravy vzorku, vzniká na vlákně mnoho palindromických sekvencí. V důsledku těchto palindromů se nové vlákno zhroutí samo na sebe a vytvoří DNA kuličku o průměru přibližně 300 nm. DNA nanokuličky se však nemohou vázat samy na sebe (Morey et al., 2013). Fluidní komůrka CGA sytému je pokryta hexamethyldisilazanem (HDMS), který inhibuje navázání DNA. Pozitivně nabitý aminosilane váže negativně nabité DNBs. Náhodně uspořádané a husté pole na sobě má asi 350 milionů imobilizovaných DNBs s průměrným odstupem 1,29 µm mezi jejich středy. Systém CGA využívá pro sekvenování novou metodu zvanou cpal (combinatorial probe anchor ligation). Celý proces začíná hybridizací mezi unikátním adaptérem a kotevní molekulou. Čtyři degenerované 9-merové oliogonukleotidy jsou značené specifickou sondou, která odpovídá danému nukleotidu - A, C, G nebo T, na první pozici v sondě. Samotné určení sekvenace probíhá v rekci, ve které je správná sonda hybridizována k templátu a ligována ke kotvě za použití T4 DNA ligázy. Po nasnímání ligovaných produktů jsou molekuly obsahující sondu s kotvou denaturovány. Celý proces hybridizace, ligace, snímání a denaturace se opakuje celkem pětkrát, pokaždé s použitím nových fluorescenčně značených sond, které obsahují známe báze v n+1, n+2, n+3 a n+4 pozicích. Po těchto pěti ligačních cyklech se přesnost značně snižuje a sekvenování pokračuje za použití kotvy s degenerovanou oblastí pěti bazí. Pak je provedeno dalších pět sekvenačních cyklů. Celkově může být cyklické sekvenování opakováno až osmkrát, vždy za použití unikátních kotev. Celý tento proces vyústí v bází dlouhé čtení z každé nanokuličky (Rodríguez-Ezpeleta, Hackenberg a Aransay, 2012) HeliScope Původně byl princip této metody popsán již v roce Tehdy se jednalo o jednu z prvních metod pro sekvenování z jediné molekuly DNA (Braslavsky et al., 2003). Nyní je tento typ sekvenování znám jako True Signle Molecule Sequecning (dále tsms). Od roku 2007 spadá pod firmu Helicos BioSciences, která k tomuto sekvenování získala licenci (Milos, 2008). První sekvenátor HeliScope se prodal v březnu roku Na konci prvního čtvrtletí roku 2009 byly prodány pouze čtyři kusy těchto sekvenátorů, což bylo celkem zvláštní, vzhledem k tomu, jaké výhody tsms poskytuje. Na druhou stranu se však jednalo o zcela logický fakt, který odrážel jak cenu přístroje, tak jeho omezení. Navíc v době, kdy byl 27

28 tento sekvenátor uveden na trh, byla většina pracovišť již vybavena jinými NGS sekvenátory (Kircher a Kelso, 2010) Tato technologie nyní spadá pod společnost SeqLL, založenou v roce 2013, která převzala společnost Helicos BioSciences poté, co firma v roce 2012 zbankrotovala. SeqLL plánuje v polovině roku 2017 obnovit komerční prodej strojů HeliScope, přičemž nové přístroje by měly být lehčí, vylepšené z funkčního hlediska, ale především cenově dostupnější (Karow, 2016). Specifickým aspektem, kterým se tento systém odlišuje od ostatních, je absence klonální amplifikace v průběhu procesu přípravy knihovny. Na místo toho je využit vysoce senzitivní fluorescenční detekční systém k přímému určení sekvence jednotlivých DNA molekul. Jako již v některých předchozích metodách i zde je využíváno SBS (Shendure a Hainlee, 2008). Van Dijk et al. (2014) dodává, že právě absence amplifikace řadí tuto metodu na pomezí druhé a třetí generace sekvenování. Délka čtení se pohybuje mezi 24 a 70 nt, což je méně než u ostatních systémů. Větší množství paralelně získaných sekvencí zaručuje kapacitu okolo 4150 Mb za den s průměrnou cenou 0,33$ za Mb. Chybovost se pohybuje v desetinách až jednotkách procent a je o něco vyšší než u konkurenčních systémů (Kircher a Kelso, 2010). Výhodou této metody je potenciál číst extrémně dlouhé sekvence a vysoká rychlost sekvenování. Další výhodou této metody je absence amplifikace (Zhang et al., 2011). Absence amplifikace má však i své nevýhody. Vzhledem k sekvenování vždy pouze jediné unikátní molekuly a vzhledem k tomuto faktu neexistuje možnost, jak opravit špatnou inkorporaci. Navíc jsou molekuly připojeny k reakční komůrce pouhou hybridizací a hrozí tak, že v průběhu několikerých omývacích kroků dojde k jejímu odplavení. V neposlední řadě mohou být molekuly ireversibilně terminovány inkorporací špatného nukleotidu (Kircher a Kelso, 2010). Další nevýhodou tohoto systému byla vysoká pořizovací cena, pohybující se nad hranicí jednoho milionu dolarů a vysoká cena za chemii. Signifikantní nevýhodou je, že tento systém nemá v současné době podporu a neprodává se (Karow, 2016). 28

29 Princip metody Pokud má zkoumaná molekula DNA více než 1000 nt, je vhodné ji fragmentovat na úseky velké přibližně nt, abychom maximalizovali účinnost (Thompson a Steinmann, 2010). Následně na každý z konců takto vzniklých fragmentů nasysntetizujeme, pomocí polyadenylát polymerázy, dva poly-a-konce, které mají funkci adaptérů. V posledním kroku polyadenilace je přidán fluorescenčně značený adenin (Kircher a Kelso, 2010). Takto připravené molekuly jsou zachyceny na speciální reakční komůrku, která je pokryta oligo-dt-50 oligonukleotidy. Tyto oligonukleotidy jsou následně zality dttp a polymerázou, která zajistí, že žádný poly-a-konec nezůstane volný. V dalším kroku jsou přidány fluorescenčně značené Virtuální terminátorové nukleotidy (dctp, dgtp, datp), které mimo jiné zabraňují nežádoucímu prodlužovaní řetězce. Tento krok je nazýván fill and lock neboli vyplnit a uzamknout a zajišťuje, že každý templát je při následné SBS k dispozici. Po provedení těchto nezbytných kroků přichází na řadu samotné sekvenování. Na reakční komůrku jsou postupně aplikovány fluorescenčně značené nukleotidy, které se inkorporují za pomoci DNA polymerázy vždy, když k sobě mají komplementární bázi. Neinkorporované nukleotidy musí být vždy odmyty. Povrch reakční komůrky je pak osvětlen laserem a případná inkorporace se projeví jako emitované světlo. Sekvenátory HeliScope používají pro tuto detekci citlivé CCD kamery a jsou schopny zaznamenat přesnou pozici, číslo cyklu a jednotlivá vlákna. Po snímání jsou koncové části odštěpeny a tento cyklus se opakuje (Hart et al., 2010). Při tomto procesu nedochází k prodloužení každé molekuly v každém cyklu, a proto hovoříme o tzv. asynchronním sekvenačním procesu (Kircher a Kelso, 2010). 29

30 Obrázek č. 5: Snímek z reakční komůrky HeliScope (zdroj: Hart et al., 2010) Polonator Technologie Polonator je metoda paralelního sekvenování, které využívá sekvenování pomocí ligace, náhodně uspořádané kuličky na pevném podkladu a empcr (Zhang et al., 2011). Tato metoda byla veřejnosti představena doktorem Churchem a jeho týmem z Harvardské univerzity (Masoudi-Nejad et al., 2013). V roce 2008 začal Church a jeho tým společně s firmou Dover Systems prodávat sekvenační přístroj, jež byl v podstatě upravený systém SOLiD, s cenou okolo $ (Kircher a Kelso, 2010). Tento první sekvenátor firmy Dover Systems nesl název Polonator G.007. Jednalo se o velice výkonný přístroj s nízkou cenou a především volně stažitelným open-source softwarem a sekvenačními protokoly (Morey et al., 2013). Délka čtení je 26 bp a během jediného runu je přístroj schopný vygenerovat 8-10 Gbp sekvenčních čtení (Zhang et al., 2011). Výhodou tohoto systému je jeho přesnost, pořizovací cena a cena přibližně 1 $ za osekvenovanou Mb. Nevýhodou tohoto systému jsou krátké délky čtení (Shendure a Hanlee, 2008), přičemž za další negativum lze považovat to, že jakákoliv podpora pro tento systém skončila, internetové stránky již neexistují a přístroj se nedá koupit. 30

31 Princip metody Zkoumaná DNA je nejprve fragmentována na úseky o velikosti přibližně 1 kb. Po zarovnání konců těchto fragmentů jsou na jejich 3ʹ připojeny. Takto připravené fragmenty jsou pomocí T30 oligonukleotidů stočeny do kruhu. T30 oligonukleotidy mají dvě rozpoznávací místa pro restrikční enzym Mme1. Proběhme RCA a stočená a amplifikovaná DNA je Mme1 naštěpena ve vzdálenosti bp za rozpoznávacím místem. Výsledkem tohoto procesu je fragment o velikosti přibližně 70 bp. K jejich 3ʹ a 5ʹ jsou připojeny PCR primery a následně je provedena empcr. Kuličky, které nesou amplifikovanou DNA, jsou připojeny na reakční komůrku, na které probíhá samotné sekvenování. Reakční komůrka je postupně zaplavována směsí primerů, které se mohou připojit buď na 3ʹ nebo na 5ʹ konce dvou 18 bp oligonukleotidů. Celkově jsou pro ně tedy možné čtyři různé pozice. Reakční komůrka je následně zaplavena T4 DNA ligázou a směsí fluorescenčně značených nonamerů. V každém z těchto nonamerů odpovídá jedna pozice jednomu fluorescenčnímu barvivu, které je k němu navázané, například 5ʹ Cy5-NNNNNNNNT, 5ʹ Cy3-NNNNNNNNA, 5ʹ TexasRed-NNNNNNNNC, 5ʹ 6FAM-NNNNNNNNG. Fluorescenční signál pak vzniká při ligaci mezi ukotveným primerem a odpovídajícím nonamerem. Po nasnímání signálu dojde k odstranění komplexu primer-nonamer a ligázy. Tím může začít nový cyklus sekvenování s novou směsí nonamerů, ve které mají nonamery posunutou pozici fluorescenčních značek o jednu pozici a to: 5ʹ Cy5-NNNNNNNTN, 5ʹ Cy3-NNNNNNNAN, 5ʹ TexasRed-NNNNNNNCN, 5ʹ 6FAM-NNNNNNNGN. Jednotlivé pozice mohou být přesně určeny díky tomu, že odstup mezi DNA ligázou a ligačním místem je přesně 7 bází ve směru 5ʹ 3ʹ a 6 bází ve směru 3ʹ 5ʹ. Celkově tedy dostáváme výše zmíněnou délku čtení 26 bp (Masoudi-Nejad et al., 2013). 3.3 Třetí generace Lee et al. (2016) hovoří o třetí generaci DNA sekvenování (dále TGS z angl. thirdgeneration sequencing) a mapování jako o renesanci v genomovém sekvenování. Uvádí, že na rozdíl od druhé generace, která produkuje pouze několik set pb dlouhá čtení, je třetí generace schopná generovat přes bp čtení, nebo mapovat molekuly větší jak bp. 31

32 Ačkoliv jsou přístroje ze druhé generace v současné době těmi nejpoužívanějšími, trpí řadou omezení jako jsou například vysoká cena, amplifikace a časová náročnost. To jsou jedny z hlavních důvodů, proč se v poslední době aktivně pracuje na tzv. třetí sekvenační generaci. Systémy ze třetí generace se odlišují zejména absencí amplifikace, čímž je z velké části přeskočena nutnost přípravy knihovny, která se nyní skládá pouze z napojení adaptérů. Samotné sekvenování probíhá pomocí detekce inkorporovaných nukleotidů. Tato detekce může být provedena různými technikami jako je fluorescenční, jednomolekulová v reálném čase (dále SMRT z angl. single-molecule real time), polovodičová nebo pomocí nanopórů. Právě technologie založená na sekvenování pomocí nanopórů je vyvíjena několika firmami, které soutěží jednak v kvalitě a jednak v komerčním uvedení svých sekvenátorů na trh. Jednou z takových firem je Genia Technologies, v současné době spadající pod firmu Roche, která slíbila prodej sekvenačních čipů v ceně pohybující se okolo 100 $. Další firmou, která se v současnosti nanopóry zabývá je společnost Oxford Nanopore Technologies, která v rámci jejich MiniION Access Programu umožňuje laboratořím testovat jejich sekvenátory a podílet se na jejich vývoji a vylepšení (Ari a Arikan, 2016). Autoři McGinn a Gutt (2013) naopak uvádějí, že jedinou technologií, která splňuje kritéria vymezená pro sekvenování třetí generace jsou nanopóry. Podle Bleidorna (2015) patří do třetí generace sekvenování technologie SMRT a Oxford Nanopore. Lee et al. (2016) doplňuje předchozí autory a ve své práci zahrnuje do třetí generace sekvenování také technologii Illumina TruSeq. Mezi hlavní výhody sekvenování třetí generace tedy patří dlouhé délky čtení, které mohou dosahovat v průměru až 14 kb, vysoká kapacita, absence potřeby amplifikace, možnost detekovat a rozlišovat mezi bázemi, které prošly určitým druhem modifikace a v neposlední řadě také snahu o zmenšování sekvenátorů. Nevýhodou je vysoká chybovost a také zaměření přístrojů na sekvenování dlouhých fragmentů, což komplikuje sekvenování těch kratších (LeBlanc a Marra, 2015) SMRT Metoda Single Molecule Real-Time byla vyvinuta v roce 2009 firmou Pacific Biosciences a principem je pozorování účinnosti polymerázy během syntézy DNA. Při této metodě jsou využívány SMRT buňky, přičemž každá z buněk má tisíce mikrojamek zva- 32

33 ných zero-mode waveguide (dále jen ZMW), které májí v průměru pouhé desítky nanometrů. Na dně každé ZMW je připojena DNA polymeráza (Masoudi-Nejad, et al. 2013). Beránek (2016) uvádí, že speciální design mikrojamek zabraňuje průniku okolního, nežádoucího světla a umožňuje průchod pouze důkladně nasměrovanému a úzkému laserovému paprsku. Ansorge (2009) dodává, že vzhledem k tomuto paprsku, který je veden do velice úzké komůrky, je možné použít pouze 20 zeptolitrů (10-21 litru) sekvenační směsi. Už toto malé množství umožňuje sledování fluorescence inkorporovaných nukleotudů do rostoucího řetězce, a to v reálném čase. McGinn a Gutt (2013) nezařazují tuto metodu do třetí generace sekvenování jak je tomu u většiny ostatních autorů, nýbrž vytvářejí speciální 2,5. generaci, kam spadá pouze tato metoda. Své rozhodnutí odůvodňují tím, že SMRT odpovídá specifikacím spíše druhé generace, zejména pak sekvenací jednotlivých naklonovaných molekul pomocí enzymatického replikačního systému. Naopak se od druhé generace odlišuje sekvenováním celých jednotlivých molekul a umístěním polymerázového enzymatického systému na dně jamek. Výhodou této metody je délka čtením, která může být pří použití specifické chemie v průměru až 20 kb, přičemž nejdelší čtení dosahují délky až 60 kb. Nevýhodou zůstává, že pouze čtvrtina až polovina z celkového počtu ZMW poskytuje správná čtení. Chyby mohou nastat zejména v neúspěšném navázání polymerázy na dno jamky, nebo v nanesení více než jedné molekuly DNA do jedné jamky. Další nevýhodou je nízká kapacita ve srovnání s SGS technologiemi a relativně velká chybovost, která dosahuje přibližně 15 %. Vzhledem k tomu, že jak SMRT, tak i SGS mají své silné i slabé stránky, je možné tyto metody vzájemně zkombinovat. Současné použití obou metod se nazývá hybridní sekvenování a je možné díky němu dosáhnout daleko lepší kvality sekvenování, než by tomu bylo pouze u SMRT metody, nebo pouze u jedné z SGS metod (Rhoads a Au, 2015). Princip metody Nejprve je nutné získat templát pro sekvenaci, který nazýváme SMRTbell. Jedná se o jednořetězcovou kruhovou molekulu DNA, která vzniká ligací hairpin adaptérů na oba konce dvouřetězcové molekuly DNA. Tyto SMRTbell jsou následně naneseny na speciální čip, který obsahuje jednotlivé ZMW, které byly popsány výše (Rhoads a Au, 2015). 33

34 Samotné sekvenování probíhá uvnitř jamek, kde dochází k inkorporaci jednotlivých fluorescenčně značených nukleotidů pomocí pevně připojené polymerázy, která je na dně každé z těchto jamek. Na dně každé jamky tedy probíhá replikace jednovláknové molekuly DNA a inkorporace je zaznamenávána citlivými kamerami s vysokým rozlišením. Právě v povaze, jakou probíhá inkorporace nukleotidů, je možné vidět rozdíl oproti ostatním metodám, ve kterých docházelo k postupování volné polymerázy přes pevně ukotvený templát. V metodě SMRT naopak postupují jednotlivé nukleotidy přes pevně ukotvenou polymerázu. To je možné díky tomu, že Phi29 polymeráze je schopna vykonávat RCA, přičemž celý tento proces je pak nazýván circular consensus sequencing (Rodríguez-Ezpeleta, Hackenberg a Aransay, 2012) Oxford Nanopore V roce 2014 představila firma Oxford Nanopore Technologies nový sekvenátor třetí generace zvaný MinION (Lu, Giordano a Ning, 2016). Toto zařízení je založené na technologii nanopórů, které jsou uloženy v membráně umístěné nad elektrickou detekční sítí. Tím jak molekuly DNA prochází póry, vytvářejí měřitelné změny ve struktuře pórů. Tyto výkyvy jsou zaznamenávány, a tak je možné odvodit sekvenci každé prošlé molekuly (Goodwin et al., 2015) MinION má vzhledem ke svým vlastnostem, relativně velký potenciál nahradit, nebo doplnit současné sekvenační technologie. Technologie nanopórů má schopnost sekvenovat celé molekuly, což je obrovská výhoda oproti současným sekvenačním technologiím, které vévodí trhu. Klasické technologie potřebují předem vygenerované klastry získané amplifikací, aby vůbec sekvenace mohla proběhnout. Sekvenování celé molekuly pomocí nanopórů odstraňuje potřebu amplifikace a je tedy menší pravděpodobnost, že dojde k vytvoření určitého artefaktu či poškození zkoumané DNA. I přes absenci amplifikace je však nutná určitá příprava vzorku (Laver et al., 2015). Hlavní výhodou tohoto sekvenování je velikost sekvenátorů. Například výše zmíněný sekvenátor MiniION má rozměry pouze 10x3x2 cm a váží pouhých 90 g, což z něj dělá nejmenší sekvenátor na světě. Výhodou pro některé laboratoře může být i to, že software MinKnow, dodávaný k těmto sekvenátorům, nemá přehnané hardwarové nároky na počítač, do kterého se připojuje pomocí USB 3.0 portu (Lu, Giordano a Ning, 2016). Dle informací dostupných ze stránek společnosti Oxford Nanopore Technologies je možné 34

35 použít libovolný operační systém Windows, Mac či Linux. Je vyžadováno 16 GB operační paměti, čtyřjádrový procesor modelové řady i7 nebo Xeon, 1 TB SSD disku a samozřejmě port USB 3 (nanoporetech.com, 2017). Naopak největší nevýhodou je poměrně značná chybovost, která se pohybuje mezi 12% a 35%, přičemž kapacita tohoto sekvenátoru není doposud konstatní a můžeme tak získat mezi 0,1 GB a 1 GB surových sekvenčních dat (Lu, Giordano a Ning, 2016). Lu, Giordano a Ning (2016) k tomu dodávají, že tento vysoký rozptyl může být způsobem rozdílnou aktivitou jednotlivých kanálů. Ari a Arikan (2016) spatřují další nedostatek této technologie v její absenci na komerčním trhu a dostupnost pro laboratoře pouze v rámci programu předběžného přístupu Princip metody Pro tvorbu knihovny je vhodné použití dvouvláknové DNA, která umožňuje sekvenování obou vláken. Zkoumaná vlákna obvykle obsahují dva adaptéry, přičemž jedním z nich je vedoucí adaptér Y, jehož název je odvozen od jeho tvaru a druhým je hairpin adaptér. Sekvenování zpravidla začíná na 5ʹ konci Y adaptéru, které přechází v templátové vlákno a pokračuje sekvenací hairpin adaptéru, který tvoří začátek komplementárního vlákna. Jednotlivá vlákna jsou od sebe před vstupem do nanopóru oddělena pomocí motorového proteinu (viz obrázek č. 6). Po osekvenování templátu se do celé reakce zapojuje hairpin protein, který navede do nanopóru i komplementární vlákno. Po aplikaci DNA na membránu s póry můžeme pomocí elektrického napětí protlačovat DNA skrz jednotlivé póry. Sekvence jednotlivých nukleotidů je měřena pomocí senzoru na základě změny velikosti nebo tvaru pórů. Tento senzor snímá změny několiktisíckrát za sekundu a data posílá do speciálního ASIC mikročipu. Vzhledem k přítomnosti 512 kanálů v sekvenátoru MinION je možné paralelně sekvenovat až 512 jednotlivých DNA molekul. Koncové zpracování dat zajišťuje výše zmíněný MinKNOW software. 35

36 3.4 Čtvrtá generace Obrázek č. 6: Nanopór pro sekvenaci DNA (zdroj: Wang, Yang a Wang, 2014) McGinn a Gut (2013) tvrdí, že čtvrtá generace sekvenování je stále v experimentální fázi, přičemž za její podstatu označují sekvenování DNA jednotlivých buněk v histologickém kontextu. Principem není určení kompletní sekvence DNA nukleotidů, nýbrž určení a rozlišení buněk, které pošly například somatickou mutací. Ari a Arikan (2016) dodávají, že určité metody z této generace jako je například ISS jsou velice slibné. Jejich výhoda spočívá v sekvenování nukleových kyselin přímo v tkáních, a to bez ohledu na typu této tkáně. Metody ISS nejsou vhodné na de novo určování sekvencí a ke své správné funkci potřebují referenční genom získaný standardními NGS metodami. Za těchto podmínek je možné pomocí nových metod určit rozdíl v jediném nukleotidu mezi dvěma různými sekvencemi. In situ sekvenování se liší od předchozích generací ve dvou ohledech, přičemž oba jsou velice důležité pro výzkum a diagnostiku. Prvním z nich je možnost pozorovat prostorové rozložení sekvenčních čtení napříč celým vzorkem, čímž získáváme další množství informací, se kterými doposud nebylo možné pracovat. Tyto informace lze využít k vizualizaci heterogenity například v buňkách mozkových tkání. Druhým rozdílem je kapacita z hlediska množství buněk, které lze současně v jeden moment sekvenovat (Mignardi a Nilsson, 2014). Fengt et al. (2015) nesouhlasí s výše uvedenými autory a tvrdí, že specifickým aspektem čtvrté generace sekvenování jsou nanopóry. 36

37 4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Izolace DNA z tkání Vzorkem pro sekvenaci byla končetina motýla (Lepidoptera), která pocházela ze Sphingidae Muzeum. Pro izolaci byl využit komerčně dostupný PureLink Genomic DNA Mini Kit od firmy Geneaid, přičemž postup byl proveden podle příslušného protokolu, který byl součástí tohoto kitu. Končetina motýla byla vložena do 1,5 ml mikrozkumavky s 200 µl GT pufru. Pomocí speciální mikrotyčinky byl vzorek manuálně, mechanicky homogenizován a k této směsi přidáno 20 µl proteinázy K a celá směs promíchána na vortexu, aby došlo k jejímu dokonalému promíchání. Vzhledem k povaze vzorku byla inkubační doba prodloužena z 30 minut na celou noc a to při 60 C. Další den ráno byly vzorky po přidání 200 µl GBT pufru opět zvortexovány a následně inkubovány po dobu 30 minut při 60 C, přičemž každých pět minut došlo k ručnímu promíchání vzorků pomocí opakovaného převrácení mikrozkumavky. Po ukončení inkubace bylo k tomuto vzorku přidáno ještě 200 µl čistého ethanolu a celá směs byla třepáním promíchána a následně napipetována na speciální GD kolonku se silikátovou mebránou, přičemž tato kolonka byla umístěna do 2 ml sběrné mikrozkumavky. Následně byla kolonka vložena do centrifugy a stočena při x g po dobu 30 vteřin. Odpad ze sběrné zkumavky byl vylit a na membránu napipetováno 400 µl W1 pufru, který odstraňuje zbytky proteinů a degraduje zbytky RNA. Následovala další centrifugace při x g po dobu dvou minut. Odpad ze sběrné zkumavky byl opět vylit a na membránu se naneslo 600 µl Promývacího pufru, následovala centrifugace při x g po dobu 30 vteřin. Odpad ze sběrné zkumavky byl opět vylit a celá kolonka centrifugována, tentokrát bez přidání pufru a to za účelem odmytí zbytku pufru, který by mohl zůstat na kolonce. V posledním kroku byla kolonka vložena do nové 1,5 ml mikrozkumavky a na kolonku přidáno 50 µl Elučního pufru, takto připravená kolonka byla centrifugována při x g po dobu 30 vteřin. 4.2 Amplifikace DNA Polymerázová řetězová reakce byla provedena za použití primerů dodaných vedoucím bakalářské práce, které byly určeny přímo pro sekvenovaný vzorek. 37

38 4.2.1 Reakční směsi pro PCR Reakční směs pro PCR je uvedena v tabulce č. 1, přičemž PPP mix, který je komerčně dostupný, obsahoval Mg 2+ ionty, PCR pufr, směs nukleotidů a nanášecí marker. PPP mixu bylo využito z časových a technických důvodů. Vzhledem k tomu, že vzorky není nutné smíchávat s nanášecím markerem těsně před nanesením na gel, redukuje se tím možná kontaminace či riziko jiné chyby. Tabulka č. 1: Reakční směs PCR reakce (zdroj: vlastní tvorba) ddh 20 PPP mix Primer F Primer R DNA Celkem 3,6 µl 5,0 µl 0,2 µl 0,2 µl 1,0 µl 10 µl Teplotní profily PCR Teplotní profil pro PCR je znázorněn na Obrázku č. 7. Teplota pro denaturaci byla 95 C, přičemž úvodní denaturace trvala 3 minuty a denatura během každého cyklu pak 40 vteřin. Teplota pro nasedání primerů byla nastavena na 59 C a teplota pro elongaci na 72 C. Celkem bylo provedeno čtyřicet cyklů, po jejichž skončení byla provedena závěrečná 10 minutová elongace. 4.3 Gelová elektroforéza Obrázek č. 7: Teplotní profil PCR reakce (zdroj: vlastní tvorba) Gelová elektroforéza byla provedena ve 3% agarózovém gelu. Ten byl připraven rozpuštěním 1,8 g agarózy v 60 ml trisborátového pufru (TBE) spolu s 12 µl EtBr, tento roztok byl rozvařen a nalit do vaničky a pomocí hřebínků byly vytvořeny jamky. Do každé jamky byl nanesen vzorek o objemu 4 µl. Zároveň byl do první a poslední jamky 38

39 nanesen hmotnostní marker M100, který zanechává bandy vždy po 100 bp. Elektroforéza probíhala při napětí 120 V po dobu 30 minut. 4.4 Sekvenace DNA Samotná směs pro sekvenování byla namíchána pomocí BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit od firmy ABI. Celkoý objem reakční směsi musí činit 10 µl, přičemž vzhledem k výsledkům ELFO, které ukázaly výbornou čistotu vzorku, bylo rozhodnuto o použití pouze 0,2 µl DNA. Jednotlivé složky celé reakční směsi jsou uvedeny v Tabulce č. 2. Následná sekvenační amplifikace byla provedena ve 25 cyklech. Denaturační teplota byla na začátku nastavena na 96 C po dobu jedné minuty a v každém cyklu poté rovněž na 96 C po dobu 10 vteřin. Teplota nasedání primerů byla nastavena na 50 C po dobu 5 vteřin a závěrečná fáze každého cyklu probíhala při 60 C po dobu 4 minut, viz Obrázek č. 7. Purifikace DNA byla provedena pomocí BigDye XTerminator Purification Kitu také od společnosti ABI a pracovní postup je uveden v Příloze č. 1. Takto připravená DNA byla nepipetována na 96 jamkovou mikrotitrační destičnu a vložena do sekvenátoru ABI Prism viz Příloha č. 3. K finálnímu vyhodnocení dat byl použit program Sequence Scanner v1.0 rovněž od firmy ABI. Tabulka č. 2: Reakční směs sekvenační PCR reakce (zdroj: vlastní tvorba) ddh 20 Pufr Mix nt Primer DNA Celkem 7,39 µl 1,75 µl 0,5 µl 0,16 µl 0,2 µl 10 µl Obrázek č. 8: Teplotní profil sekvenační PCR reakce (zdroj: vlastní tvorba) 39

40 5 DISKUZE 5.1 Diskuze k teoretické části Ačkoliv od doby, kdy Sanger, Maxam a Gilbert představili své první sekvenátory, uběhlo již více než čtyřicet let, stále je sekvenování velice zajímavé a nechává otevřená pomyslná vrátka pro další studie. V dnešní době je na trhu nespočet sekvenátorů pracujích na principu nejrůznějších technologií a říci, že je nějaký sekvenátor či technologie lepší než jiná, by nebylo správné. Každá ze zmíněných metod má své výhody a nevýhody a především se každá tato metoda hodí pro jiné aplikace. Potenciální kupci sekvenátorů to v dnešní době nemají jednoduché. Ačkoliv existují na jednotlivé sekvenační technologie desítky vědeckých článků a recenzí (viz Tabulka č. 3), je poměrně složité se na trhu s těmito přístroji orientovat. Prvním problémem, se kterým se lze setkat, jsou neustále fúze, případně odkupy malých společností těmi velkými a pro zákazníka tak může být mnohdy složité vůbec zjistit, kým je jeho sekvenátor momentálně prodáván. Dalším problémem je, že takřka polovina sekvenačních technologii, které byly uvedeny v této práci, buď neexistují, nebo pro ně skončila podpora ve formě technické pomoci či výroby sekvenační chemie. Zcela logickým faktem, který lze v poslední době pozorovat je určitý informační šum z hlediska fungování jednotlivých sekvenátorů. Firmy si své know-how pečlivě střeží a najít na internetu či v literatuře, jak některé stroje fungují, je mnohdy nadlidský úkon. V rámci průzkumu průzkumu, který byl v rámci této práce proveden na portálu ScienceDirect, byla vytvořena Tabulka č. 3, ze které je patrné, že většina studií se i v dnešní době zabývá Sangerovou metodou. To může být dáno, jak tím, že se jedná o nejdostupnější a zároveň nejspolehlivější metodu, tak tím, že se přímo nabízí s touto metodou srovnat nově vzniklé technologie. Vysoký podíl prací, je napsán na téma Illumina sekvenování (viz Obrázek č. 9). V roce 2016 bylo na toto téma sepsáno přes 110 vědeckých prací, což je více než na všechny ostatní metody dohromady pokud nepočítáme Sangerovu metodu. Z Obrázku č. 12 pak vyplývá, že technologie DNA nanoball, Heliscope, Pololantor a částečně i SOLiD mají velice malý počet prací, které se těmto technologií věnují. U DNA nanoball je tento fakt zapříčiněn zejména tím, že sekvenátor pracující na tomto principu není možné zakoupit a sekvenování na něm je nabízeno pouze jako služba, tudíž je složité, aby články na toto téma opravdu vznikaly. U technologií Heliscope a Polonator pak můžeme hovořit o slepé větvi ve vývoji, kdy se tyto technologie neuchytily. 40

41 Rok Tabulka č. 3: Počet vědeckých prací u jednotlivých metod (zdroj: vlastní tvorba) Metoda Sanger Ma-Gi 454/Roche Illumina SOLiD Ion Torrent DNB HeliScope Polonator SMRT ONT Celkem Pozn.: při hledání byly použity obvykle dvě hlesla, například Sanger a Sanger sequencing, přičemž tato hesla se musela objevit buď v názvu práce, v abstraktu, nebo musela být součástí klíčových slov daného článku na portálu ScienceDirect. Kromě Sangerovy metody byla provedena kontrola, zda se články opravdu vztahují k tématu sekvenování. 41

42 Počet článků Počet článků Vývoj věděckých prací v čase Rok Sanger Ma-Gi 454/Roche Illumina SOLiD Ion Torrent DNB HeliScope Polonator SMRT ONT Obrázek č. 9: Vývoj počtu vědeckých prací (zdroj: vlastní tvorba) Vývoj počtu vědeckých článků za posledních 5 let Rok Sanger Ma-Gi 454/Roche Illumina SOLiD Ion Torrent DNB HeliScope Polonator SMRT ONT Obrázek č. 10: Vývoj počtu vědeckých prací za posledních 5 let (zdroj: vlastní tvorba) 42

43 Celkový počet článků na dané metody Sanger Ma-Gi 454/Roche Illumina SOLiD Ion Torrent DNB HeliScope Polonator SMRT ONT Obrázek č. 11: Počet vědeckých prací na jednotlivé metody (zdroj: vlastní tvorba) Celkový počet věděckých článků na jednotlivé metody mimo Sangerovy Ma-Gi 454/Roche Illumina SOLiD Ion Torrent DNB HeliScope Polonator SMRT ONT Obrázek č. 12: Počet vědeckých prací na jednotlivé metody mimo Sangerovy (zdroj: vlastní tvorba) 43

44 5.2 Diskuze a výsledky z praktické části Pro analýzu výstupních dat z kapilárního sekvenátoru ABI Prism 3500 Genetic Analyzer, bylo nutné použít specializovaný software, která umožňuje otevření souborů s příponou.ab1. Pro tyto účely byl zvolen program Sequence Scanner v1.0 přímo od firmy ABI. Mezi hlavní funkce tohoto programu patří import a export dat, úprava sekvence, tisk, a samozřejmě zobrazení samotného pořadí jednotlivých nukleotidů. Při zobrazování sekvence je na výběr ze dvou možností, první z nich je zobrazení ve formě jednotlivých peaků, přičemž pro přehlednost jsou jednotlivé báze a tedy i peaky barevně odlišeny. Červená barva patří thyminu, zelená adeninu, černá guaninu a modrá cytosinu. Při analýze je možné s těmito peaky nejrůznějšími způsoby pracovat, například roztahovat je do výšky, nebo přibližovat pouze určité úseky zkoumané sekvence. Druhým způsobem je zobrazení sekvence v textové podobě. Při tomto zobrazení je možné zapnout barevné rozlišení, které v tomto případě slouží k určení kvality, přičemž nevyšší kvalita (QV) osekvenování je zobrazena modře, střední žlutě a nejnižší červeně. Celkově se bylo osekvenováno 578 bází jejichž kompletní sekvence je uvedena v Příloze č. 4. Při důkladném prozkoumání sekvence v Sequence Scanneru v1.0 je možné pozorovat malé rozlišení jednotlivých peaků, a zároveň jejich nízké QV, v prvních přibližně třiceti nukleotidech. To může být dáno skutečností, že sekvenátor nedokáže kvalitně přečíst primer a přibližně dalších dvacet bází. Pokud nepočítáme těchto úvodních třicet bází, vyskytuje se v sekvenci pouze pět nukleotidů s červenou hodnotou QV a šest nukleotidů se žlutou hodnotou QV. Vzhledem k celkovému počtu 578 bází je toto velmi vysoké číslo a celý proces sekvenování tak může být považován za úspěšně provedený. Zkoumaná sekvence byla uložena ve fasta formátu, aby mohla být následně analyzována pomocí bioinformatických nástrojů. Prvním použitým nástrojem byl Nucleotide BLAST na strákách National Center for Biotechnology Information (dále jen NCBI). Tento online nástroj, které je možné používat přímo v prohlížeči umožňuje srovnání vložené sekvence nukleotidů se sekvencemi, které jsou součástí databáze. Srovnávání ukázalo, že naše sekvence má nejvyšší podobnost s elongačním faktorem-1 alfa motýla (Lepidoptera) z čeledi lišajovití (Sphingdae) a konkrétně lišaje lipového (Mimas tiliae Linnaeus, 1758) (viz Příloha č. 4). Celkové skóre při srovnávání bylo 1018 bodů, přičemž celková shoda činila přes 99 %. Z celkového počtu 567 bází, které Blast vyhodnotil jako vhodné ke srovnání, bylo s referenčním genomem shodných 562 bází. Druhá nejvyšší 44

45 shoda a to 95 % byla s motýlem (Phyllosphingia dissimilis Bremer 1861), přičemž se opět jednalo o elongační faktor-1 alfa. V tomto případě bylo shodných 537 bází a celkové skóre činilo 874 bodů. Jako třetí nejvíce podobný genom byl vyhodnocen znovu elongační faktor-1 alfa, tentokrát lišaje parcského (Callionima parce Fabricius, 1775), opět s 537 shodnými bázemi a 872 body celkového skóre. Pro potvrzení výsledků, byla zkoumaná sekvence srovnána ještě s databází UniProt, opět pomocí srovnávacího programu Blast. I v této databázi byla vyhodnocena nejvyšší shoda s elongačním faktorem-1 alfa lišaje lipového (Mimas tiliae), přičemž shoda zde byla opět 99 %. Díky výše uvedeným výsledkům, bylo možné určit, že vzorek končetiny, který byl obdržen pro účely této praktické části pocházel z lišaje lipového (Mimas tiliae). Vzhledem k tomu, že podle výsledků se jednalo o elongační faktor-1 alfa, bylo možné předpokládat, že poskytnuté primery, byly navrženy právě na tento elongační faktor. Oba výše uvedené výsledky byly potvrzeny vedoucím této práce jako správné a pokus v praktické části této bakalářské práce byl tedy úspěšný. 45

46 6 ZÁVĚR Od svého zrodu prošly sekvenační technologie neoddiskutovatelně opravdu velkým vývojem. Vzhledem k tomu, že tato bakalářská práce pokrývala pouze nejvýznamnější sekvenační technologie, nebylo možné popsat všechny technologie, které byly a případně jsou na trhu, nebo jsou ve fázi experimentálního vývoje. Již na popsaných metodách lze však vidět, že mnoho přístupů, které citovaní autoři považovali ve své době za významné, již neexistuje, nebo upadlo do ústranní. Vzhledem k tomu, že je sekvenování jako podobor genetiky stále na svém vrcholu, lze očekávat, že tento trend bude ještě několik let trvat, nebo bude mít dokonce vzestupnou tendenci. Sangerovo sekvenvoání si drží nálepku zlatého standardu a je dodnes hojně využíváno, ať už na de novo sekvenování, nebo jako srovnávací metoda pro nově vzniklé technologie. Od doby Sangera, vznikla řada důmyslných a kvalitních sekvenátorů, které pracují na matodách jako sekvenování pomocí syntézy, sekvenování ligací, polovodičové sekvenování, či ještě nedostupné sekvenování nanopóry, na jehož vývoji se podílí řada firem. Pravdou však zůstává, že v současné době jsou nejrozšířenější sekvenátory od společnosti Illumina, která sází na poměrně jednoduchou metodu sekvenování pomocí syntézy. Právě jistá nadvláda této společnosti na současném trhu jí umožňuje investovat nemalé finance do vývoje sekvenátorů třetí generace. Při sekvenování hrály vždy roli čtyři hlavní faktory, kterými jsou: přesnost získané sekvence, rychlost, kapacita a v neposlední řadě také pořizovací cena přístroje a náklady na jeho provoz. V posledních letech s nástupem nových generací sekvenačních technologií lze pozorovat zajímavý trend a tím je snaha o zmenšování jednotlivých sekvenátorů. Lze v tom spatřovat bezpochyby důležitý krok, který umožní nejen další rozšíření sekvenačních technologií, ale nabízí také možnost sekvenování přímo v terénu, přičemž opadají starosti s pracným uchováváním vzorku, během kterého může dojít k jeho poškození. V praktické části této bakalářské práce byla úspěšně osekvenována část genomu motýla (Lepidoptera), přičemž následná analýza sekvence v internetových databázích ukázala, že se jedná o lišaje lipového (Mimas tiliae). Vzhledem k tomu, že tato část sekvence odpovídá Elongačnímu faktoru 1-alfa, bylo rovněž správně určeno, že primery, které byly poskytnuty pro účely této bakalářské práce byly navrženy právě pro tento elongační faktor. 46

47 SEZNAM LITARATURY ANSORGE, Wilhelm J. Next-generation DNA sequencing techniques. New Biotechnology. 2009, 25(4), s ISSN ARI, Şule a Muzaffer ARIKAN. Next-Generation Sequencing: Advantages, Disadvantages [online]. 1. Švýcarsko: Springer, 2016, s [cit ]. ISBN Dostupné z: BLEIDORN, Christoph. Third generation sequencing: technology and its potential impact on evolutionary biodiversity research. Systematics and Biodiversity. 2015, 14(1), s ISSN BRASLAVSKY, I., B. HEBERT, E. KARTALOV a S. R. QUAKE. Sequence information can be obtained from single DNA molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2003, 100(7), s ISSN BUERMANS, H.P.J., J.T. DEN DUNNEN, E. KARTALOV a S. R. QUAKE. Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 2014, 1842(10), s ISSN CANTOR, Charles R. a Cassandra L. SMITH. Genomics: the science and technology behind the Human Genome Project. New York: Wiley, c1999. ISBN DRMANAC, R., A. B. SPARKS, M. J. CALLOW, A. L. HALPERN, N. L. BURNS, B. G. KERMANI, P. CARNEVALI, I. NAZARENKO, G. B. NILSEN, G. YEUNG, F. DAHL, A. FERNANDEZ, B. STAKER, K. P. PANT, J. BACCASH, A. P. BORCHER- DING, A. BROWNLEY, R. CEDENO, L. CHEN, D. CHERNIKOFF, A. CHEUNG, R. CHIRITA, B. CURSON, J. C. EBERT, C. R. HACKER, R. HARTLAGE, B. HAUSER, S. HUANG, Y. JIANG, V. KARPINCHYK, M. KOENIG, C. KONG, T. LANDERS, C. LE, J. LIU, C. E. MCBRIDE, M. MORENZONI, R. E. MOREY, K. MUTCH, H. PERA- ZICH, K. PERRY, B. A. PETERS, J. PETERSON, C. L. PETHIYAGODA, K. POTHU- RAJU, C. RICHTER, A. M. ROSENBAUM, S. ROY, J. SHAFTO, U. SHARANHO- VICH, K. W. SHANNON, C. G. SHEPPY, M. SUN, J. V. THAKURIA, A. TRAN, D. VU, A. W. ZARANEK, X. WU, S. DRMANAC, A. R. OLIPHANT, W. C. BANYAI, B. MARTIN, D. G. BALLINGER, G. M. CHURCH a C. A. REID. Human Genome Sequencing Using Unchained Base Reads on Self-Assembling DNA Nanoarrays: Advances and applications. Science. 2009, 327(5961), s ISSN FENG, Yanxiao, Yuechuan ZHANG, Cuifeng YING, Deqiang WANG a Chunlei DU. Nanopore-based Fourth-generation DNA Sequencing Technology. Genomics, Proteomics. 2015, 13(1), s ISSN FRANÇA, Lilian T. C., Emanuel CARRILHO a Tarso B. L. KIST. A review of DNA sequencing techniques. Quarterly Reviews of Biophysics. 2002, 35(02), -. ISSN FULLER, Carl W, Lyle R MIDDENDORF, Steven A BENNER, George M CHURCH, Timothy HARRIS, Xiaohua HUANG, Stevan B JOVANOVICH, John R NELSON, 47

48 Jeffery A SCHLOSS, David C SCHWARTZ a Dmitri V VEZENOV. The challenges of sequencing by synthesis. Nature Biotechnology. 2009, 27(11), ISSN GHARIZADEH, Baback, Mehran GHADERI a Pål NYRÉN. Pyrosequencing Technology for Short DNA Sequencing and Whole Genome Sequencing. Seibutsu Butsuri. 2007, 47(2), ISSN GOODWIN, Sara, James GURTOWSKI, Scott ETHE-SAYERS, Panchajanya DE- SHPANDE, Michael C. SCHATZ a W. Richard MCCOMBIE. Oxford Nanopore sequencing, hybrid error correction, and de novo assembly of a eukaryotic genome. Genome Research. 2015, 25(11), ISSN GRENINGER, Alexander L., Samia N. NACCACHE, Scot FEDERMAN, Guixia YU, Placide MBALA, Vanessa BRES, Doug STRYKE, Jerome BOUQUET, Sneha SOMA- SEKAR, Jeffrey M. LINNEN, Roger DODD, Prime MULEMBAKANI, Bradley S. SCHNEIDER, Jean-Jacques MUYEMBE-TAMFUM, Susan L. STRAMER a Charles Y. CHIU. Rapid metagenomic identification of viral pathogens in clinical samples by realtime nanopore sequencing analysis. Genome Medicine. 2015, 7(1), -. ISSN x. HART, Christopher, Doron LIPSON, Fatih OZSOLAK, Tal RAZ, Kathleen STEIN- MANN, John THOMPSON a Patrice M. MILOS. Methods in Enzymology [online]. Cambridge: Elsevier, 2010, s [cit ]. ISBN Dostupné z: HEATHER, James M. a Benjamin CHAIN. The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA. Genomics. 2016, 107(1), 1-8. ISSN HERPER, Matthew. Illumina Promises To Sequence Human Genome For $ But Not Quite Yet. Forbes [online] [cit ]. Dostupné z: History of Illumina Sequencing. Illumina Sequencing and array-based solutions for genetic research [online] [cit ]. Dostupné z: HUTCHISON, C. A. DNA sequencing: bench to bedside and beyond. Nucleic Acids Research. 2007, 35(18), ISSN HYMAN, Edward David. A new method of sequencing DNA. Analytical Biochemistry. 1988, 174(2), ISSN JANITZ, Michal., ed. Next-generation genome sequencing: towards personalized medicine. Weinheim: Wiley, c2008. ISBN KIRCHER, Martin a Janet KELSO. High-throughput DNA sequencing - concepts and limitations. BioEssays. 2010, 32(6), ISSN Lab requirements. Oxford Nanopore Technologies [online] [cit ]. Dostupné z: 48

49 LANDER, Eric S., Lauren M. LINTON, Bruce BIRREN, Chad NUSBAUM, Michael C. ZODY, Jennifer BALDWIN, Keri DEVON, Ken DEWAR, Michael DOYLE, William FITZHUGH, Roel FUNKE, Diane GAGE, Katrina HARRIS, Andrew HEAFORD, John HOWLAND, Lisa KANN, Jessica LEHOCZKY, Rosie LEVINE, Paul MCEWAN, Kevin MCKERNAN, James MELDRIM, Jill P. MESIROV, Cher MIRANDA, William MORRIS, Jerome NAYLOR, Christina RAYMOND, Mark ROSETTI, Ralph SANTOS, Andrew SHERIDAN, Carrie SOUGNEZ, Nicole STANGE-THOMANN, Nikola STO- JANOVIC, Aravind SUBRAMANIAN, Dudley WYMAN, Jane ROGERS, John SUL- STON, Rachael AINSCOUGH, Stephan BECK, David BENTLEY, John BURTON, Christopher CLEE, Nigel CARTER, Alan COULSON, Rebecca DEADMAN, Panos DE- LOUKAS, Andrew DUNHAM, Ian DUNHAM, Richard DURBIN, Lisa FRENCH, Darren GRAFHAM, Simon GREGORY, Tim HUBBARD, Sean HUMPHRAY, Adrienne HUNT, Matthew JONES, Christine LLOYD, Amanda MCMURRAY, Lucy MATTHEWS, Simon MERCER, Sarah MILNE, James C. MULLIKIN, Andrew MUN- GALL, Robert PLUMB, Mark ROSS, Ratna SHOWNKEEN, Sarah SIMS, Robert H. WATERSTON, Richard K. WILSON, LaDeana W. HILLIER, John D. MCPHERSON, Marco A. MARRA, Elaine R. MARDIS, Lucinda A. FULTON, Asif T. CHINWALLA, Kymberlie H. PEPIN, Warren R. GISH, Stephanie L. CHISSOE, Michael C. WENDL, Kim D. DELEHAUNTY, Tracie L. MINER, Andrew DELEHAUNTY, Jason B. KRA- MER, Lisa L. COOK, Robert S. FULTON, Douglas L. JOHNSON, Patrick J. MINX, Sandra W. CLIFTON, Trevor HAWKINS, Elbert BRANSCOMB, Paul PREDKI, Paul RICHARDSON, Sarah WENNING, Tom SLEZAK, Norman DOGGETT, Jan-Fang CHENG, Anne OLSEN, Susan LUCAS, Christopher ELKIN, Edward UBERBACHER, Marvin FRAZIER, Richard A. GIBBS, Donna M. MUZNY, Steven E. SCHERER, John B. BOUCK, Erica J. SODERGREN, Kim C. WORLEY, Catherine M. RIVES, James H. GORRELL, Michael L. METZKER, Susan L. NAYLOR, Raju S. KUCHERLAPATI, David L. NELSON, George M. WEINSTOCK, Yoshiyuki SAKAKI, Asao FUJIYAMA, Masahira HATTORI, Tetsushi YADA, Atsushi TOYODA, Takehiko ITOH, Chiharu KAWAGOE, Hidemi WATANABE, Yasushi TOTOKI, Todd TAYLOR, Jean WEIS- SENBACH, Roland HEILIG, William SAURIN, Francois ARTIGUENAVE, Philippe BROTTIER, Thomas BRULS, Eric PELLETIER, Catherine ROBERT, Patrick WINC- KER, André ROSENTHAL, Matthias PLATZER, Gerald NYAKATURA, Stefan TAU- DIEN, Andreas RUMP, Douglas R. SMITH, Lynn DOUCETTE-STAMM, Marc RU- BENFIELD, Keith WEINSTOCK, Hong Mei LEE, JoAnn DUBOIS, Huanming YANG, Jun YU, Jian WANG, Guyang HUANG, Jun GU, Leroy HOOD, Lee ROWEN, Anup MADAN, Shizen QIN, Ronald W. DAVIS, Nancy A. FEDERSPIEL, A. Pia ABOLA, Michael J. PROCTOR, Bruce A. ROE, Feng CHEN, Huaqin PAN, Juliane RAMSER, Hans LEHRACH, Richard REINHARDT, W. Richard MCCOMBIE, Melissa DE LA BASTIDE, Neilay DEDHIA, Helmut BLÖCKER, Klaus HORNISCHER, Gabriele NORDSIEK, Richa AGARWALA, L. ARAVIND, Jeffrey A. BAILEY, Alex BATE- MAN, Serafim BATZOGLOU, Ewan BIRNEY, Peer BORK, Daniel G. BROWN, Christopher B. BURGE, Lorenzo CERUTTI, Hsiu-Chuan CHEN, Deanna CHURCH, Michele CLAMP, Richard R. COPLEY, Tobias DOERKS, Sean R. EDDY, Evan E. EICHLER, Terrence S. FUREY, James GALAGAN, James G. R. GILBERT, Cyrus HARMON, Yoshihide HAYASHIZAKI, David HAUSSLER, Henning HERMJAKOB, Karsten HO- KAMP, Wonhee JANG, L. Steven JOHNSON, Thomas A. JONES, Simon KASIF, Arek KASPRYZK, Scot KENNEDY, W. James KENT, Paul KITTS, Eugene V. KOONIN, Ian KORF, David KULP, Doron LANCET, Todd M. LOWE, Aoife MCLYSAGHT, Tarjei MIKKELSEN, John V. MORAN, Nicola MULDER, Victor J. POLLARA, Chris 49

50 P. PONTING, Greg SCHULER, Jörg SCHULTZ, Guy SLATER, Arian F. A. SMIT, Elia STUPKA, Joseph SZUSTAKOWKI, Danielle THIERRY-MIEG, Jean THIERRY- MIEG, Lukas WAGNER, John WALLIS, Raymond WHEELER, Alan WILLIAMS, Yuri I. WOLF, Kenneth H. WOLFE, Shiaw-Pyng YANG, Ru-Fang YEH, Francis COLLINS, Mark S. GUYER, Jane PETERSON, Adam FELSENFELD, Kris A. WET- TERSTRAND, Richard M. MYERS, Jeremy SCHMUTZ, Mark DICKSON, Jane GRIMWOOD, David R. COX, Maynard V. OLSON, Rajinder KAUL, Christopher RA- YMOND, Nobuyoshi SHIMIZU, Kazuhiko KAWASAKI, Shinsei MINOSHIMA, Glen A. EVANS, Maria ATHANASIOU, Roger SCHULTZ, Aristides PATRINOS a Michael J. MORGAN. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 2001, 409(6822). ISSN LAVER, T., J. HARRISON, P.A. O NEILL, K. MOORE, A. FARBOS, K. PASZKIE- WICZ a D.J. STUDHOLME. Assessing the performance of the Oxford Nanopore Technologies MinION. Biomolecular Detection and Quantification. 2015, 3, 1-8. ISSN LEBLANC, Veronique G. a Marco A. MARRA. Next-Generation Sequencing Approaches in Cancer: Where Have They Brought Us and Where Will They Take Us? Cancers. 2015, 7(3), ISSN LU, Hengyun, Francesca GIORDANO a Zemin NING. Oxford Nanopore MinION Sequencing and Genome Assembly. Genomics, Proteomics. 2016, 14(5), ISSN MAGDELDIN, Sameh, ed. GEL ELECTROPHORESIS PRINCIPLES AND BASICS [online]. Croatia: InTech, 2012 [cit ]. ISBN Dostupné z: MASOUDI-NEJAD, Ali, Zahra NARIMANI a Nazanin HOSSEINKHAN. SpringerBriefs in Systems Biology [online]. 4. NY: Springer, 2013, s [cit ]. ISBN Dostupné z: MAXAM, A. M. a W. GILBERT. A new method for sequencing DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1977, 74(2), ISSN MCGINN, Steven a Ivo Glynne GUT. DNA sequencing spanning the generations. New Biotechnology. 2013, 30(4), ISSN MIGNARDI, Marco a Mats NILSSON. Fourth-generation sequencing in the cell and the clinic. Genome Medicine. 2014, 6(4), 31-. ISSN x. MILOS, Patrice. Helicos BioSciences. Pharmacogenomics. 2008, 9(4), ISSN MOREY, Marcos, Ana FERNÁNDEZ-MARMIESSE, Daisy CASTIÑEIRAS, José M. FRAGA, María L. COUCE a José A. COCHO. A glimpse into past, present, and future DNA sequencing. Molecular Genetics and Metabolism. 2013, 110(1-2), ISSN

51 MUNSHI, Anjana. DNA Sequencing Methods and Applications [online]. Croatia: In- Tech, 2012 [cit ]. ISBN Dostupné z: NAKANO, Michihiko, Jun KOMATSU, Shun-ichi MATSUURA, Kazunori TAKA- SHIMA, Shinji KATSURA a Akira MIZUNO. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion. Journal of Biotechnology. 2003, 102(2), ISSN NYRÉN, Pål a Arne LUNDIN. Enzymatic method for continuous monitoring of inorganic pyrophosphate synthesis. Analytical Biochemistry. 1985, 151(2), ISSN PURDY, Kevin J., Paul J. HURD, Jordi MOYA-LARAÑO, Mark TRIMMER, Brian B. OAKLEY a Guy WOODWARD. Systems Biology for Ecology [online]. s [cit ]. Dostupné z: QUAIL, Michael, Miriam E SMITH, Paul COUPLAND, Thomas D OTTO, Simon R HARRIS, Thomas R CONNOR, Anna BERTONI, Harold P SWERDLOW a Yong GU. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion torrent, pacific biosciences and illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 2012, 13(1), ISSN Revolocity Whole Genome Sequencing Technology overview. Complete Genomics [online] [cit ]. Dostupné z: RODRÍGUEZ-EZPELETA, Naiara, Michael HACKENBERG a Ana M. ARANSAY, ed. Bioinformatics for high throughput sequencing. New York, NY: Springer, c2012. ISBN Roche 454 Sequencing Systems successfully resolve genetic mutations in over 4,000 blood cancer cases. Roche - Doing now what patients need next [online]. Copyright 2017 F. Hoffmann [cit ]. Dostupné z: SeqLL Launches Early Access for Revamped Helicos Platform, Expands Service Business GenomeWeb. Genetics, Genomics & Molecular Diagnostics News [online]. Copyright 2016 GenomeWeb [cit ]. Dostupné z: SHENDURE, J. Accurate Multiplex Polony Sequencing of an Evolved Bacterial Genome. Science. 2005, 309(5741), ISSN Dostupné také z: SNUSTAD, D. Peter a Michael J. SIMMONS, RELICHOVÁ, Jiřina, ed. Genetika. Brno: Masarykova univerzita, ISBN

52 STRANNEHEIM, Henrik a Joakim LUNDEBERG. Stepping stones in DNA sequencing. Biotechnology Journal. 2012, 7(9), ISSN THOMPSON, John F. a Kathleen E. STEINMANN. Single Molecule Sequencing with a HeliScope Genetic Analysis System. Current Protocols in Molecular Biology [online]. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, 2001 [cit ]. ISBN Dostupné z: TÜRKTAŞ, Mine, Kuaybe YÜCEBİLGİLİ KURTOĞLU, Gabriel DORADO, Baohong ZHANG, Pilar HERNANDEZ a Turgay ÜNVER. Sequencing of plant genomes a review. TURKISH JOURNAL OF AGRICULTURE AND FORESTRY. 2015, 39, ISSN x. VALOUEV, A., J. ICHIKAWA, T. TONTHAT, J. STUART, S. RANADE, H. PEC- KHAM, K. ZENG, J. A. MALEK, G. COSTA, K. MCKERNAN, A. SIDOW, A. FIRE a S. M. JOHNSON. A high-resolution, nucleosome position map of C. elegans reveals a lack of universal sequence-dictated positioning. Genome Research. 2008, 18(7), ISSN VAN DIJK, Erwin L., Hélène AUGER, Yan JASZCZYSZYN a Claude THERMES. Ten years of next-generation sequencing technology. Trends in Genetics. 2014, 30(9), ISSN WANG, Yue, Qiuping YANG a Zhimin WANG. The evolution of nanopore sequencing. Frontiers in Genetics. 2015, 5, - [cit ]. ISSN ZHANG, Jun, Rod CHIODINI, Ahmed BADR a Genfa ZHANG. The impact of nextgeneration sequencing on genomics. Journal of Genetics and Genomics. 2011, 38(3), ISSN ZWART, Hub. Human Genome Project: History and Assessment. International Encyclopedia of the Social & Behavioral Sciences [online]. 2. Nijmegen: Elsevier, 2015, s [cit ]. ISBN Dostupné z: ZWART, Hub. Understanding the Human Genome Project: a biographical approach. New Genetics and Society. 2008, 27(4), ISSN

53 SEZNAM OBRÁZKŮ Obrázek č. 1: Autoradiografický snímek sekvenačního gelu s komplementárními řetězci 64 bp fragmentu DNA Obrázek č. 2: Autoradiografický snímek polyakrylamidového gelu a odečet sekvence Obrázek č. 3: Očekávaný vývoj cen a dokončení sekvenování lidského genomu na konci druhé fáze Obrázek č. 4: Záznam inkorporace nukleotidů u metody Ion Torrent Obrázek č. 5: Snímek z reakční komůrky HeliScope Obrázek č. 6: Nanopór pro sekvenaci DNA Obrázek č. 7: Teplotní profil PCR reakce Obrázek č. 8: Teplotní profil sekvenační PCR reakce Obrázek č. 9: Vývoj počtu vědeckých prací Obrázek č. 10: Vývoj počtu vědeckých prací za posledních 5 let Obrázek č. 11: Počet vědeckých prací na jednotlivé metody Obrázek č. 12: Počet vědeckých prací na jednotlivé metody mimo Sangerovy

54 SEZNAM TABULEK Tabulka č. 1: Reakční směs PCR reakce Tabulka č. 2: Reakční směs sekvenační PCR reakce Tabulka č. 3: Počet vědeckých prací u jednotlivých metod

55 SEZNAM ZKRATEK 32 P Radioaktivní fosfor A ABI APS ASIC ATP C CCD CGA CMOS cpal ddatp ddctp ddgtp ddntp ddttp dgtp DNA DNB dntp empcr EtBr G HGP IHGSC Adenin Applied Biosystems Peroxodisíran amonný Application-specific integrated circuit Adenosintrifosfát Cytosin Charged Coupled Device Complete Genome Analysis Komplementární methyloxidový polovodič Combinatorial probe anchor ligation Dideoxyadenozintrifosfát Dideoxycytidintrifosfát Dideoxyguanozintrifosfát Dideoxynukleotidtrifosfát Dideoxytymidintrifosfát Deoxyguanidintrifosfát Deoxyribonukleová kyselina DNA nanoball Deoxynukleotidtrifosfát Emulzní PCR Etidiumbromid Guanin Projekt lidského genomu Mezinárodní konsorcium sekvenující lidský genom 55

56 Micro-TAS NGS nt PCR PGM PPi QV RCA RNA SBS SDS-PAGE SMRT SOLiD SSD T TBE tsms U USB V WGS Micro Total Analysis System Sekvenování nové generace Nukleotid Polymerázová řetězová reakce Personal Genome Machine Pyrofosfát Quality Value Rolling circle amplification (amplifikace valivého kruhu) Ribonukleová kyselina Sekvenování pomocí syntézy Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsíranu sodného Single Molcule Real Time Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection Solid State Drive Thymin Trisborátový pufr True Single Molecule Sequencing Uracil Universal Serial Bus Volt Celogenomové sekvenování 56

57 SEZNAM PŘÍLOH Příloha č. 1: Pracovní postupy jednotlivých metod Příloha č. 2: Srovnání jednotlivých metod Příloha č. 3: Vlastní fotografie Příloha č. 4: Sekvenování

58 PŘÍLOHY Příloha č. 1: Pracovní postupy jednotlivých metod \ Obrázek č. 1: Schéma Maxam-Gilbertovy sekvenační metody (zdroj: upraveno) 58

59 Obrázek č. 2: Pracovní postup Sangerovy sekvenační metody (zdroj: universe-review.ca, upraveno) Obrázek č. 3: Pracovní postup sekvenační metody Illumina (zdroj: seqanswers.com, upraveno) 59

60 Obrázek č. 4: Pracovní postup sekvenační metody 454/Roche (nature.com, upraveno) Obrázek č. 5: Pracovní postup sekvenační metody DNA nanoball (zdroj: nature.com, upraveno) 60

61 Obrázek č. 6: Pracovní postup sekvenační metody SOLiD (zdroj: Mardis, 2008) Obrázek č. 7: Pracovní postup sekvenační metody IonTorrent (zdroj: genomics.cn, 2015) 61

62 Obrázek č. 8: : Pracovní postup sekvenační metody IonTorrent (zdroj: Shendure et al. 2005) Obrázek č. 9: Pracovní postup sekvenační metody HeliScope (zdroj: Purdy et al., 2010, upraeno) 62

63 Obrázek č. 10: Pracovní postup sekvenační metody IonTorrent (zdroj: Greninger et al, upraveno) 63

64 Obrázek č. 11: Praconí postup při použití kitu BigDye XTerminator (zdroj: 64

65 Příloha č. 2: Srovnání jednotlivých metod Obrázek č. 12: Srovnání jednotlivých NGS technologií (A) Maximální délka čtení; (B) maximální množství výstuních dat; (C) cena za sekvenaci lidského genomu; (D) délka trvání jednoho runu pro sekvenování bakteriálního genomu (Erwin et al., 2014) 65

66 Příloha č. 3: Vlastní fotografie Fotografie č. 1: Sekvenátor MinION (zdroj: vlastní fotografie) Fotografie č. 2: Kapilární sekvenátor ABI Prism 3500 Genetic Analyzer (zdroj: vlastní fotografie) 66

67 Příloha č. 4: Sekvenování Obrázek č. 13: Získaná sekvence (zdroj: vlastní tvorba) Obrázek č. 14: Pracovní prostředí softwaru Peak Scanner v1.0 (zdroj: vlastní tvorba) Obrázek č. 15: Určení podobnosti zkoumaného genomu s genomy v databázi (zdroj: vlastní tvorba) 67

68 Obrázek č. 16: Allignment zkoumané sekvence s referenční (zdroj:vlastní tvorba) Obrázek č. 17: Lišaj lipový (Mimas tiliae) (zdroj: Descouens, 2013) 68