STANOVENÍ AKTIVITY ENZYMU SUPEROXIDDISMUTASY POMOCÍ SOUPRAVY RANSOD V ROSTLINNÉM MATERIÁLU

STANOVENÍ AKTIVITY ENZYMU SUPEROXIDDISMUTASY POMOCÍ SOUPRAVY RANSOD V ROSTLINNÉM MATERIÁLU NATÁLIE BŘEZINOVÁ BELCREDI, JAROSLAVA EHRENBERGEROVÁ, JAROSLAV PRÝMA b PAVLA HAVLOVÁ b Ústv pěstování, šlechtění rostlin rostlinolékřství, Agronomická kult, Mendelov zemědělská lesnická univerzit v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, b Výzkumný ústv pivovrský sldřský,.s., Sldřský ústv Brno, Mostecká 7, 614 00 Brno xbelcre0@node.mendelu.cz Došlo 16.5.06, přijto 10.11.06. Klíčová slov: superoxiddismuts, enzym, Rnsod, ječmen Úvod V poslední době se mnoho vědeckých výzkumů zbývá oxidčním stresem, čímž se rozumí zvýšená přítomnost rektivních orem kyslíku či volných rdikálů, které následně vedou k porušení buňky. Z normálních podmínek je tvorb rektivních orem kyslíku v rovnováze s mechnismy vedoucími k jejich odstrňování. Tento systém se oznčuje jko scvengerový, tzn. zmetčový, který zjišťuje, že rekce probíhjí ve yziologickém rozmezí orgnismus tudíž neohrožují. Mezi nejdůležitější enzymové scvengery ptří superoxiddismuts, ktls, glutthionperoxids glutthionredukts 1. Enzym superoxiddismuts (SOD, EC 1.15.1.1) je zřzen do skupiny oxidoredukts, jeho systemtický název je superoxid/superoxid oxidoredukts 2 byl objeven McCordem Fridovichem jko vysoce ktivní obrnný systém proti působení volných kyslíkových rdikálů 3. SOD ktlyzuje dismutční rekci superoxidu vodíku n méně rektivní peroxid vodíku, který je dále odstrněn ktlsmi peroxidsmi 1,4. Uvedená spontánní rekce je při ph 7 velmi rychlá přesto je urychlen tímto enzymem o dlší čtyři řády (rychlostní konstnt je pk 2 10 9 dm 3 mol 1 s 1 ) (cit. 5 ). Superoxiddismuts byl nlezen u téměř všech orgnismů, které poutjí kyslík 6, v některých erotolerntních nerobech 7, obligátních nerobech 8 rozeznáváme tři druhy SOD lišící se koktorem, kterým je tom kovu (Cu 2+, Zn 2+, Fe 2+, Mn 2+ ). FeSOD MnSOD jsou strukturálně velmi podobné mjí podjednotky o molekulové hmotnosti 23 kd. Obě ormy SOD se vyskytují ve ormě dimeru, le MnSOD se vyskytuje i jko tetrmer 9 obsže- ný v mitochondriální mtrix všech doposud studovných rostlin n rozdíl od FeSOD, která je mnohem méně prostudovná než MnSOD. FeSOD byl nlezen v chloroplstech u některých nlyzovných rostlinných druhů. CuZnSOD je enzym dimerické struktury o celkové molekulové hmotnosti 32 kd, který byl identiikován v cytosolu ve stromtu chloroplstu širokého spektr orgnismů 10 nebo v podobě tetrmeru ve tkáních člověk 2. Náš projekt se zbývl stnovením ktivity enzymu SOD v zrnu ječmene, kde je loklizován především v embryu v menší míře je součástí i leuronové vrstvy. Aktivit SOD v zrnu ječmene se mění v závislosti n odrůdě loklitě pěstování 11 13. SOD hrje důležitou roli nejenom v zrnu ječmene, le tké ve sldu, kde zbrňuje žluknutí během skldování, což se pozitivně může odrážet n výsledném produktu pivovrského průmyslu n pivu. Vyšší ktivit SOD byl zjištěn ve sldu oproti zrnu 13 15. Experimentální část P ř ístroje zř ízení Mletí vzorků zrn bylo provedeno n lbortorním mlýnku Super Jolly SJ 500 (Mezos, Česká republik). Rmutování probíhlo ve rmutovcím přístroji (1-Cube, Česká republik), který je určen pro lbortoře pivovrů sldoven ke stnovení extrktu sldu metodmi KONGRES HARTONG. Rmutovcí přístroj je optřen mikropočítčem, odporovým teploměrem Pt 100, elektromgnetickým ventilem pro utomtické zchlzování rmutovcí lázně, LCD dvouřádkovým displejem, membránovou klávesnicí řídícím sotwrem. N stnovení bsorbnce byl použit UV spektrootometr Cry 1E irmy Vrin (USA) ve spojení s vyhřívcím nosičem n kyvety (Vrin, USA). K měření byly použity UV kyvety (Vrin, USA). Podmínky, při kterých byl bsorbnce nměřen, jsou uvedeny v tbulce I. Chemikálie jejich př íprv Souprv Rnsod (RANDOX Lbortories Ltd., Velká Británie), jejíž součástí byl substrát, pur, xnthinoxids stndrd. Všechny chemikálie kromě puru byly v souprvě Rnsod v sypké ormě. Složení jednotlivých složek souprvy je uvedeno v tbulce II. Princip metody je zložen n využití xnthinu xnthinoxidsy, které vytvářejí superoxidový rdikál, který Tbulk I Podmínky pro stnovení superoxiddismutsy Prmetr Hodnot Vlnová délk 505 nm Kolon 1 cm optická délk Teplot 37 C Měření proti vzduchu 504

Tbulk II Složení souprvy Rnsod Obsh Koncentrce roztoků Stbilit 1. Substrát 10 dní při teplotě 2 8 C. Xnthin 0,05 mmol l 1 I.N.T. 0,025 mmol l 1 2. Pur uvedeno n oblu puru CAPS 40 mmol l 1, ph 10,2 EDTA 0,94 mmol l 1 3. Xnthinoxids 80 U/l 10 dní při teplotě 2 8 C. 4. Stndrd uvedeno vždy v přiloženém letáku 14 dní při teplotě 2 8 C u souprvy reguje s tetrzoliovou solí n červeně zbrvený ormzán. Aktivit SOD je měřen stupněm inhibice této rekce, ke které dochází při teplotě 37 C bsorbnci 505 nm. Příprv souprvy Rnsod: substrát rozpuštěn ve 20 ml puru, pur neuprvuje se, xnthinoxids rozpuštěn v 10 ml deionizovné vody, stndrd rozpuštěn v 10 ml deionizovné vody. Souprv Rnsod je určen pro stnovení ktivity SOD ve vzorku krve. Fosátový pur (RANDOX, Lbortories Ltd., Velká Británie) 0,01 mol l 1, ph 7,0. Výbě r vzorků Pro nlýzy byly použity vzorky zrn sedmi odrůd sedmi linií jrního ječmene (tb. III), které byly vypěstovány n Školním zemědělském podniku MZLU v Žbčicích v roce 2005. Po sklizni byly odebrány vzorky zrn čtyř odrůd sldovnického typu (Amulet, Kompkt, Kron, Tolr), tří wxy (voskové zrno) odrůd (Wbet, Wnubet, Wshonubet) vyšlechtěných v Montně (USA), které mjí v endospermu změněný poměr mylos/ mylopektin ve prospěch mylopektinu. Dále bylo využito i zrno z vlstních linií, které vznikly křížením selekcí odrůd sldovnických s wxy odrůdmi. Soubor byl tedy sestven z geneticky odlišných genotypů, dl se tedy u nich předpokládt rozdílná ktivit sledovného enzymu. Prcovní postup Příprv vzorků zrn ječmene Všechny vzorky byly rozemlety homogenizovány. Do nádoby pro rmutování bylo nváženo 25 g vzorku zrn ječmene, které byly vystřeny 225 ml deionizovné vody o teplotě 45 C. Vzorky byly rmutovány 15 min při teplotě 45 C ve rmutovcím přístroji metodou HARTONG. Po uplynutí této doby se vzorky smovolně nechly chldit 30 min n teplotu 25 C minimálně jednu hodinu se iltrovly. Tkto uprvené vzorky byly skldovány podle Bmorth 11 18 h při teplotě 4 C zředěny 1:14 osátovým purem (0,01 mol l 1, ph 7,0) tk, by se procent inhibovné rekce pohybovl mezi 30 60 % inhibice n ose y klibrční křivky. Měření bsorbnce Dlší příprv byl shodná jk pro připrvené vzorky zrn, tk pro stndrdy S1 S6 (tb. IV). Do kyvety bylo npipetováno 0,05 ml vzorku 1,7 ml substrátu. Směs byl optrně promíchán, vložen do spektrootometru inkubován 2 min při 37 C, poté bylo přidáno 0,25 ml xnthinoxidsy, která odstrtovl rekci. První bsorbnce byl nměřen po 30 s (A 1 ) druhá po třetí minutě (A 2 ). Tbulk III Seznm použitých linií jejich zkrtek Wxy odrůdy Použité oznčení Pluchté linie Použité oznčení Wbet Wb Kompkt x Kron Ko x Kr Wnubet Wnb Kron x Kompkt Kr x Ko Wshonubet Wsnb Kompkt x Wbet Ko x Wb 505 Wbet x Kompkt Kron x Wnubet Wnubet x Kron Wbet x Wshonubet Wb x Wsnb

Tbulk IV Ředění stndrdu k sestrojení klibrční křivky Ozn. Objem stndrdu Objem osátového puru [ml] S6 neředěný stndrd S5 5 ml z S6 5 S4 5 ml z S5 5 S3 5 ml z S4 5 S2 3 ml z S3 6 S1 osátový pur Fosátový pur (S1) se rovná mír neinhibovné rekce 100 %. % inhibice 100 80 60 40 20 0-1 -0,5 0 0,5 1 log koncentrce Obr. 1. Klibrční křivk; y = 49,625x + 49,257, R 2 = 0,9945 Výpočet ktivity A2 - A 3 1 A 1 první bsorbnce nměřená po 30-ti sekundách, A 2 druhá bsorbnce nměřená po 3. minutě. Procent inhibice byly vyneseny do gru klibrční křivky, kde byl odečten odpovídjící logritmus koncentrce při zákldu deset. Po odlogritmování byl hodnot vynásoben ředícím koeicientem tento výsledek uváděn v jednotkách U/ml. Přepočet výsledku n U/g sušiny: objem vystřené vody 100 SOD U/ml SOD U/g sušiny nvážk vzorku zrn % sušiny = Vlidce metody = A/min. stndrdu nebo vzorku A /min 100 stndrdu nebo vzorku 100 = % inhibice As1/min Klibrční křivk Stndrd byl připrven podle uvedené tbulky IV. Absorbnce u připrvených stndrdů S1 S6 byl nměřen stejným postupem jko u vzorků zrn. Tento postup je popsán výše. Do gru byly vyneseny procent inhibice oproti log 10 koncentrce stndrdů S1 S6 (obr. 1). Linerit citlivost Klibrční gr byl lineární s průměrným koeicientem determince (R = r 2 ) 0,9906 ± 0,0018. Opkovtelnost Přesnost byl vypočítán z 50 nměřených hodnot pro vzorek zrn linie Kron x Kompkt. Kontrolní vzorek byl měřen při kždé nlýze vzorků v čsovém období čtyř měsíců. Průměrná ktivit enzymu SOD uvedeného vzorku byl (108,2±1,6) U/g sušiny. Sttistické zprcování výsledků Získné experimentální výsledky byly zprcovány pomocí progrmu UNISTAT 5.1. vícektorovou nlýzou vrince s následným testováním rozdílů průměrných hodnot LSD testem (P 0,05). Výsledky diskuse Sttisticky význmně vyšší ktivit enzymu SOD (obr. 2) byl zjištěn u linií Ko x Kr (110 U/g sušiny), Wnubet (107 U/g sušiny), (105 U/g sušiny), Kr x Ko (103 U/g sušiny) tké u sldovnické odrůdy Tolr (100 U/g sušiny) ve srovnání s dlšími devíti odrůdmi liniemi nlyzovného souboru. Odrůd Kompkt měl význmně nižší ktivitu než již jmenovné odrůdy, le nelišil se význmně od sldovnické odrůdy Amulet (79 U/g sušiny) odrůdy Wbet (84 U/g sušiny), které nebyly sttisticky význmně rozdílné v porovnání s liniemi (78 U/g sušiny), (77 U/g sušiny) odrůdou Wshonubet (75 U/g sušiny). Sldovnická odrůd Kron (56 U/g sušiny) měl nejnižší ktivitu SOD, le sttisticky význmně se nelišil od linie Ko x Wb (61 U/g sušiny). Pomocí setu Rnsod bylo možné stnovit ktivitu enzymu SOD ve vzorcích zrn ječmene po úprvě metodiky. Princip úprvy metodiky spočívl především v příprvě zrn ječmene, který byl nprosto odlišný od příprvy vzorků krve, pro který byl dignostická souprv původně výrobcem určen. V postupu příprvy vzorků musel být vyřešen i poměr ředění osátovým purem tk, by procent inhibiční rekce bylo možné odečíst z gru klibrční křivky. Vzhledem k tomu, že se v této práci jednlo o stnovení enzymu s ntioxidčním eektem, lze z uvedených výsledků předpokládt, že zrno odrůd s mximální ktivitou SOD bude vhodnou surovinou pro výrobu sldu, 506

U SOD /g sušiny 120 110 100 90 80 70 60 50 56,00 61,35 b Kron Ko x Wb 68,96 bc 75,36 cd Wb x W snb Wshonubet 77,09 cd 77,75 cde 78,84 cde 87,52 84,22 e de Amulet Wbet Kompkt Tolr Kr x Ko 110,00 106,67 105,24 102,98 100,43 odrůdy linie Wnubet Ko x Kr Obr. 2. Průměrná ktivit enzymu superoxiddismutsy v zrnu ječmene; odlišná písmen v gru oznčují sttisticky význmně odlišné průměrné hodnoty při P 0,05, Ko x Kr = Kompkt x Kron, Kr x Ko = Kron x Kompkt, Ko x Wb = Kompkt x Wbet, = Wbet x Kompkt, = Kron x Wnubet, = Wnubet x Kron, Wb x Wsnb = Wbet x Wshonubet protože přítomnost enzymu v zrnu sldu zbrňuje nejen žluknutí během skldování, le tké nežádoucím příchutím piv 12 16. SOD obecně, v surovinách používných jko potrviny krmiv, má důležitý význm jko enzymový scvenger při vychytávání škodlivých volných rdikálů v lidském i živočišném orgnismu 2. Ze sldovnických odrůd české provenience vykzovl vysokou ktivitu SOD odrůd Tolr vyšlechtěná ve irmě Plnt Select Hrubčice, dále tři linie vyšlechtěné n Ústvu pěstování, šlechtění rostlin rostlinolékřství Mendelovy zemědělské lesnické univerzity v Brně bezpluchá odrůd Wnubet merické provenience. Cílem této práce bylo přizpůsobení nlytického postupu příprvy zrn pro stnovení enzymu SOD v ječmeni jrním pomocí dignostického setu Rnsod irmy RANDOX. Opkovtelnost metody byl stnoven u linie Kron x Kompkt, jejíž průměrná ktivit SOD byl (108,2±1,6) U/g sušiny. Touto metodou jsme stnovili ktivitu SOD zrn sedmi odrůd sedmi linií jrního ječmene sldovnické i nesldovnické kvlity. Sledovné vzorky měly ktivitu SOD v rozmezí 56 110 U/g sušiny. Nejnižší ktivit byl zjištěn u sldovnické odrůdy Kron. Sttisticky význmně vyšší ktivit byl zjištěn u pěti odrůd linií, vesměs odlišného genetického původu, oproti dlším devíti genotypům v souboru. Pro použití n výrobu sldu se zvýšenou ntioxidční kpcitou se jeví nejvhodnější česká sldovnická odrůd Tolr s ktivitou SOD 100 U/g sušiny. Americká odrůd Wbet nově vyšlechtěné linie Kompkt x Kron, Wbet x Kompkt Kron x Kompkt s ktivitou SOD 103 110 U/g sušiny budou vhodnými surovinmi pro výrobu potrvin či krmiv. Dignostický set Rnsod, který byl popsán v této práci, lze spolehlivě použít pro stnovení ktivity SOD v zrnu ječmene i ve sldu. Je všk nutné přizpůsobit příprvu vzorků rostlinnému mteriálu způsobem popsným v této práci. Práce vznikl z podpory grntu FRVŠ 420/2005/G4, VC 1M0570 GA ČR 525/05/0781. Závěr Seznmy symbolů CAPS I.N.T. Ko x Kr Ko x Wb Kr x Ko SOD Wb Wnb Wb x Wsnb Wsnb 3-(cyklohexylmino)propn-1-sulonová kyselin 5-enyl-2-(4-jodenyl)-3-(4-nitroenyl)-2H- -tetrzolium-chlorid Kompkt x Kron Kompkt x Wbet Kron x Kompkt Kron x Wnubet superoxiddismuts Wbet Wbet x Kompkt Wnubet Wbet x Wshonubet Wnubet x Kron Wshonubet 507

LITERATURA 1. Škrh J.: Remedi 8, 362 (1998). 2. Fridovich I.: Adv. Enzymol. Relt. Ares Mol. Biol. 58, 61 (1986). 3. McCord J. M., Fridovich I.: J. Biol. Chem. 244, 6049 (1969). 4. Hsn H. M., Fridovich I.: Eur. J. Rheumtol. Inlmm. 4, 160 (1981). 5. Mlišková J.: Bklářská práce. Univerzit Plckého v Olomouci, Olomouc 2004. 6. McCord J. M., Keele B. B. Jr., Fridovich I.: Proc. Ntl. Acd. Sci. U.S.A. 68, 1024 (1971). 7. Tlly F. P., Goldin B. R., Jcobus N. V., Gorbch S. L.: Inect. Immun. 16, 20 (1977). 8. Hewitt J., Morris J. G.: FEBS Lett. 50, 315 (1975). 9. Rcek J., Holeček V.: Chem. Listy 93, 774 (1999). 10. Bowler C., Vn Cmp W., Vn Montgu M., Inze D.: Crit. Rev. Plnt Sci. 13, 199 (1994). 11. Bmorth C. W.: J. Inst. Brew. 89, 420 (1983). 12. Hvlová P.: Hydrolytické oxidoredukční enzymy ječného sldu. ÚZPI, Prh, (1999). 13. Belcrediová N., Ehrenbergerová J., Hvlová P.: MendelNet 05 Agro., Brno, 29. listopd 2005. Sborník bstrktů (Rynt P., Cerkl R., Střed T., Kpler P., Vejržk K., ed.), str. 19 (přednášk), (2005). 14. Boivin P., Allin D., Clmgirnt V., Millrd M. N., Cuvelier M. E., Berset C., Richrd H., Nicols J., Forget-Richrd F.: 24 th Congress EBC: Europen Brewery Convention, Oslo, 1993. Proceedings, str. 397, (1993). 15. Boivin P.: Cerevisi 26, 109 (2001). 16. Belcrediová N., Ehrenbergerová J., Hvlová P.: Act Univ. Agric et Silvic. Mendel. Brun. 2, 7 (2006). N. Belcrediová, J. Ehrenbergerová, J. Prým b, nd P. Hvlová b ( Deprtment o Crop Science, Breeding nd Plnt Medicine, Mendel University o Agriculture nd b Forestry, Brno, Reserch Institute o Brewing nd Mlting, Brno): Anlyticl Determintion o Superoxide Dismutse Enzyme in Plnt Mterils Using Rnsod Set The ctivity o superoxide dismutse (SOD; EC 1.15.1.1) in severl brley grin smples ws mesured using dignostic Rnsod set, which is utilized or determintion o SOD in blood. The determintion o SOD ctivity is bsed on inhibition o the rection o xnthine nd xnthine oxidse with tetrzolium slt nd mesurement o bsorbnce o the produced ormzne t 505 nm nd 37 C. The clibrtion curve ws liner. The SOD ctivity o Kron x Kompkt smple ws (108.2±1.6) U/g dry mtter. A signiicntly higher ntioxidnt ctivity ws ound in severl smples, which re recommended or production o mlt or ood nd odder. The determintion o SOD ctivity in brley nd mlt using the Rnson set is simple nd relible. 508