Real-time PCR Testy pro detekci Treponema pallidum ssp. pallidum v klinických vzorcích s využitím LightCycleru TM Roche

Transkript

1 MUDr Emil Pavlík, CSc., Ústav imunologie a mikrobiologie 1.LF UK Praha Doc. MUDr. Jaromír Køemen, CSc., MUDr. Jana Støíbrná, CSc., Ústav biochemie a experimentální onkologie 1.LF UK Praha MUDr. Hana Zákoucká, MUDr. Magdalena Knappová, NRL pro diagnostiku syfilis, VFN Praha Real-time PCR Testy pro detekci Treponema pallidum ssp. pallidum v klinických vzorcích s využitím LightCycleru TM Roche Podle údajù ÚZIS (Tab. 1) došlo v letech na území ÈR k výraznému vzestupu poètu prokázaných infekcí Treponema pallidum subspecies pallidum (TPP), jež je vyvolavatelem syfilis. Vrcholem byl rok 2001, kdy bylo zaregistrováno pøípadù tohoto onemocnìní. Od roku 1990 se v ÈR opìt objevuje kongenitální syfilis s kulminací v r pøípadù. Toto závažné postižení plodu je ve vyspìlých zemích považováno za zbyteèný dùsledek opomíjení rutinní diagnostiky syfilis u gravidních žen nebo jejího selhání. Tab. 1: Pøehled výskytu získané a vrozené syfilis v letech , (ÚZIS ) Souèasná diagnostika syfilis využívá plejádu pøímých i nepøímých sérologických testù, není však bez úskalí. Užití molekulárnì biologických technik k identifikaci TPP by mohlo pomoci vyøešit nìkteré problémy v laboratorní diagnostice. Jejich zavedení doporuèují i Metodická o- patøení vydaná MZÈR v r (Vìstník MZ ÈR èástka 10 - prosinec Standardy léèebných a vyšetøovacích postupù - III. èást, standard /97 - str ). Využití PCR (polymerázové øetìzové reakce) k pøímému prùkazu DNA TPP v suspektních lézích a v liquoru pøináší témìø 100% specifitu, nebo v naší zemìpisné oblasti se vyskytující jiná treponemata mají pouze 5% homologii genomu s TPP. PCR umožòuje amplifikovat cílovou oblast v genomu TPP nejménì 10 6 x. Umožòuje rovnìž genotypizaci na základì rodovì specifických sekvencí i kvantifikaci mikroorganismù, rozlišení živých a mrtvých bunìk na základì genové exprese pomocí RT-PCR (reverzní PCR), prùkaz DNA TPP v biologických archivních materiálech atp. Lze vyšetøovat rùzné druhy biologického materiálu - stìry z lézí, biopsie, plnou krev, mozkomíšní mok, tkánì, amniovou tekutinu, placentární trofoblastické klky i do parafinu zalité tkánì (4,5,6). Materiál není nutné zpracovávat bezprostøednì po odbìru a je možné jej pøepravovat bez zvláštních opatøení (12). V posledních 10 letech byla technologie PCR v diagnostice syfilis používána pøevážnì na specializovaných pracovištích v USA pøedevším k vìdeckým úèelùm studovaným na zvíøatech - králících (7,13) nebo morèatech (10). Dosud však nebyla publikována sdìlení o verifikovaném využití PCR nebo jejího ekvivalentu v rutinní klinické diagnostice syfilis. Kompletní vyøešení primární struktury Treponema pallidum subsp. pallidum (14), volná pøístupnost genové databáze TPP i stávající znalosti proteomiky TPP umožòují vyhledávat specifické sekvence vhodné pro pøímou identifikaci tohoto primárnì patogenního mikroba. Pro vývoj detekèního testu jsme použili publikovaných primérù s ovìøenou druhovou specifitou s využitím on-line databáze NCBI Blast. (Tab. 2-4). Odbìr materiálu: 1) krev - venepunkcí periferní žíly po pøedchozí dezinfekci do uzavøených vakuových zkumavek pro odbìr srážlivé krve (bez pøísad) a nesrážlivé krve (s 0,072ml 7,5% EDTA jako antikoagulantu). 2) liquor (CSF) - standardním zpùsobem na neurologických klinických pracovištích lumbální punkcí. 10 Labor Aktuell

2 Obr. 1: Schéma TaqManTM assay Tab. 2: Pøehled testovaných genù a použitých primerù 3) stìr z kožních nebo sliznièních lézí - komerèní soupravou Amplicor (STD Specimen Collection and Transport Kit - Roche Diagnostics), pùvodnì urèenou pro odbìry na vyšetøení Neisseria gonorrhoe a Chlamydia trachomatis. Pøíprava vzorku k amplifikaci (izolace DNA): Po odzkoušení øady komerèních izolaèních kitù se ukázaly jako nejvhodnìjší Whole Blood Specimen Preparation Kit a STD Specimen Preparation Kit (Roche Diagnostics). Soubor pro evaluaci vyvíjených PCR testù: Do tohoto souboru bylo zaøazeno 101 klinických pacientù v následujících skupinách: syfilis primaria 17, syfilis secundaria 31, syfilis congenita 4, syfilis latens recens 30, k vylouèení syfilis 19. TPP kmen Nichols: Jako pozitivní kontrola a pro kalibraci PCR technik byla v NRL pro dg. syfilis pøipravena suspenze živých virulentních spirochet Treponema pallidum subsp. pallidum (TPP) kmen Nichols mechanickou extrakcí na Khanovì lineární tøepaèce (frekvence 120 kmitù/min, amplituda 5,0 cm, 30minut) z desintegrované testikulární tkánì králíkù do sterilního isotonického 0,9% fyziologického roztoku. Bunìèný detritus byl odstranìn opakovanou (trojnásobnou) centrifugací 1200 ot./min à 10 minut. TPP kmen Nichols je NRL pro dg. syfilis pasážován na laboratorních zvíøatech (králièích samcích plemene Novozélandský bílý) v souladu se zákonem na ochranu zvíøat proti týrání ÈNE è. 246/1992 Sb. a provádìcí vyhlášky MZem. ÈR è.311/1997 Sb. na základì schváleného projektu pokusu (Etická komise 1.LF UK pro práci s laboratorními zvíøaty) a povolení MZ ÈR è.113/2001 (s platností do ). Tkáò varlat je odebírána post mortem za sterilních kautel a v souladu s pøedpisy pro zpracování a likvidaci infekèního materiálu. Poèet treponem v suspenzi byl stanoven mikroskopickým vyšetøením v temném poli s pomocí Fast - Read 102 NEW GRID (Dispolab s.r.o.) na principu Neubauerovy poèítací komùrky. Získaný poèet bunìk odpovídá poètu bunìk v 1µl. (tab. 2) Gen 47 kda (Tp 47 kda) hlavního membránového lipoproteinu Treponema pallidum (GeneBank M88769) a gen polymerasy A (I) - Tp Pol-I (GeneBank U57757) se ukázaly jako optimální a byly používány jako TPP-specifické cílové sekvence pro vyvíjené metody real-time PCR. Real-time PCR pro prùkaz Treponema pallidum: Zvolené cílové geny Tp PolA (GeneBank U57757) a Tp 47 kda (GeneBank M88769) byly testovány ve 2 formátech: 1) FRET ( hybridization probes ) a 2) TaqMan. V obou pøípadech byl jako amplifikaèní systém použit LightCycler FastStart DNA MasterPLUS Hybridization Probes (Ro-che Molecular Systems) doplnìný o LC-Uracil-N-glycosylase (Roche Molecular Systems). Pro formát FRET byly primery a sondy navrženy firmou TIB-MolBiol, SRN. První sonda byla znaèena na 3 konci R-640 a druhá mìla na 5 -konci fluorescein a fosfátem blokovaný 3 -konec. Jako vnitøní koamplifikaèní kontrola byl použit systém LightCycler - Control Kit DNA (Roche Molecular Systems), s první sondou znaèenou na 3 -konci R-708. Pro kinetickou real-time PCR byl použit LightCycler (ROCHE) za daných amplifikaèních podmínek: 37 C/15 min (inkubace s AmpErase TM ); 95 C/10 min (inaktivace AmpErase TM a aktivace Fast Taq Polymerase); 55 cyklù: 95 C/10s, 62 C/15s, 72 C/12s; ochlazení na 40 C. (Tab. 3) Ve formátu TaqMan TM (schéma obr. 1) byly TaqMan-sondy pro gen 47 kda Labor Aktuell 11

3 Tab. 3.: Pøehled primerù a sond formátu FRET Syfilis congenita, Syfilis latens, suspektní Sy I, susp. Sy II, susp. Sy congenita, kontakt s nem. Syfilis, k vylouèení syfilis. Vzorky byly vyšetøeny paletou klasických diagnostických testù pøímých i nepøímých (Tab. 5 + mikroskopie v zástinu). Za pozitivní pro potøeby evaluaèní studie byly považovány vzorky pozitivní v pøímém prùkazu a alespoò ve 4 sérologických testech. Pokud vzorek nemohl být vyšetøen pøímou technikou, musela být klinická diagnóza potvrzena pozitivitou více než 5 sérologických testù. Výsledky jsou shrnuty v následujících tabulkách: Tab. 6: PCR FRET pol I Sensitivita: 85.42% Specifita: 94.34% PPV: 93.18% NPV: 87.72% Tab. 4: Pøehled primerù a sond formátu TaqManTM Tab. 7: PCR FRET 47 kda Sensitivita: 83.67% Specifita: 96.15% PPV: 95.34% NPV: 86.20% Tab. 5: Pøehled sérologických technik pro diagnostiku syfilis a Pol-I syntetizovány na zakázku firmou Maxim Biotech Inc., USA, primery byly optimalizovány a syntetizovány firmou TIB-MolBiol. Podmínky real-time PCR byly: 37 C/15 min (inkubace s AmpErase TM ); 95 C/10 min (inaktivace AmpErase TM a aktivace Fast Taq Polymerase); 55 cyklù: 95 C/10s, 62 C/60s; ochlazení na 40 C. (Tab. 4, 5) Interní kontrola: Jako interní kontrola byla v testech použita koamplifikace se sekvencí DNA z tpa genu nebo beta-aktinového genu s následnou detekcí pøíslušnou sondou odpovídající formátu testu. Výsledky evaluaèní studie PCR testù: Treponema pallidum subsp. pallidum: 1. Real-time PCR využívající FRET-sondy pro amplifikaci a detekci sekvence z genu pol I (PCR FRET pol I) 2. Real-time PCR využívající FRET-sondy pro amplifikaci a detekci sekvence z genu 47 kda (PCR FRET 47 kda) 3. PCR TaqMan TM amplifikující a detekující sekvenci z genu pol I (TaqMan Pol I) 4. PCR TaqMan TM amplifikující a detekující sekvenci z genu 47 kda (TaqMan 47kDa) Pro evaluaèní studii byly použity klinické vzorky 101 pacientù s tìmito diagnózami: Syfilis I, Syfilis II, Syfilis III, Tab. 8: TaqManTM pol I Sensitivita: 87.50% Specifita: 96.15% PPV: 95.45% NPV: 89.29% Tab. 9: TaqManTM 47 kda Sensitivita: 85.71% Specifita: 94.34% PPV: 95.45% NPV: 87.72% Na základì pilotních pokusù se známými koncentracemi treponem laboratorního kmene Nichols byly pøipraveny 4 formáty real-time PCR testù pro detekci DNA Tab. 10: Sensitivita, specifita, pozitivní prediktivní hodnota a negativní prediktivní hodnota jednotlivých variant PCR testù 12 Labor Aktuell

4 Zajímavé je i porovnání sensitivity a specificity testù u jednotlivých skupin klinických k diagnóz stadií syfilis: (tab. 10) 2. skupina: Vzorky s diagnózou Syphilis congenita 1. skupina: Vzorky pacientù s diagnózami Syphilis primaria, susp. Syphilis primaria, k vylouèení syfilis, kontakt se syfilis Tab. 11: PCR FRET pol I, PCR FRET 47 kda* *Obìma formáty testu bylo dosaženo identických výsledkù Sensitivita: 92.86% Specifita: 100% PPV: 100% NPV: 95.24% Tab. 14: Kongenitální syfilis Všemi 4 testy PCR bylo dosaženo shodných výsledkù. Negativní vzorek byl negativní i ve všech sérologických testech a v zástinu. 3. skupina: Vzorky s diagnózami Syphilis secundaria a suspektní syfilis II Tab. 17: TaqManTM 47 kda Sensitivita: 80% Specifita: 100% PPV: 100% NPV: 54.55% 4. skupina: Vzorky pacientù s diagnózou Syphilis latens Tab. 18: PCR Pol I / 47 kda - ELISA Sensitivita: 71.43% Specifita: 95.65% PPV: 83.33% NPV: 91.66% Tab. 12: TaqManTM pol I Sensitivita: 92.31% Specifita: 100% PPV: 100% NPV: 95.24% Tab. 15: PCR 47 kda - FRET, PCR pol I - FRET Sensitivita: 76.00% Specifita: 100% PPV: 100% NPV: 50% Obìma testy bylo dosaženo identických výsledkù. Tab. 19: PCR FRET 47 kda Sensitivita: 83.33% Specifita: 91.66% PPV: 71.43% NPV: 95.65% Tab. 13: TaqManTM 47 kda Sensitivita: 92.86% Specifita: 100% PPV: 100% NPV: 95.24% Tab. 16: TaqManTM pol I Sensitivita: 84% Specifita: 100% PPV: 100% NPV: 60% Tab. 20: PCR FRET pol I Sensitivita: 100% Specifita: 88% PPV: 62.5% NPV: 100% Tab. 21: TaqManTM pol I Sensitivita: 83.33% Specifita: 91.66% PPV: 71.43% NPV: 95.65% Tab. 22: TaqManTM 47 kda Sensitivita: 100% Specifita: 88% PPV: 62.50% NPV: 100% Diskuse: Obr. 2: LightCycler TM: kalibrace s použitím TPP kmene Nichols V rámci øešení našeho výzkumného projektu byly pøipraveny dva rùzné formáty testù prokazujících DNA Treponema pallidum subsp. pallidum pomocí real-time Labor Aktuell 13

5 Tab. 23: Souhrnné výsledky PCR testù ve skupinách diagnóz PCR. Každý z formátù byl pøipraven ve dvou variantách primerù a hybridizaèních sond komplementárních k sekvencím dvou rozdílných genù TPP - pol I a 47kDa. Tyto 4 pøipravené testy, titrované s pomocí známých koncentrací TPP laboratorního kmene Nichols, kdy byla prokázána citlivost každého z nich < 50 treponem v ml vzorku, byly evaluovány ve studii využívající vzorky 101 pacientù s diagnózou syfilis v rùzných stadiích onemocnìní, pøípadnì podezøení na toto onemocnìní. Pøi pohledu na údaje o více než 2000 onemocnìních syfilis hlášených za dobu trvání grantu (Tab. 1) se mùže zdát poèet 101 pacientù pro evaluaèní studii nízký. Je však tøeba si uvìdomit, že sensitivita mnoha klasických testù rovnìž není 100 %-ní a navíc vyžadují odbìr rozdílných typù vzorkù (napø. stìr z lézí pro pøímé dg. testy a krev pro sérologii). Proto bylo rozhodnuto považovat za zlatý standard pro porovnávání diagnostických technik klinickou diagnózu syfilis potvrzenou pøímými i sérologickými testy. Od všech pacientù proto bylo tøeba získat jak materiál z lézí, tak krev pro sérologické vyšetøení, obojí navíc v dostateèném množství. Koneèné výsledky studie ukazují, že není významný rozdíl mezi testy stejného formátu používajícími primery a sondy komplementární k sekvencím genù pol I a 47kDa. Nejcitlivìjší se ukázaly být aplikace Taq- Man TM, jejichž sensitivita 87.50%, resp % pøi specifitì 96.15%, resp % je velmi dobrá (Tab. 10). Syfilis congenita (Tab. 14), 2. skupina: zde pro nízkou èetnost skupiny (4 vzorky) neuvádíme výpoèty. Ze 4 dìtí s klinickou diagnózou Syfilis congenita byla tato u 3 dìtí potvrzena, u 1 dítìte vylouèena. Ve všech pøípadech se projevila naprostá shoda ve výsledcích molekulárnì biologických testù, klasických pøímých detekcí a sérologických vyšetøení. Obr. 3: LightCyclerTM: Výsledky vyšetøení 5 vzorkù z evaluaèní studie Pøestože soustavnì monitorujeme odbornou literaturu i kongresy a sympozia doma i v zahranièí (International Society for Infectious Diseases, American Society for Microbiology, European Society for Clinical Microbiology and Infectious Diseases), dosud jsme zaznamenali minimum studií obdobného tématu a rozsahu. PCR v diagnostice syphilis byl vìnován jediný pøíspìvek ruských autorù na 10. kongresu ICID v Singapuru, šlo však o více ménì experimentální použití této techniky na malém poètu vzorkù. Na 13. evropském kongresu ESCMID v Glasgowì v kvìtnu 2003 jsme byli jediní, kdo se problematice syphilis vìnoval, nebo autoøi pøíspìvku PCR in whole blood in diagnosis of syphilis Shakhmatov a spol. nedorazili. Podle údajù v abstraktu šlo o nested-pcr amplifikující sekvenci z genu 47 kda se sensitivitou 62.5% a specifitou 93.4% na souboru 186 vzorkù plné krve (24). Naše techniky jsou v tomto srovnání znaènì citlivìjší, navíc jsou vybaveny interní kontrolou na principu koamplifikace, detekovanou samostatnou hybridizaèní sondou. Závìry: 1. Souèástí vývoje testù byla optimalizace postupù pro izolaci DNA z klinického vzorku i výbìr vyhovujících komerèních odbìrových souprav. 2. Všechny modifikace testù obsahují interní kontrolu aktivity polymerázy na principu koamplifikace kontrolní nukleo- 14 Labor Aktuell

6 vé kyseliny z tpa genu nebo beta-aktinového genu spoleènì s prokazovanou DNA ze vzorku. Primery ani detekèní sondy interní kontroly neinterferují s DNA TPP. 3. Všechny modifikace testù obsahují systém AmpErase TM chránící vyšetøovaný vzorek pøed kontaminací syntetickými amplikony z prostøedí laboratoøe. 4. Jako zlatý standard pro evaluaci nových laboratorních technik byla zvolena klinická diagnóza pacienta ovìøená laboratorním prùkazem paletou pøímých a sérologických testù. 5. Evaluaèní studie prokázala, že není významný rozdíl ve výsledcích testu, prokazujeme-li sekvenci z genu pol I nebo z genu 47 kda. 6. Testy jsou použitelné pro rutinní prùkaz TPP v I., II. i III. stadiu syfilis, a již v plné krvi nebo ve stìrech z lézí, pøípadnì liquoru. 7. Lze jimi prokázat i kongenitální syfilis. Jejich použití však nevyøeší nìkteré problémy pøi diagnostice latentní syfilis. 8. Uvedené testy jsou užiteèným nástrojem pro rutinní diagnostiku syfilis, nejsou však zázrakem, øešícím její úskalí natolik, aby je mohla využívat libovolná terénní laboratoø bez rizika omylu. 9. Lze tedy doporuèit, aby souèasný organizaèní model pro diagnostiku syfilis zùstal zachován a novì vyvinuté techniky doplnily stávající diagnostické spektrum ve specializovaných laboratoøích. 10. Po shromáždìní dostateèného množství zkušeností z rutinního používání nových testù bude možno uvažovat o pøehodnocení tzv. zlatého standardu laboratorní diagnostiky syfilis. Studie realizována za podpory grantu IGA MZ ÈR è. NI Literatura: 1) Srinivasan D.K. et al.: Congenital syphilis: a diagnostic and therapeutic dilema. Pediatr. Infect. Dis. 2, 1983: ) Hart, G.: Syphilis tests in diagnostic and therapeutic decision making, Ann. Intern. Med. 104, 1986, ) Hook, E.W. III.: Syphilis and HIV. J. Infect. Dis. (1989), 160, ) Burstain J. M. et al.: Sensitive Detection of Treponema pallidum by using the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 29, 1991: ) Grimprel E. et al.: Use polymerase chain reaction and rabbit infectivity testing to detect Treponema pallidum in amniotic fluid, fetal and neonatal sera and cerebrospinal fluid. J. Clin. Microbiol. 29, 1991: ) Noordhoek G. T. et al.: Detection by polymerase chain reaction of Treponema pallidum DNA in cerebrospinal fluid from neurosyphilis patients before and after antibiotic treatment. J. Clin. Microbiol. 29, 1991: ) Wicher K. et al.: Detection of Treponema pallidum in early syphilis by amplification. J. Clin. Microbiol. 30, 1992: ) Jethwa H. S. et al.: Comparison of molecular and microscopic techniques for detection of Treponema pallidum in genital ulcers. J. Clin. Microbiol. 33, 1995: ) Orle K. A. et al.: Simultaneous PCR Detection of Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum, and herpes simplex virus types 1 and 2 from genital ulcers. J. Clin. Microbiology 34, 1996: ) Wicher K. et al.: Target organs of infection in guinea pigs with acquired or congenital syphilis. J. Clin Microbiol. 64, 1996: ) Centurio-Lara A. et al.: Detection of Treponema pallidum by sensitive reverse trancriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 35, 1997: ) Villanueve A. V. et al.: Effects of various handling and storage conditions on stability of Treponema pallidum DNA in cerebrospinal fluid. J. Clin. Microbiol. 36, 1998: ) Wicher K. et al.: Identification of persistent infection in experimental syphilis by PCR. Infect. Immun.: 66, 1998: ) Fraser C. M. et al.: Complete genome sequence of Treponema pallidum, the syphilis spirochete. Science 281, 1998: ) Stamm L.V., Bergen H.L.: A point mutation associated with bacterial macrolide resistance is present in both 23S rrna genes of an erytheomycin-resistant Treponema pallidum clinical isolate. Animicrob. Agents Chemother. 44, 2000: ) Sellati TJ. et al.: Virulent Treponema pallidum, lipoprotein, and synthetic lipopeptides induces CCR5 on human monocytes and enhance their susceptibility to infection by human immunodeficiency virus type 1. J. Infect. Dis. 181, 2000: ) Clyne B, Jerrard D.A.: Syphilis testing (1). J. Emerg. Med. 18, 2000: ) Arturo Centurion-Lara, Christa Castro, Jeanne M. Shaffer, Wesley C. Van Voorhis, Christina M. Marra, and Sheila A. Lukehart: Detection of Treponema pallidum by a Sensitive Reverse Transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 35, 1997, ) S. M. Bruisten, I. Cairo, H. Fennema, A. Pijl, M. Buimer, P. G. H. Peerbooms, E. Van Dyck, A. Meijer, J. M. Ossewaarde, and G. J. J. Van Doornum: Diagnosing Genital Ulcer Disease in a Clinic for Sexually Transmitted Diseases in Amsterdam, The Netherlands. J. Clin. Microbiol. 39, 2001, ) Hsi Liu, Berta Rodes, C.-Y. Chen, and Bret Steiner: New Tests for Syphilis: Rational Design of a PCR Method for Detection of Treponema pallidum in Clinical Specimens Using Unique Regions of the DNA Polymerase I Gene. J. Clin. Microbiol. 39, 2001, ) J. Køemen, J. Støíbrná, E. Pavlík, H. Zákoucká and M. Knappová: Detection of Treponema pallidum subsp. pallidum using capture probe detected PCR and Real-Time PCR Formats. Journal of Microbiological Methods Vol. 55/2, p. 516, November 2003, totéž na: 22) J. Køemen, J. Støíbrná, E. Pavlík, M. Knappová, H. Zákoucká: PCR technique for detection of Treponema pallidum ssp. pallidum, P 1098, Clinical Microbiology and Infection Vol. 9, suppl. 1, 2003, p. 258 poster 1098 v plném znìní na Posters2View TM -on -Disk: 13th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Glasgow, May 10-13, 2003 distribuováno všem úèastníkùm kongresu a pøedplatitelùm CMI. 23) J. Køemen, J. Støíbrná, H. Zákoucká, M. Knappová, E. Pavlík: Technika PCR pro prùkaz Treponema pallidum subsp. pallidum, P-B 3, VI. Celostátní sjezd Èeské spoleènosti klinické biochemie s mezinárodní úèastí Pokroky v klinické biochemii, Hradec Králové 2003, s ) Shakhmatov D., Chakova T., Strelchenko O.: PCR in whole blood in diagnosis of syphilis, P1100, Clinical Microbiology and Infection Vol. 9, suppl. 1, 2003, p Labor Aktuell 15