Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

Transkript

1 Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

2 Genomika (KBB/GENOM)

3 SNPs Odvozování a genotyping Ing. Hana Šimková, CSc.

4 Cíl přednášky - seznámení s problematikou hledání SNP, odvozování SNP markerů a charakterizací genotypu (genotyping) Klíčová slova - SNP markery, SNP genotyping, resekvenování, sekvenování pomocí hybridizace, heteroduplexy, minisekvenační metody, metody založené na fluorogenních systémech, Illumina GoldenGate Assay

5 SNP A GENOTYPING Objevování SNP A) resekvenováním - SNP se nacházejí na základě porovnávání sekvencí získaných z různých jedinců, genotypů, linií 1. Identifikace SNP srovnáním celogenomové sekvence s cdna sekvencemi v GenBank srovnáním ESTů v databázích s využitím statistických programů (např. PolyBayes odhaluje nepravé SNP) srovnáním genomových sekvencí z různých jedinců 2. Ověření SNP resekvenováním úseku DNA kolem SNP z jedinců metodami používanými pro genotyping

6 Resekvenování cílových oblastí NimbleGen Sequence capture - zachycení cílových sekvencí ze vzorků fragmentované genomické DNA hybridizací na mikročip - na mikročipu naneseny sondy pro cílové oblasti - např. exony nebo oblasti vykazující asociaci s chorobami - odmytí nenavázaných fragmentů - vymytí a amplifikace zachycených fragmentů - osekvenování pomocí technologie 454 Mikročipy vyráběny na zakázku - sestava sekvencí dle přání zákazníka - až 5 Mb sekvencí

7 B) nalezením polymorfismů bez sekvenování a) metody vycházející ze specifických vlastností heteroduplexní DNA (= dvouřetězcová DNA, kde každý řetězec nese jinou alelu, vytváříme ji in vitro) je méně stabilní než homoduplex, dříve denaturuje - vzniká po PCR amplifikaci studovaného lokusu, následované denaturací a renaturací tvorba homoduplexů a heteroduplexů DHPLC (denaturující HPLC) produkty PCR po renaturaci se nanesou na chromatografickou kolonu, eluce fragmentů za pomoci organického rozpouštědla. Heteroduplexy jsou pomalejší. DGGE (denaturující gradientová gelová elektroforéza) na polyakrylamidovém gelu s denaturačním gradientem (močovina). Heteroduplexy denaturují dříve zpomalí se. TILLING (cíleně indukovaná lokální léze v genomech)

8 TILLING (targeting induced local lesions in genomes) - k detekci SNP (EcoTILLING) a indukovaných mutací (TILLING) Založena na schopnosti nukleáz specifických pro jednořetězce štěpit heteroduplexy. Hledání polymorfismu (SNP) mezi jedinci s normálním (N) a mutantním (M) fenotypem: - z obou se naizoluje DNA, pomocí PCR se naamplifikuje určitý úsek (gen), smíchá se, zdenaturuje. Při renaturaci se tvoří jednak homoduplexy (pro N i M genotyp), jednak heteroduplexy. Ty jsou v místě nesouladu (mismatch) roštěpeny nukleázou na sekvenátoru u heteroduplexu místo 1 fragmentu 2. Pro hlavní modelové organismy se připravují kolekce primerů pro všechny lokusy v genomu umožní proskrínovat polymorfismy v celém genomu. EcoTILLING nebo nebo Denaturace, zchlazení Normální Mutant Heteroduplex Analýza na PA gelu nebo sekvenátoru Gibson a Muse, 2004

9 b) metoda založená na detekci heterozygotů SSCP (single-stranded conformation polymorphism) analýza = polymorfismus konformace jednořetězců DNA zdenaturována a nanesena na nedenaturační polyakrylamidový gel. Elektroforéza při 4 C DNA nerenaturuje, ale tvoří intramolekulární sekundární struktury. Každé vlákno jiná sekundární struktura (konformace). Řetězec W AA aa Aa Denaturace formamidem a teplem Řetězec C Homozygot 2 konformace 2 proužky na elektroforéze Heterozygot 4 konformace 4 proužky na elektroforéze Nižší kapacita, fragmenty jen do 400 bp Gibson a Muse, 2004

10 SNP genotyping - charakterizace genotypů pomocí SNP A) Low-tech metody ASO (alelově specifická oligohybridizace) - cílová sekvence amplifikována z jednotlivců v 96-jamkových miskách přenos na membránu, hybridizace s krátkými oligonukleotidy (15-bp) za velmi přísných podmínek signál jen při 100% komplementaritě PCR-RFLP - amplifikace specifického fragmentu pomocí PCR + štěpení produktu restriktázou (zachytí SNP v rekogničním místě) = CAPS Gibson a Muse, 2004

11 dcaps (vytvořené štěpitelné amplifikované polymorfní sekvence) Amplifikace + štěpení. PCR primer navržen tak, že pro jednu z alel (A) se za použití speciálního primeru vytvoří rekogniční místo pro restriktázu po štěpení restriktázou vzniká pro alelu A fragment o něco kratší Alela T Dlouhý produkt Alela A Štěpený produkt Gibson a Muse, 2004

12 B) Minisekvenační metody - sekvenuje se pouze 1 nebo několik nukleotidů SBE (prodloužení jedné báze) - prodloužení 3 konce primeru o jediný nukleotid ddntp (ukončí reakci) je fluorescenčně značený. Primer se váže svým 3 koncem 1 bázi před SNP místo. Multiplexing - jako templát slouží produkty multiplexní PCR (naamplifikované fragmenty DNA pro několik různých SNP). Reakce může probíhat - na čipu (primery fixovány) - v roztoku k rozlišení jednotlivých SNP: a) primery různých délek b) vychytání produktů SBE na mikrokuličky na základě zip kódu pro jednotlivé primery SBE na čipu Gibson a Muse, 2004 (amplifikace analyzovaných lokusů) Izolace cílové ssdna zachycením na kuličky se streptavidinem SBE v roztoku

13 ad b) vychytání produktů SBE na mikrokuličky -kuličky separovány průtokovým cytometrem na základě barevného kódu (viz přednáška Analýza exprese) -kuličky fixovány na arrayi (viz Illumina genotyping) c) K separaci jednotlivých produktů SBE lze místo fluorescence použít hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF do reakce přidán jen jeden typ ddntp (+ ostatní dntps) pokud odpovídá variantě v SNP, reakce se ukončí hned, jinak až po několika nukleotidech. MALDI-TOF rozliší oba typy produktů podle velikosti, případně náboje. Lze provádět paralelně analýzu 384 vzorků.

14 Pyrosekvenování -může se provádět v 96-jamkových mističkách. Detekce v reálném čase. Může určit také frekvenci výskytu alely ve studované populaci semikvantitativní metoda. A A A Gibson a Muse, 2004

15 C) Homogenní metody založené na fluorogenních barvičkách Homogenní testy v 1 reakci v roztoku (spojení amplifikace s genotypingem). Založeny na a) ASO a použití 2 fluorescenčních barviček s překrývajícími se spektry reportér (R) a zhášeč (Q) detekovány v průběhu PCR (v misce, kapiláře). Pokud jsou v těsné blízkosti (např. 2 konce krátkého oligonukleotidu), není detekována fluorescence reportéru TaqMan 5 exonukleázový test využívá exonukleázové aktivity Taq polymerázy (při extenzi nového řetězce postupně odbourává sondu fluorescence) Molekulární majáky (Molecular beacons - MB) - majáky jsou alelově specifické oligonukleotidy obklopené krátkými inverzními repeticemi vzniká vlásenka se smyčkou R a Q blízko sebe nevzniká fluorescence. Po 100% hybridizaci na templát se R a Q dostanou od sebe vzniká fluorescence (může být alelově specifická) Do reakce sondy pro obě alely SNP (s 2 různými barvičkami) + primery pro amplifikaci lokusu SNP Gibson a Muse, 2004

16 b) alelově specifické ligaci a přenosu energie fluorescenční rezonancí (FRET) DOL (dye-labeled oligonucleotide ligation assay). Donor v dostatečné blízkosti stimuluje fluorescenci reportéru. SNP Gibson a Muse, 2004 Do reakce - polymeráza - primery + 3 oliga (2 různě značené sondy pro 2 alely SNP) - termostabilní ligáza PCR nejprve při vyšší, pak nižší T a (k nasednutí sond)

17 c) rozdílech v teplotě tání amplikonů HRM analýza (high-resolution melting analysis) Vybraný lokus je amplifikován, vzniklá dsdna se nabarví fluorescenční barvičkou interkalátor fluorescence jen dokud je DNA dvouřetězcová Real-time PCR fluorescence je měřena křivka teploty tání (high-resolution melting curve) Pomalá denaturace amplikonu Rozdíl jediného nukleotidu mění tvar křivky Lze rozlišit heterozygota od obou typů homozygotů

18 Illumina vysokokapacitní metoda k určení genotypu na velkém souboru SNP (v krátkém čase a za rozumnou cenu).

19 Co to vlastně Illumina je? Je to systém kombinující několik komponentů: - miniaturizovanou array jednotlivých arrayí (Sentrix Array Matrix) - konfokální skenr s vysokým rozlišením (BeadArray Reader) - vysoce multiplexní analýza genotypu (GoldenGate Assay)

20 Jak vypadá Sentrix Array Matrix? Tvoří ji : 96 miniaturních arrayí (každá o průměru 1,2 mm) uspořádaných do matrice 8x12. každá array je tvořena cca optickými vlákny spojenými do svazku každé má na konci jamku a v ní kuličku o průměru 3 µm na každé kuličce je kovalentně navázáno několik stejných oligonukleotidů (=illumicode=adresa) illumicode #561 /\/\/\/ illumicode #217 /\/\/\/ illumicode #1024 /\/\/\/

21 Jednomu analyzovanému SNP lokusu odpovídá 1 typ kuličky určený specifickým illumi kódem (adresou). Analyzuje se až 1536 lokusů, v každé miniarrayi máme tedy 1536 typů kuliček, každý typ cca 30x. Na 96 miniarrayích jedné Sentrix Array Matrix analyzujeme současně 96 vzorků DNA.

22 Jak probíhá vlastní analýza genotypu? GoldenGate Assay 1) Upevnění genomické DNA na paramagnetické kuličky a její denaturace Biotin

23 2) Allelově specifická extenze a ligace - pro každý lokus navrženy 3 oligonukleotidy: 2 z 5 konce, liší se polymorfním nukleotidem na konci 1 z 3 konce charakterizuje lokus a obsahuje illumicode adresu Genomová DNA [T/C] [T/A] Universal PCR Sequence 1 Universal PCR Sequence 2 A G illumicode Address Universal PCR Sequence 3

24 ad 2) Allelově specifická extenze a ligace Genomová DNA [T/C] Ligase [T/A] Polymerase Universal PCR Sequence 1 Universal PCR Sequence 2 A G illumicode Address Universal PCR Sequence 3

25 3) Amplifikace+inkorporace fluorescenční barvičky Amplifikace templátu PCR s univerzálními primery Cy3 Universal Primer 1 Cy5 Universal Primer 2 A illumicode #561 Universal Primer P3

26 4) Hybridizace na univerzální IllumiCode TM Array illumicode #561 /\/\/\/ illumicode #217 /\/\/\/ illumicode #1024 A/A T/T A/T /\/\/\/

27 4) Odečtení výsledků (BeadArray Reader) a interpretace získaných dat

28 Jak se získaná data využívají? Pro rozsáhlé asociační mapování, které může odhalit genetický základ komplexních dědičných chorob Pro konstrukci genetických map Konsensuální genetická mapa ječmene získaná z 3 DH mapovacích populací na základě Pilot Oligo Pool Assay (OPA1) Mapovací populace - celkem 480 jedinců 1536 SNP genotypováno současně $68,000 za 480 vzorků (5 x 96) 737,280 genotype calls za 3-4 dny 9.2 cents za data-point Při větším počtu vzorků nižší náklady