Využití molekulárních markerů v systematice a populační biologii rostlin. 8. Sekvenování DNA

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Využití molekulárních markerů v systematice a populační biologii rostlin. 8. Sekvenování DNA"

Marian Beneš
před 5 lety
Počet zobrazení:

1 Využití molekulárních mrkerů v systemtice populční biologii rostlin 8. Sekvenování DNA

2 Sekvenování DNA zjištění pořdí nukleotidů v řetězci DNA ATATATAGGCAAGGAATCTCTATTATTAAATCATT využití informce ke zjištění průběhu rychlosti evoluce zjištění podobnosti příbuznosti txonů

3 Princip sekvenování PCR s použitím dvojice primerů nmnožení studovného úseku cyklické sekvenování (dideoxy, Sngerovo) použití pouze jednoho primeru kromě dntp jsou ve směsi přítomny i ddntp produkce frgmentů lišících se přesně o 1 bázi elektroforetické oddělení frgmentů n gelu utomtický sekvenátor

4 2, 3 - dideoxy NTPs dttp ddttp 3 -CTGGACTGCA-5 5 -GACCT

5 Automtické sekvenování 3 -TACG-5 primer 5 -ATGCATGC-3 templát ddgtp ddctp ddatp ddttp GTACG ATGCATGC CGTACG ATGCATGC ACGTACG ATGCATGC TACGTACG ATGCATGC

6 Struktur genomu genetická informce pořdí nukleotidů (ACGT) exon 1 intron exon 2 intergenický spcer exon GEN 1 GEN 2 kodující úseky exony konzervtivnější nekodující úseky introny, spcery vribilnější jderný, chloroplstový mitochondriální genom

7 Rychlost evoluce sekvencí

8 Typy vribility v sekvenci DNA 5bp indel bodové mutce

9 Chloroplstový genom mnoho genů je single-copy (pouze 1 kopie v celém genomu) konzervtivní evoluce chloroplstového genomu nevýhod při studiu n intrspecifické populční úrovni mnoho konzervtivních míst využitelných jko priming sites pro PCR mplifikci úseků mezi nimi strukturní přestvby chloroplstového genomu inverse npř. 30kb inverse odlišuje mechorosty od cévntých rostlin rozsáhlé delece ztrát specifických genů intronů chloroplst cpture přenos chloroplstu z jednoho druhu do druhého introgresí může ovlivnit určení fylogeneze (pokud není rozpoznán)

10 Chloroplstový genom

11 Čsto sekvenovné cpdna oblsti + mnoho dlších

12 rbcl gen pro velkou podjednotku ribuloso-1,5- bisfosfát-krboxylsy/oxygensy (RUBISCO) délk cc 1428, 1431 nebo 1434 bp indely extrémně vzácné jeden z prvních sekvenovných genů velmi konzervtivní, systemtik n úrovni čeledí rodů, v některých skupinách i druhů

13 tpb gen kodující bet podjednotku ATP synthsy délk 1497 bp, indely nezjištěny využití podobně jko rbcl ndhf koduje podjednotku chloroplstové NADHdehydrogensy délk 2233 bp (tbák) cc 2x více substitucí než rbcl využití n rodové úrovni

14 mtk gen kodující mtursu (splicing plstidových genů) délk si 1550 bp mlý počet indelů systemtik n mezirodové mezidruhové úrovni

15 trnl intron spcer mezi trnl trnf trnl UAA 5 exon trnl UAA 3 exon trnf GAA intron spcer trna geny sekundární struktur kumulce insercí/delecí se stejnou rychlostí jko substituce nukleotidů problémy s lignmentem, zvláště u vzdálených orgnismů (už třeb n úrovni čeledi) vhodné pro systemtiku n úrovni blízce příbuzných druhů

16 tpb-rbcl spcer o délce bp systemtik n mezirodové mezidruhové úrovni

17 Vribilní nekodující oblsti cpdna Shw et l. (2005): The tortoise nd the hre II: reltive utility of 21 noncoding chloroplst DNA sequences for phylogenetic nlysis. Am. J. Bot. 92: psbm- trnd ycf6-psbm trnc-ycf6 trns-trnfm trnd-trnt trnl-trnf trnt-trnl rps4-trnt trns-rps4 rpob-trnc trng-trng trns-trng 5 rps12-rpl20 psbb-psbh rps16 rpl16 psba-trnk trnh-psba

18 Využití chloroplstových sekvencí fylogeneze krytosemenných rostlin mezidruhové vzthy v rámci rodu vnitrodruhová fylogeogrfie (definice hyplotypů) hybridizce zjištění mteřského txonu (jedince) (mternální přenos chloroplstu)

19 Fylogeneze krytosemenných Jnsen et l. (2007) 81 plstidových genů nukleotidů

20 Vzthy mezi druhy Cpsicum tpb-rbcl spcer Wlsh & Hoot (2001)

21 Fylogeogrfie Arbis lpin trnl-trnf Koch et l. 2006

22 Mezidruhová hybridizce rozpor mezi cpdna ndna Persicri mtk, psba-trnh, trnl-trnf vs. ITS Kim & Donoghue 2008

multiple lignment Anlýz dt S206 S207 S208 S209 S210 S0G3 TL ATATATATATAGGCAAGGAATCTCTATTATTAAATCATTTAGAATCCATA ATATATATA--GGCAAGGAATCTCTATTATTAAATCATTTAGAATCCATA

23 multiple lignment Anlýz dt S206 S207 S208 S209 S210 S0G3 TL ATATATATATAGGCAAGGAATCTCTATTATTAAATCATTTAGAATCCATA ATATATATA--GGCAAGGAATCTCTATTATTAAATCATTTAGAATCCATA ATATATATA--GGCAAGGAATCTCTATTATTAAATCATTTAGAATCCATA ATATATATA--GGCAAGGAATCTCTATTATTAAATCATTTAGAATCCATA ATATATATA--GGCAAGGAATCTCTATTATTAAATCATTTAGAATCCATA ATATATATA--GGCAAGGAATCTCTATTATTAAATCATTTAGAATCCATA ATATATATATAGGCAAGGAATCTCTATTATTAAATCATTCATAATTCATA konstrukce fylogenetického stromu distnční metody mximální prsimonie (MP) mximální věrohodnost (mximum likelihood ML) Byesovský přístup

24 Mximální prsimonie (MP) kldistická metod hledání nejjednoduššího stromu (most prsimonious tree) tj. stromu, při kterém je evoluce vysvětlen co nejmenším počtem substitucí softwre PAUP * Phylogenetic Anlysis Using Prsimony (* nd other methods)

25 Mximum likelihood (ML) njití stromu s nejvyšší prvděpodobností (L) prvděpodobnost, že se při dné topologii stromu (z dného evolučního modelu) vyvinou pozorovné sekvence softwre PAUP, GARLI, PAML, PhyML, RAxML

26 Modely evoluce sekvence DNA modely změn v sekvenci trnsverze A T trnszice G prmetry frekvence bzí typy substitucí (trnszice, trnsverze) heterogenit rychlosti substitucí zstoupení invrintních míst C puriny pyrimidiny

27 Substituční modely Zvyšující se počet prmetrů modelu A T G F81 (Felsenstein 1981) stejné rychlosti substituce nestejné frekvence bzí C A T A T A e T b b c d f G C G C G C b A T JC (Jukes-Cntor 1969) stejné rychlosti substituce stejné frekvence bzí b b G C K2P (Kimur 2 prmeter 1980) dvě různé rychlosti substituce stejné frekvence bzí HKY (Hsegw, Kishino & Yno 1985) dvě různé rychlosti substituce nestejné frekvence bzí GTR (Generl time-reversible model) (Tvré et l. 1986) 6 různých rychlostí substituce nestejné frekvence bzí

28 Jký model vybrt? MODELTEST: A tool to select the best-fit model of nucleotide substitution (Posd et l.) testování různých modelů výběr toho nejjednoduššího, který dosttečně vysvětluje dt pomocí hierrchicl likelihood rtio tests (hlrts) Akike informtion criterion (AIC) jmodeltest2 (

29 signál šum v dtech Sturce nekorigovná vs. korigovná vzdálenost skewness (g 1 -sttistics), I SS

Molekulární hodiny striktní (globální) clocklike evolution lokální relxed clocks utokorelovné (blízce příbuzné txony mjí podobnou mutční rychlost) nekorelovné (uncorrelted lognorml, exponentil)

30 Molekulární hodiny striktní (globální) clocklike evolution lokální relxed clocks utokorelovné (blízce příbuzné txony mjí podobnou mutční rychlost) nekorelovné (uncorrelted lognorml, exponentil) klibrce substituční rychlost z jiné studie nebo obecná rychlost (npř. pro cpdna) fosilie biogeogrfie softwre BEAST (Byesin), r8s (non-prmetric rte smoothing, penlized likelihood),

31 Odhd doby divergence (BEAST) Antonelli A. (2009): Hve gint lobelis evolved severl times independently? Life form shifts nd historicl biogeogrphy of the cosmopolitn nd highly diverse subfmily Lobelioidee (Cmpnulcee). BMC Biol. 7:82

32 Genové bnky dtbáze sekvencí GenBnk Ntionl Centre for Biotechnology Informtion (NCBI) EMBL Europen Bioinformtics Institute (EBI)

moss species Hylocomium splendens bsed on the nucleotide

33 Populční studie Ching T.Y. & Schl B.A. (1999): Phylogeogrphy of North Americn popultions of the moss species Hylocomium splendens bsed on the nucleotide sequence of internl trnscribed spcer 2 of nucler ribosoml DNA. Moleculr Ecology 8:

34 Systemtická studie Mrtins L., Oberprieler C. & Hellwig F.H. (2003): A phylogenetic nlysis of Primulcee s.l. bsed on internl trnscribed spcer (ITS) DNA sequence dt. Plnt Systemtics nd Evolution 237: 75-85

35 Litertur Soltis D.E. & l. [eds.] (1998): Moleculr systemtics of plnts.ii. DNA sequencing. Hollingsworth & l. [eds.] (1999): Moleculr systemtics nd plnt evolution. Hll B.G. (2001): Phylogenetic trees mde esy. Felsenstein J. (2004): Inferring phylogenies. Lemey P. & l. [eds.] (2009): The phylogenetic hndbook. 2nd ed. Wiley E.O. & Liebermn B.S. (2011): Phylogenetics. Theory nd Prctice of Phylogenetic Systemtics. 2nd ed. Wheeler W. C. (2012): Systemtics. A course of lectures. Drummond et l. (2009): Relxed phylogenetics nd dting with confidence. PLoS Biol 4(5): e88

Podobné dokumenty

Pokročilé metody hodnocení sekvencí DNA a multilokusových dat. 1. Analýza sekvenačních dat - I

Pokročilé metody hodnocení sekvencí DNA multilokusových dt 1. Anlýz sekvenčních dt - I úprv lignmentu [Mfft, BioEdit, MEGA,] detekce rekombinntů [Splitstree, GARD, RDP3] testování vhodných modelů evoluce