Základy biochemie KBC / BCH. Nukleové kyseliny. Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu CZ / /0407

Transkript

1 Základy biochemie KBC / BC ukleové kyseliny Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu CZ / /0407 Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

2 snova Úvod ke struktuře nukleových kyselin. Složení bází DA Dvojšroubovice DA Semikonzervativní replikace DA Metody sekvencování nukleových kyselin Technologie rekombinantní DA - klonovací techniky. olymerázová řetězová rekace CR Aplikace technologie rekombinantní DA. Typy ribonukleových kyselin.

3 Základní pojmy struktury nukleových kyselin ukleotidy mohou být spojovány do řetězců jako ribonuklové kyseliny (RA) nebo deoxyribonukleové kyseliny (DA). ukleové kyseliny jsou řetězce nukleotidů spojených fosfátovým můstkem mezi polohami a sousedních ribosových jednotek. Fosfáty polynukleotidů jsou kyselé při fyziologickém p a nukleové kyseliny jsou polyanionty. Spojení mezi jednotlivými nukleotidy se nazývá fosfodiesterová vazba. Koncový nukleotidový zbytek, jehož Cnení dále vázán se nazývá konec. Analogicky konec. Sekvence nukleotidů v nukleové kyselině se píše zleva doprava od konce ke konci.

4 Chemická struktura nukleové kyseliny konec C C 2 A C 3 U(T) 2 - C C C G konec

5 Zjednodušené schéma struktury nukleové kyseliny paucg. ísmeno p před názven tetranukleotidu reprezentuje fosfát na konci. Vertikální čáry reprezentují ribosy, připojené báze jsou označeny písmenem, diagonální čáry s písmenem p reprezentují fosfodiesterové vazby. Čteme zleva do prava. Deoxy ekvivalent se liší pouze absencí 2 - a záměnou U za T, např. dpatcg. A U C G

6 Řětezec DA a RA: Báze Báze Báze RA Báze Báze Báze DA

7 Skladba bází deoxyribonukleové kyseliny DA mají stejné počty adeninů a thyminů (A = T) a stejné počty guaninů a cytosinů (G = C). Tato shoda se nazývá Chargaffovo pravidlo. Experimentálně zjištěné poměry složení bází různých organismů. rganismus A : T G : C A : G Člověk 1, 00 1, 00 1, 56 šenice 1, 00 0, 97 1, 22 Kvasinka 1, 03 1, 02 1, 67 Escherichia coli 1, 09 0, 99 1, 05 Serratia marcescens* 0, 95 0, 86 0, 70 * Gram negativní baktérie, enterobaktérie, pathogen.

8 Základní charakteristika DA Charakteristickou vlastností přirozeně se vyskytující DA je její délka. Je poskládána z velkého množství nukleotidů nese genetickou informaci. Kvantifikace informací, které nese DA: Každá pozice jedné ze čtyř bází odpovídá dvěma bitům informace (2 2 = 4). otom řetězec nukleotidů nese 2 x = bitů nebo bytů (1 byte = 8 bitů). Genom E. coli je jedna DA složená ze dvou řetězců obsahujících 4, 6 milionů nukleotidů, odpovídající 9, 2 milionu bitů, nebo 1, 15 megabytů informace. DA vyšších organismů je mnohem delší. Lidský genom obsahuje přibližně 4, 6 milionu nukleotidů rozdělených do 24 různých DA molekul, 22 autosomních, x a y pohlavních chromosomů. Další podstatnou vlastností DA je replikace-tvorba dvou kopií nukleové kyseliny z jedné. To umožňuje párování bází.

9 Elektronová mikrofotografie části genomu E. coli.

10 Dvojitá šroubovice DA roblém specifického párováním bází byl vyřešen při studiu prostorové (třírozměrné) struktury DA. Maurice Wilkins a Rosalinda Franklin získali rentgenové difrakční snímky vláken DA. Z těchto snímků se vydedukovalo, že DA je dvojšroubovice. James Watson a Francis Crick z těchto a dalších dat sestavili model DA (1953, ature, London). A) Dva helikální polynukleotidové řetězce se otáčí kolem společné osy. Řetězce se vinou antiparalelně. B) Vazby sacharidu s fosfáty jsou na vnější straně šroubovice a purinové a pyrimidinové báze leží uvnitř šroubovice. C) Báze jsou kolmé na osu šroubovice. Sousední báze jsou od sebe vzdáleny 3, 4 Å. elikální struktura se opakuje každých 34 Å, což je 10 bází (= 34 Å na závit / 3, 4 Å na bázi). Rotace 36 o na bázi (360 o na celý závit). D) růměr helixu je 20 Å.

11 Watson-Crickům model dvojité helix DA

12 sový pohled na DA. áry bází leží jeden na druhém.

13 omocný diagram k určení pravotočivé a levotočivé DA Levotočivá ravotočivá

14 árování bází DA Watson a Crick objevili, že guanin může být párován s cytosinem a adenin s thyminem. ublikoval již v roce 1950 E. Chargaff, ale Watson s Crickem to nevěděli. Guanin Cytosin Stabilita dvojité helix DA je dána: C 3 A) Vodíkovými vazbami. B) Báze jsou udržovány mezi sebou Van der Walsovými silami a hydrofobními interakcemi. Adenin Thymin

15 Velký a malý žlábek na DA a povrchu dvojité šroubovice jsou dva žlábky: velký a malý. Důvodem je, že glykosidové vazby párů bází nejsou úplně stejné. Malý žlábek obsahuje pár bází pyrimidin -2 a purin -3 a velký žlábek je na opačné straně páru. Velký žlábek Malý žlábek

16 Strany malého a velkého žlábku: Strana velkého žlábku Strana velkého žlábku C 3 Glykosidová vazba A T Glykosidová vazba Glykosidová vazba G C Glykosidová vazba Strana malého žlábku Adenin-Thymin Strana malého žlábku Guanin-Cytosin

17 Různé strukturní formy DA. elix B Watson-Crickova. Typ helixu A B Z Tvar nejširší střední nejužší Stoupání na pár bazí 2.3 Å 3.4 Å 3.8 Å růměr helixu 25.5 Å 23.7 Å 18.4 Å Smysl otáčení pravotočivá pravotočivá levotočivá Glykosidová vazba anti anti střídavě anti a syn očet párů bází na jeden závit helixu Výška jednoho závitu helixu dklon páru bází od kolmice na osu helixu Å 35.4 Å 45.6 Å 19º 1º 9º Velký žlábek úzký a velmi hluboký široký a celkem hluboký plochý Malý žlábek velmi široký a mělký úzký a celkem hluboký velmi úzký a hluboký

18 Semikonzervativní replikace DA okus M. Meselsona a F. Stahla (1958): Baktérie s původní (rodičovskou) DA byly pěstovány na médiu obsahujícím těžký isotop dusíku 15 ( 15 4 Cl). o plné inkorporaci těžkého dusíku do DA, byly přeneseny do média s běžným isotopem dusíku 14. Zkoumalo se jaká bude distribuce obou dusíků po replikaci metodou rovnovážné sedimentace v hustotním gradientu. DA po extrakci byla rozpuštěna v koncentrovaném roztoku chloridu cesného o hustotě 1, 7 g.cm -3 (gradient zhruba stejný jako hustota DA). Molekuly DA putovaly při centrifugaci v hustotním gradientu na místa, kde byl gradient roven jejich hustotě. DA byla extrahována z baktérií v různých časech po transferu z 15 do 14.

19 Rozlišení 14 od 15 hustotním gradientem. A) UV absorpce. B) Densitogram.

20 Diagram semikonzervativní replikace ůvodní rodičovská molekula DA rvní generace dceřiných molekul DA Druhá generace dceřiných molekul DA

21 Mechanismus replikace DA V roce 1958 Arthur Kornberg a jeho kolegové izolovali první enzym replikce nazvaný DA plymerasa, který katalyzuje tvorbu fosfodiesterové vazby mezi deoxynukleotidy. Celý replikační proces využívá dvacet proteinů. utný je DA templát a primer s volnou skupinou. rimer je počáteční segment polymeru, který je prodlužován. Templát je sekvence DA nebo RA na které probíhá syntéza komplementární sekvence. ový řetězec DA se tvoří přímo na již existujícím DA templátě. dat t i dgt t i G C G C A a G C A a G C G T C A a C G T C A a C G T C A a

22 Tok informace z RA na DA u retrovirů (IV-1) Reverzní transkriptasa Reverzní transkriptasa Reverzní transkriptasa Virální RA ybridní RA-DA dvojšroubovice DA přepsaná z virální RA Dvojšroubovice virální DA

23 Strategie sekvencování: Metody sekvencování nukleových kyselin Štěpení polymerů na specifické fragmenty, které mohou být celé sekvencovány. Určení pořadí nukleotidů každého fragmentu. Sestavení překrývajících se fragmentů tak, aby došlo k rekonstrukci původního polymeru. Enzymy: Restrikční enzymy (endonukleasy a exonukleasy) Restrikční endonukleasy typu II rozpoznávají a štěpí palindromovou sekvenci DA. alindrom je slovo nebo fráze, které se čtou stejně zleva i zprava. apř. refer nebo Madam, I am Adam. V palindromovém DA segmentu je sekvence nukleotidů stejná v obou řetězcích a segment má tzv. dvoučetnou symetrii. Fragmenty, které takto vznikají mohou mít lepivé nebo nelepivé konce. Restrikční enzymy se označují podle baktérií původu. apř. EcoRI je produková E. coli kmen RI13.

24 Restrikční místa. a) Generuje fragmenty s lepivými konci. b) Generuje fragmenty s nelepivými konci. a) Eco RI b) Eco RV Místo štěpení Místo štěpení - G - A - A - T - T - C - - G - A - T - A - T - C - - C - T - T - A - A - G - - C - T - A - T - A - G - Místo štěpení Místo štěpení sa symetrie

25 Dělení fragmentů nukleových kyselin elektroforézou. Gélová elektroforéza na polyakrylamidovém gélu, AGE. Výsledkem je restrikční mapa. Jamky pro nanesení vzorku Vzorek ufr Gel - Katoda Stojan Směr elektroforézy ufr Anoda

26 Metoda sekvencování DA dle F. Sangera metoda ukončení řetězce nebo dideoxymetoda Enzym DA polymerasa I z E. coli (enzym podílející se na replikaci bakteriální DA). Jednovláknová DA jako templát a čtyři deoxynukleosidtrifosfáty (dt), dat, dct, dgt a dtt. Krátky polynukleotid primer, který je komplementární koncem templátu DA a stává se koncem nového řetězce. Syntéza DA je zakončována specifickými nukleotidy. Reakční směs také obsahuje označenou sloučeninu, buď jeden z dts nebo primer. značení může být radioaktivním isotopem (např. 32 ) nebo fluorescenčně. Klíčovou komponentou je malé množství 2, -dideoxynukleosidtrifosfátu (ddt), který nemá -. Když je tato komponenta vřazena do syntetizovaného polynukleotidu, řetězec je ukončen.

27 2, - Dideoxynukleosidtrifosfát BÁZE - C 2 2,-Dideoxynukleosidtrifosfát

28 Reakce katalyzovaná DA polymerasou I TEMLÁT TEMLÁT G A a G T G A a A a T DA polymerasa I G A a G T G A a A a T C T C A a C T C T C A a C T i RIMER dct dgt RIMER dgt

29 Metoda sekvencování DA - terminace řetězce TEMLÁT: RIMER: CCGGTAGCAACT GG dat ddat dct dgt dtt dat dct ddct dgt dtt dat dct dgt ddgt dtt dat dct dgt dtt ddtt GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC GGCCATCG GGCCATCGTTG GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT A C G T A G T T G C T A C C Sekvence komplementární k templátu DA

30 Automatické sekvencování DA. a primer v každé ze čtyř reakčních směsí jsou připojena fluorescenční barviva. Každá ze čtyř barevných křivek reprezentuje elektroforézou oddělený fragment s jedním dideoxynukleotidem. Barevné fragmenty: Zelená = ddat, červená = ddtt, černá = ddgt a modrá = ddct.

31 Technologie rekombinantní DA - klonovací techniky Klonování je produkce násobku identických organismů odvozených od jednoho předka. Klon je soubor buněk obsahujících vektor nesoucí žádanou DA. Metoda dovoluje připravit větší množství DA, které nelze získat např. izolací z bakteriální kultury. Genové inženýrství. Způsoby amplifikace segmentu DA: A) Specifický fragment DA vytvořený restrikčním enzymem, technikou CR (polymerázové řetězové reakce) nebo chemickou syntézou. B) Fragment je vnesen do jiné DA molekuly označené jako vektor, obsahující nezbytnou sekvenci k přímé replikaci DA. C) Vektor nesoucí vloženou DA je inkorporován do buněk, kde je replikován. D) Buňky obsahující požadovanou DA jsou odděleny. Klonovací vektory. ejčastěji plasmidy, kruhové DA molekuly od 1 po 200 kb z bakterií nebo kvasinek. (kb = párů bází dvojšroubovice nebo bází jednovláknové DA).

32 Technologie rekombinantní DA - klonovací techniky Laboratorní plasmidy jsou relativně malé kruhové DA, snadno se replikující, nesoucí geny specifické rezistence k jednomu nebo více antibiotikům a obsahující jedno nebo více míst pro restrikční endonukleasu, kam může být zavedena cizí DA. apř. E. coli plasmid označený puc18 (2, 69 kb) reprezentuje klonovací vektor (puc znamená plasmid Universal Cloning). oužívá se ke klonování DA do velikosti 10kb. bsahuje 13 restrikčních míst, tři geny rezistence k ampicilinu, lacz kódující enzym β-galaktosidasu. Bakteriofág λ je vektor klonující DA do 16 kb. Rekombinantní DA neboli chiméra ( podle řecké mytologie obluda se lví hlavou, kozím tělem a hadím ocasem) složená DA. Ligace (vazba). DA segment, který má být klonován má obvykle lepivé konce. DA ligasa je enzym katalyzující spojení segmentu DA s klonovacím vektorem. Transformace exprese chimerického plasmidu do hostitelské bakterie.

33 Konstrukce rekombinantní DA molekuly Klonovací vektor Cizí DA Restrikční endonukleasa Začlenění cízího fragmentu DA do klonovacího vektoru Chimerní DA

34 Transformace a selekce transformovaných buněk Selekce oddělení pouze těch hostitelských organismů, které byly transformovány a obsahují správně konstruovaný vektor. V případě plasmidového vektoru lze provést výběr za použití antibiotik a nebo chromogenních látek. apř. lacz gen v puc18 plasmidu kóduje enzym β-galaktosidasu, který štěpí bezbarvou látku X-gal na modrý produkt. E.coli transformované nemodifikovaným puc18 plasmidem tvoří modré kolonie. V případě, že plasmid obsahuje cizí DA inkorporovanou do jeho polylinker regionu, jsou kolonie bezbarvé, protože kódující sekvence lacz byla přerušena netvoří se funkční β-galaktosidasa. Bakterie do kterých nebyl vnesen plasmid jsou také bezbarvé. Tyto bakterie mohou být odděleny přidáním antibiotika ampicilinu do růstového média (plasmid obshuje gen rezistence k ampicilinu). Závěr: Úspěšně transformované buňky tvoří bezbarvé kolonie za přítomnosti ampicilinu. Geny jako amp R jsou nazývány selekční geny.

35 X-gal jako chromogen pro β-galaktosidasu C 2 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktosid (X-gal) (bezbarvý) Cl Br 2 β-galaktosidasa C 2 Cl Br β-d-galaktosa 5-Brom-4-chlor-3-hydroxyindol (modrý)

36 olymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction-cr) Amplifikace (znásobení) DA. Segmenty DA po 6 kb mohou být zmnoženy metodou vyvinutou v roce 1985 K. Mullisem. rincip: DA vzorek je rozdělen na jednotlivá vlákna a inkubován s DA polymerasou, v reakční směsi jsou všechny čtyři dt, dva oligonukleotidové primery jejichž sekvence je komplementární se segmentem DA, který chceme zmnožit. rimery směrují DA polymerasu syntetizovat komplementární vlákna k původní DA. oužívá se tepelně stabilní Tag polymerasa izolovaná z Thermus aquaticus, která je stabilní do 75 o C. roces probíhá cyklicky. o dvaceti cyklech se zvýší množství požadované sekvence DA asi milionkrát ( 2 20 ). Metoda umožňuje amplifikovat DA z 10 5 buněk a může být použita bez předchozí purifikace DA. oužívá se i klinicky k diagnostice onemocnění a k identifikaci lidí ze vzorků vlasů, spermií apod. (forensní chemie).

37 rvní cyklus CR: ůvodní dvojšroubovice DA ddělení vláken DA záhřátím a ochlazením a připojení primerů dat, dtt, dgt, dct rodlužování nového vlákna DA Různě dlouhá nová vlákna DA

38 Druhý cyklus CR (1.část): Různě dlouhá nová vlákna DA ddělení vláken DA záhřátím a ochlazením a připojení většího množství primerů

39 Druhý cyklus CR (2.část): dat, dtt, dgt, dct rodlužování nového vlákna DA Shodně dlouhá vlákna DA atd.

40 Druhý cyklus CR (kompletní) ddělení vláken DA záhřátím a ochlazením a připojení většího množství primerů dat, dtt, dgt, dct rodlužování nového vlákna DA Shodně dlouhá vlákna DA atd.

41 Aplikace technologie rekombinantní DA rodukce proteinů. Bakteriální proteiny se připravují poměrně snadno. rodukce proteinů může dosáhnout až 30% hostitelských proteinů. Takovéto geneticky upravené organismy nazýváme nadprodukční. Bakteriální produkce eukaryotních proteinů je možná jen tehdy, kdy když rekombinantní DA nesoucí sekvenci kódující požadovaný protein také obsahuje bakteriální transkripční a translační kontrolní sekvenci. Mnohé eukaryotní geny jsou velké a obsahují části zvané introny, které jsou obyvkle před translací odstřiženy. Baktérie takový systém nemají. Mnoho proteinů je také posttranslačně modifikováno, aby byly funkční. bchází se použitím eukaryotních hostitelů jako jsou kvasinky nebo živočišné buňky. Bodová mutageneze (site directed mutagenesis). Bodová mutageneze byla vyvinuta M. Smithem. o izolaci genu je možné modifikovat nukleotidovou sekvenci a změnit tak aminokyselinovou sekvenci v kódovaném proteinu.

42 Transgenní organismy Transgenní organismy. Multibuněčný organismus je exprimován genem z jiného organismu je transgenní. Transplantovaný cizí gen se nazývá transgen. ejúspěšnějším transgenním organismem je kukuřice, která byla geneticky modifikována pro produkci proteinu, který je toxický pro požerový hmyz. Toxin je syntetizován půdním mikrobem Bacillus thuringiensis. Gen toxinu byl klonován do kukuřice Bt kukuřice. Do rýže byly naklonovány geny pro syntézu β-karotenu a gen pro protein ukládající Fe, ferritin. Tzv. zlatá rýže. Genová terapie je transfer nového genetického materiálu do buněk jednotlivců za účelem terapie. Jediným dosud známým výsledkem genové terapie je posílení nebo prakticky dodání části nutné pro funkci dětského imunitního systému. Do buněk kostní dřeně nemocných se vnese gen pro normální γc cytokinový receptor. nemocnění zvané SCID-X1 (severe combined immunodeficiency disease). Cytokiny jsou malé peptidy produkované řadou různých buněk. Jsou to jakési signalizační molekuly působící hlavně v imunitním systému, kde ovlivňují růst, diferenciaci a chování buněk.

43 Ribonukleové kyseliny - RA Tři typy ribonukleových kyselin: Informační (mra), přenosová (tra) a ribosomální (rra). Informační mra je templát pro syntézu proteinů nebo translaci. Molekuly mra jsou produkovány z každého genu nebo skupiny genů. mra je heterogenní třída molekul. řenosová tra přenáší aktivované aminokyseliny na ribosomy k syntéze proteinů. Máme 20 proteinogenních aminokyselina tedy minimálně dvacet tra. tra sestává z asi 75 nukleotidů (hmotnost asi 25 kd) nejmenší RA. Ribosomální rra je hlavní součástí ribosomů, hraje obě role při syntéze proteinů, katalytickou a strukturální. apř. v E. coli jsou tři typy rra označené 23S, 16S a 5S podle sedimentačního koeficientu. V každém ribosomu jsou všechny tři rra.

44 Všechny buněčné RA jsou syntetizovány RA polymerasou Syntéza RA z DA templátu se nazývá transkripce a je katalyzována enzymem RA polymerasa. ro funkci RA polymerasy jsou nutné: Templát, preferuje dojšroubovici DA. Jednovláknová slouží také jako templát. Templátem není RA ani hybrid RA-DA. Aktivované prekurzory, všechny čtyři ribonukleotidtrifosfáty - AT, GT, UT a CT. Bivalentní kovové ionty Mg 2 nebo Mn 2. Směr syntézy je. Syntéza je poháněna hydrolýzou i. RA polymerasa nepotřebuje primer. RA polymerasa nemá nukleasovou aktivitu jakou má DA polymerasa a proto nemůže vyštípnout chybně vřazený nukleotid.

45 Transkripce, tvorba mra - RA polymerasová reakce 2- - RIMER - Báze Báze Báze Báze T E M L Á T V É V L Á K 2 i i 2 RIMER - Báze Báze Báze Báze T E M L Á T V É V L Á K D A D A