METODY STUDIA PROTEINŮ

Rozměr: px
Začít zobrazení ze stránky:

Download "METODY STUDIA PROTEINŮ"

Transkript

1 METODY

2 METODY STUDIA PROTEINŮ

3 Metody studia bílkovin Studium struktury molekulární vlastnosti funkce katalytické aj. vlastnosti Podle potřeby a účelu izolace do potřebné čistoty studium in situ Isolace metody více či méně komplikované podle účelu čisté nativní bílkoviny pro studium vlastností event. farmakologii, hrubé isolace pro průmysl apod Isolační postupy separační metody

4 Proč izolovat enzymy Pro detailní studium je zapotření enzym získat v čistém stavu Získáme preparát s definovanou specifickou aktivitou Odstranění nežádoucích doprovodných složek (např. proteasy degradace cílových enzymů; enzymové inhibitory snížení aktivity cílových enzymů) V řadě aplikací je nutno používat vysoce přečištěné enzymové preparáty (např. medicina urokinasa, streptokinasa...) Možné problémy Komplexnost biologické matrice (velké množství doprovodných bílkovin a jiných látek) Malá množství cílového enzymu Labilita enzymu

5 Metody studia bílkovin Izolace přehled metod desintegrace materiálu preparativní centrifugace srážecí metody, jsou založeny na změně rozpustnosti membránové separace chromatografie preparativní elektromigrační metody elektroforéza krystalisace Analytické postupy včetně metod separačních elektroforéza a chromatografie v analytickém měřítku, spektrální metody absorpční disperzní chiroptické metody NMR rentgenostrukturní analýza, MS moderní metoda umožňující i štěpení řetězce další speciální metody

6 Metody stanovení koncentrace proteinů Metoda Rozsah (ng) Biuretová Lowryho UV nm UV 205 nm Bradfordové

7 Desintegrace materiálu (homogenizace)

8 Izolace membránových proteinů Membránové bílkoviny interagující integrální elektrostaticky hydrofobně zanořené transmembránové

9 1. vodné roztoky 2-5 násobek objemu vzorku doba extrakce 1-2 h až 24h stálé míchání vliv teploty ph Extrakce koncentrace solí, chelatačních látek vliv substrátů a kofaktorů 2. detergenty u enzymů vázajících se na buněčné částice žlučové kyseliny, SDS, Triton 3. organická rozpouštědla - delipidizace aceton, n-butanol, etanol, pyridín 4. jiné enzymy - autolýza, lysozym - rozrušení b. stěny, lipasa, fosfolipasa, proteolytické enzymy

10 Extrakce 5. stabilizátory - látky chránící enzymy 2-merkaptoethanol, cystein, dithiotreitol - chrání SH- skupiny před oxidací fenylmehansulfonylfluorid - inhibitor proteinas chelatační činidlo EDTA - pokud enzym neobsahuje kov HO H 2 C HC CH C H 2 SH OH SH dithiothreitol H 2 C HC HC C H 2 SH OH OH C H2 SO 2 F SH dithioerythritol fenylmethansulfonylfluorid (benzylsuldonylfluorid)

11 Rozpustnost proteinů je daná ph: rozpustnost je minimální v izoelektrickém bodě molekula má nulový náboj Iontovou silou: při zvyšující se koncentraci vzrůstá rospustnost (vsolovací efekt), po dosažení maxima prudce klesá (vysolování) Relativní permitivita (dielektrická konstanta): fyzikální konstanta kapalin - velikost elektrostatických sil, kterými na sebe působí nabité částice. Rozpouštědla s nižší RP než voda zvyšují tendenci molekul se shlukovat (snižují stupeň hydratace) Přítomnost látek tvořících s proteiny sloučeniny typu solí nebo koordinačních látek (ionty těžkých kovů) Teplota: rozpustnost s teplotou vzrůstá

12 Podle frekvence otáček Centrifugace běžná centrifugace (frekvence min-1) ultracentrifugace ( min-1) Podle dělení diferenciální cent. - centrifugace suspenze víckrát při narůstající odstředivé síle cent. v gradientu hustoty - zónová centrifugace Podle účelu - izopyknická centrifugace cent. analytická (stanovení molekulové hmotnosti) cent. preparativní

13 Centrifugace Diferenční centrifugace po homogenizaci. Zvyšující se centrifugační síla (násobky g) umožňuje oddělení těžšího materiálu od lehčího, případně se oddělí pevné částice od rozpuštěných v roztoku.

14 Zónová ultracentrifugace Centrifugace Izopyknická ultracentrifugace

15 Srážecí metody/vysolování Vysolování: mnohé proteiny jsou méně rozpustné v roztocích s vyšší koncentraci solí vysolování lze provádět frakčně např. síranem amonným rozpustnost většiny bílkovin klesá s koncentrací roztoku (iontovou silou) lineární vztah mezi log rozpustnosti a iontovou silou log sol. = b - K sol. m b = rozpustnost bílkoviny při m = 0, K sol - směrnice přímky závislá na druhu soli, teplotě a ph

16 Srážecí metody/vysolování Globulíny v čisté vodě nerozpustné salting in efekt - vsolování - přídavkem soli se rozpouští salting out - vysolování - při určité koncentraci se opět vylučují

17 FRAKCIONACE ORGANICKÝMI ROZPOUŠTĚDLY Je založena na snižování dielektrické konstanty vodného prostředí odnímání hydratačního obalu není nutná dialýza nejvhodnější je aceton ph isoelektrického bodu nízká teplota frakcionace - změnou konc. rozpouštědla a ph

18 Dialýza Dialýza je proces při kterém se oddělují velké molekuly proteinů od malých molekul (např. solí) přes semipermeabilní membránu. Dializační sáček Koncentrovaný roztok Pufr (ústroj) Zahájení dialýzy V rovnováze

19 % Tepelná denaturace teplota Bílkovina 1 Bílkovina 2

20 Chromatografické metody ionexová CHROMATOGRAFICKÉ METODY hydrofóbní gelová molekulová síta afinitní

21 Chromatografické metody Gelová chromatografie. Metoda slouží k oddělování velkých molekul od malých. Používají se kolony obsahující nerozpustné, ale vysoce hydratované polysacharidy dextran, agarosa nebo polyakrylamid. Malé molekuly vnikají do hydratovaných gelů a tím se zpožďují, kdežto velké molekuly prochází rychleji (nezpožďují se). Pořadí eluce molekul z gelu je : první velké, poté střední a nakonec malé molekuly. Používá se také k odsolování.

22 Gelová chromatografie na Sephadexu Využívá rozdílné velikosti molekul nosiče - polymery s póry o kontrolované specifické velikosti - Sephadexy (do ), Sepharosa, Biogel (do 10 8 )

23 Gelová chromatografie na Sephadexu Využívá rozdílné velikosti molekul Oddělují se velké molekuly, které nepronikají dovnitř polymeru, od malých molekul, které pronikají dovnitř gelu a tím se zpožďují. Využití na odsolování (oddělení bílkoviny od solí) dělení bílkoviny podle velikosti molekuly stanovení molekulové hmotnosti

24 Chromatografické metody Chromatografie na iontoměničích. Proteiny se oddělují na základě náboje na jejich povrchu. Když má protein na povrchu kladný náboj při ph 7, váže se na kolonu polymeru obsahujícího karboxylátové skupiny, zatímco protein s negativním nábojem se neváže. Navázaný protein s kladným nábojem se uvolní přidáním chloridu sodného do ústoje, protože sodný iont kompetuje s kladným nábojem proteinu. Proteiny s kladným nábojem se váží na negativní náboj kolony (např. karboxymethylcelulosa). Naopak proteiny se záporným nábojem se váží na pozitivní náboj např. diethylaminoethylcelulosu DEAE.

25 - + Chromatografie na iontoměničích katex karboxymethylcelulosa Celulosa nebo agarosa H 2 C Karboxymethylová (CM) skupina (ionizovaná forma) Celulosa nebo agarosa H 2 C H 2 C C H 2 N C O CH 3 + H O C H 2 CH 3 Diethylaminoethylová (DEAE) skupina (protonovaná forma)

26 Afinitní chromatografie Afinitní chromatografie spočívá ve vazbě proteinů na specifické chemické skupiny (afinanty). Např. enzym se může vázat na afinitní kolonu s navázaným kompetitivním inhibitorem. nosič - raménko (1-1,6 mm) - afinant -enzym

27 Afinitní chromatografie

28 Afinitní chromatografie 1. Analog substrátu Afinitní ligand + Enzym Nosič Raménko Enzym vázaný v aktivním místě 2. Imunoafinitní chromatografie Protilátka Proteinový epitop + Nosič Raménko Enzym vázaný na protilátku

29 Kvantifikace purifikačního protokolu fiktivní protein Stupeň Celkové Celková Specifická Výtěžek Stupeň purifikace proteiny aktivita aktivita (mg) (jednotky) (jednotky/mg) (%) Homogenizace Vysolování Chromatografie na iontoměniči Gelová filtrace Afinitní chrom

30 Gelová elektroforéza Ověření úspěšnosti purifikace. Molekuly nesoucí náboj putují stejnosměrným elektrickým polem. Proces se nazývá elektroforéza. V biochemii můžeme takto dělit proteiny i nukleové kyseliny. Rychlost pohybu molekul v elektrickém poli závisí na síle el. pole (E), celkovém náboji molekuly (z) a frikčním koeficientu (f): v = E.z / f Proti elektrické síle E.z nesoucí molekulu s nábojem proti elektrodě s opačným nábojem působí viskozita jako projev interakce mezi putující molekulou a prostředím. Frikční koeficient f závisí na hmotnosti a tvaru molekuly a viskozitě prostředí (h ). Pro molekulu ve tvaru koule o poloměru r, platí: f = 6 p. h. r Elektroforéza se provádí na nosiči o konzistenci gelu nebo na papíře. Gel slouží současně jako molekulové síto.

31 Elektroforéza ELEKTROFORETICKÉ METODY elektrofokusace nativní elfo konvenční isotachoforéza dělení podle velikosti SDS - elfo elfo v gradientovém gelu

32 Uspořádání elektroforetické metody

33 Uspořádání elektroforetické metody typy analytická preparativní kontinuální diskontinuální nosiče agar škrob akrylamid

34 Uspořádání elektroforetické metody DISKONTINUÁLNÍ ELFO Zaostřující a dělící gel Gradientový gel Ve směru migrace se zvyšuje hustota gelu

35 Polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE). O Akrylamid NH 2 + O N H H 2 C N H O N,N -Methylenbisakrylamid S 2 O 8 2- Persíran 2 SO 4 - Síranový radikál (iniciátor polymerace) CONH 2 CONH 2 CONH 2 CONH 2 O NH H 2 C O NH CONH 2 CONH 2 CONH 2 CONH 2

36 Polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE). Provedení PAGE. Vertikální (shora dolů), molekuly se pohybují směrem k anodě (+). Velké molekuly se zpožďují, malé putují v čele. - Směs makromolekul (proteinů) Směr elektroforézy Elektroforeza + Porézní gel

37 SDS PAGE Modifikací je elektroforéza za podmínek denaturace SDS-PAGE. Denaturačním činidlem je dodecylsíran sodný (SDS) aniontový detergent. SDS štěpí téměř všechny nekovalentní vazby v proteinech. Aniont SDS se váže na hlavní řetězec polypeptidu (jedna molekula SDS na dvě aminokyseliny). Komplex denaturovaného proteinu s SDS získá záporný náboj, který je úměrný molekulové hmotnosti proteinu. O H 3 C O S O - Na + Dodecylsíran sodný O

38 Standardy Původní vzorek Nenavázané proteiny Eluované proteiny SDS PAGE Kromě SDS se přidává merkaptoethanol nebo dithiothreitol k redukci disulfidových vazeb. Po proběhnutí elektroforézy se proteinové pásy vizualizují. Nejčastěji se používá trifenylmethanové barvivo Coomasie blue nebo barvení stříbrem. Pohyblivost většiny polypeptidů je za těchto podmínek je přímo úměrná logaritmu jejich molekulové hmotnosti. Sledování čistoty proteinů

39 SDS PAGE Dělení podle velikosti molekul - uniformní náboj SDS se váže na peptidové vazby a zásadité skupiny proteinů 1.4 g SDS se váže na 1 g proteinů

40 Idealizovaná PAGE purifikace fiktivního proteinu Homogenát Frakční vysolování Iontoměničová chromatografie Molekulové síto (gelová filtrace) Afinitní chromatografie

41 Stanovení relativní molekulové hmotnosti proteinů 1. Pomocí SDS-PAGE elektroforézy 2. Ultracentrifugace 3. Gelové chromatografie 4. Hmotnostní spektrometrie

42 Ultracentrifugace Centrifugace se používá k oddělení hrubých směsí buněčných komponent. Při kvantifikaci rychlosti pohybu molekul v roztoku v centrifugačním poli používáme sedimentační koeficient (s) dle rovnice: s = m(1 nr)/f kde m je hmotnost částice, n je parciální specifický objem (reciproká hodnota hustoty částice), r je hustota média, f frikční koeficient (závisí na tvaru molekuly) (1 nr) vyjadřuje schopnost prostředí nadnášet částice Sedimentační koeficient se obvykle vyjadřuje v jednotkách: Svedberg (S); S = s. Čím je hodnota S nižší, tím pomaleji částice sedimentuje. Na tomto principu je založena gradientová nebo jinak zonální centrifugace vedoucí k oddělení částic na základě hodnoty jejich sedimentačních koeficientů.

43 Ultracentrifugace Relativní molekulová hmotnost proteinů může být stanovena přímo z tzv. sedimentační rovnováhy při které se částice centrifugují nízkou rychlostí, tak, že sedimentace je v rovnováze s difůzí. Metoda je poměrně přesná a na rozdíl od SDS-PAGE nedenaturační při zachování kvartérní struktury. Hodnoty S (Svedberg = s) a molekulové hmotnosti některých proteinů Protein Hodnota S Molekulová hmotnost Cytochrom c 1, Myoglobin 1, Trypsin 2, Malátdehydrogenasa 5, Laktátdehydrogenasa 7,

44 MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-of Flight-Mass Spectrometry) Princip metody: Proteinový vzorek je smíchán s matricí - tvorba krystalů Krystaly vystaveny laserovému paprsku vznik jednou nabitých iontů proteinu Ionty analyzovány v analyzátoru doby letu (t (m/z)1/2) MATRICE PRO MALDI organické látky zajišťující ionizaci látek O O HO CN OH HO OH OH a-kyano-4-hydroxyskoøicová kyselina 2,5-dihydroxybenzoová kyselina

45 MALDI-TOF MS Intens. [a.u.] 4000 Hovězí sérový albumin 3000 Mr= m/z

46 METODY STUDIA NUKLEOVÝCH KYSELIN

47

48 Určení sekvence DNA Sekvenování DNA (tsekvenace či sekvencování, mnohdy také čtení DNA) souhrnný termín pro biochemické metody, jimiž se zjišťuje pořadí nukleových bází (A, C, G, T) v sekvencích DNA Základní strategie určení sekvence DNA chemická (selektivní štěpení Maxam-Gilbert) biochemická (syntéza, dideoxy metoda - Sanger)

49 Metody sekvencování nukleových kyselin Strategie sekvencování: Štěpení polymerů na specifické fragmenty, které mohou být celé sekvencovány. Určení pořadí nukleotidů každého fragmentu. Sestavení překrývajících se fragmentů tak, aby došlo k rekonstrukci původního polymeru. Enzymy: restrikční enzymy - nukleasy (endonukleasy a exonukleasy). Restrikční endonukleasy typu II rozpoznávají a štěpí palindromovou sekvenci DNA.

50 Maxam Gilbertova metoda M&G nebo též chemické sekvenování Chemická metoda Specifické (téměř) štěpení řetězce činidly Pracná, málo efektivní, ale univerzální a nezávislá Modifikace bazí DMS puriny hydrazinolýza pyrimidinů krátká sekvence DNA 5' konci radioaktivně označena fosforem 32 P. vzorek - na pět částí a každá je vystavena chemikáliím, které specificky štípají sekvenci DNA v každé z pěti nádob docíleno různě dlouhých sekvencí DNA

51 Maxam Gilbertova metoda Štěpení řetězce v místě této báze G DMS, piperidin A+G kyselina mravenčí, piperidin T+C hydrazin, piperidin T hydrazin + NaCl, piperidin

52 Maxam Gilbertova metoda PAGE elektroforéza seřazení sekvence podle své délky: nejdále v gelu doputují ty nejkratší sekvence. Autoradiografie - sekvence z gelu s 5' koncem označeným radioaktivním fosforem patrné jako svítící proužky Vyhodnocení pozice proužků ve srovnání s ostatními proužky vyhodnocuje - původní řazení nukleových bází ve vzorku DNA.

53 Gelová elektroforéza na polyakrylamidovém gelu Dělení fragmentů nukleových kyselin elektroforézou Gelová elektroforéza na polyakrylamidovém gelu, PAGE. Výsledkem je restrikční mapa. Jamky pro nanesení vzorku Vzorek Pufr Gel - Katoda Stojan Směr elektroforézy Pufr + Anoda

54 Maxam Gilbertova metoda

55 Metoda sekvencování DNA dle F. Sangera Metoda ukončení řetězce neboli dideoxymetoda Enzym DNA polymerasa I z E. coli (enzym podílející se na replikaci bakteriální DNA). Jednovláknová DNA jako templát a čtyři deoxynukleosidtrifosfáty (dntp): datp, dctp, dgtp a dttp. Krátký polynukleotid primer, který je komplementární 3 koncem templátu DNA a stává se 5 koncem nového řetězce. Syntéza DNA je zakončována specifickými nukleotidy. Reakční směs také obsahuje označenou sloučeninu, buď jeden z dnts nebo primer. Označení může být radioaktivním isotopem (např. 32P) nebo fluorescenčně.

56 Metoda sekvencování DNA dle F. Sangera Metoda ukončení řetězce neboli dideoxymetoda Klíčovou komponentou je malé množství 2, 3 -dideoxynukleosidtrifosfátu (ddntp), který nemá 3 -OH. Když je tato komponenta vřazena do syntetizovaného polynukleotidu, řetězec je ukončen. O - O - O - BÁZE O - P O O P O O P O O CH 2 H H O H OH H H 2,3 -Dideoxynukleosidtrifosfát

57 Metoda sekvencování DNA dle F. Sangera Reakce katalyzovaná DNA polymerasou TEMPLÁT TEMPLÁT 5 5 P P P P P P P P P P P P P P 3 3 G A a G T G A a A a T DNA polymerasa I G A a G T G A a A a T C T C A a C T C T C A a C T PP i OH + + PPP OH PPP OH +... OH + PPP OH +... P P P P P P P 5 PRIMER dctp dgtp 5 PRIMER dgtp

58 Metoda sekvencování DNA dle F. Sangera TEMPLÁT: PRIMER: 3 CCGGTAGCAACT 5 5 GG 3 datp + ddatp dctp dgtp dttp datp dctp + ddctp dgtp dttp datp dctp dgtp + ddgtp dttp datp dctp dgtp dttp + ddttp GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC GGCCATCG GGCCATCGTTG GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT A C G T A G T T G C T A C C 3 5 Sekvence komplementární k templátu DNA

59 Metoda sekvencování DNA dle F. Sangera

60 Metoda sekvencování DNA dle F. Sangera

61 Metoda sekvencování DNA dle F. Sangera

62 Sangerova metoda Sangerova metoda má mnoho alternativ fluorescenční detekce čtyři terminační nukleotidy jsou značeny každý jiným fluorescenčním barvivem reakce může probíhat v jedné zkumavce, pruhy v gelu se po ozáření excitačním zářením zobrazují v různých barvách podle typu nukleotidu v místě terminace místo čtyř zkumavek lze použít jenom jedinou, tzv. kapilární elektroforéza může být do velké míry automatizována a tedy velice zrychlena

63 Sangerova metoda Sangerova metoda má mnoho alternativ fluorescenční detekce

64 Využití kapilární elektroforézy pro sekvenování excitace emise jedné ze 4 vlnových délek podle typu fluorescenčního barviva, kterým je označen právě procházející nukleotid kapilára naplněná polyakrylamidovým gelem zkumavka s fluorescenčně značenými produkty sekvenování

65 Automatické sekvencování DNA. Na primer v každé ze čtyř reakčních směsí jsou připojena fluorescenční barviva. Každá ze čtyř barevných křivek reprezentuje elektroforézou oddělený fragment s jedním dideoxynukleotidem. Barevné fragmenty: Zelená = ddatp, červená = ddttp, černá = ddgtp a modrá = ddctp.

66 Sekvenování genomu Frederick Sanger Dideoxy sekvenační metoda 1977 osekvenoval Φ-X174 (5,368 bp) 1980 dostal druhou Nobelovu cenu za chemii Později (polovina 80-tých let) osekvenoval bakteriofága λ pomocí shotgun metody (48,502 bp)

67 Sekvenování genomu 1986 Leroy Hood: první automatický sekvenátor 1990 započat projekt sekvenování lidského genomu (předpokládaná doba 15 let) 1995 John Craig Venter sekvenoval první bakteriální genom 1996 první eukaryotický genom (kvasinka) sekvenován Leroy Hood John Craig Venter

68 1997 sekvence E. coli Sekvenování genomu 1998 Caenorhabditis elegans genom (první multicelulární genom) 1999 lidský chromozom 22 sekvenován 2000 Drosophila melanogaster genom 2001 Human Genome Sequencing: předběžná sekvence lidského genomu duben 2003 Lidský genom. Sekvence myšího genomu. duben 2004 Sekvence krysího genomu

69 Sekvenování genomu genomy jsou rozsáhlé sekvenování lidského genomu (Human Genome Project) stálo téměř tři miliardy amerických dolarů nově patentované technologie snižují cenu stanovení sekvence genomu na dolarů, v některých případech dokonce na pouhých 1000 dolarů.

70 Syntéza oligonukleotidů Syntéza na pevné fázi Monomery s aktivovanými a chráněnými skupinami První zakotven na nosiči Deblokace reagujících skupin Vazba Promývání Cyklický proces - automatizace Příprava primerů Komerční záležitost Umělé geny

71 Syntéza oligonukleotidů Monomery s aktivovanými a chráněnými skupinami

72 Syntéza oligonukleotidů

73 Polymerase chain reaction - PCR technika umožňující v krátkém čase namnožit daný kus DNA bez pomoci buněk užívá se, pokud je DNA velmi malé množství nebo je DNA znečištěna za několik hodin je schopna metoda PCR vyprodukovat kolem miliardy kopií DNA vedle vysoké rychlosti je na metodě PCR impozantní její selektivita. známe-li příslušné sekvence, PCR je schopna vybrat z dlouhé molekuly DNA oblast, která má být namnožena, například konkrétní gen objevil Kally Muris 1983, o 10 let později obdržel Nobelovu cenu. Metoda se dnes běžně užívá v mnoha laboratořích

74 Význam analytický diagnostika, forenzní analýza, preparativní - pomnožení materiálu, cílené mutace, umělé geny atd. Polymerase chain reaction - PCR metoda PCR se sestává ze tří kroků, při kterých se množství DNA zvětšuje exponenciálně klíčovým enzymem je DNA-polymeráza z Thermus aquaticus, žijícím v horkých pramenech Yellowstonského národního parku tato polymeráza nese název Taq polymeráza, je odolná vůči vysokým teplotám a zůstává aktivní přes mnoho cyklů

75 Polymerase chain reaction - PCR Potřeby pro PCR DNA, která má být namnožena Taq polymeráza zásoba primerů, ohraničujících cílovou sekvenci. zásoba datp, dctp, dgtp, dttp MgCl 2

76 Polymerase chain reaction - PCR První krok krátké zahřátí celé směsi na 94 o C -96 o C teplem se poruší vodíkové vazby a oba řetězce DNA se oddělí

77 Polymerase chain reaction - PCR Druhý krok ochlazení směsi na 50 C 65 C. ochlazení umožní primerům se navázat na cílovou DNA vodíkovými můstky podle pravidel komplementarity primery jsou krátké, synteticky vyrobené molekuly jednořetězcové DNA (20-30 nukleotidů), které jsou komplementární ke koncům DNA, která má být amplifikována primery tak determinují místo na DNA, které má být zmnoženo

78 Polymerase chain reaction - PCR Třetí krok DNA-polymeráza může přidávat nukleotidy k 3 koncům primerů, jako při obvyklé replikaci směs je zahřáta na 72 C

79 Polymerase chain reaction - PCR směs je znovu ohřáta a začíná nové kolo cyklu každé kolo trvá pouze asi 5 minut výsledkem je dvojnásobné množství cílové DNA, dlouhé i stovky párů bází tento tříkrokový cyklus je následně opakován znovu a znovu. za třicet cyklů je možno teoreticky obdržet miliardu kopií

80 Polymerase chain reaction - PCR

81 Kvantitativní PCR Schéma RT PCR Sledování fluorescencí, kvantifikace Využití fluorescence, 3 -exonukleasové aktivity Taq polymerasy

82 Využití reverzní transkriptázy Syntéza cdna Modifikace PCR

83 Technologie rekombinantní DNA - klonovací techniky Klonování je produkce násobku identických organismů odvozených od jednoho předka. Klon je soubor buněk obsahujících vektor nesoucí žádanou DNA. Metoda dovoluje připravit větší množství DNA, které nelze získat např. izolací z bakteriální kultury. Genové inženýrství. naklonování ovce Dolly v roce jádra přenesená do oocytu pocházela z epitelu mléčné žlázy dospělé ovce

84 Technologie rekombinantní DNA - klonovací techniky Způsoby amplifikace segmentu DNA: Specifický fragment DNA vytvořený restrikčním enzymem, technikou PCR (polymerázová řetězové reakce) nebo chemickou syntézou. Fragment je vnesen do jiné DNA molekuly označené jako vektor, obsahující nezbytnou sekvenci k přímé replikaci DNA. Vektor nesoucí vloženou DNA je inkorporován do buněk, kde je replikován. Buňky obsahující požadovanou DNA jsou odděleny. Klonovací vektory. Nejčastěji plasmidy, kruhové DNA molekuly od 1 po 200 kb z bakterií nebo kvasinek. (kb = párů bází dvojšroubovice nebo bází jednovláknové DNA).

85 Součásti klonovacího vektoru Počátek replikace Dominantní selekční marker (obvykle gen, který uděluje hostitelské buňce rezistenci k léčivům) Nejméně jedno unikátní restrikční místo místo štěpení, které je přítomno pouze jednou a leží v oblasti vektoru, které nenaruší ani počátek replikace ani selekční marker. V současnosti používané klonovací vektory obsahují seskupení unikátních restrikčních míst nazývané polylinker nebo mnohočetné klonovací místo.

86 Restrikční enzymy

87 Tvorba rekombinantní DNA (rdna)

88 Technologie rekombinantní DNA - klonovací techniky Laboratorní plasmidy jsou relativně malé kruhové DNA, snadno se replikující, nesoucí geny specifické rezistence k jednomu nebo více antibiotikům a obsahující jedno nebo více míst pro restrikční endonukleasu, kam může být zavedena cizí DNA. Např. E. coli plasmid označený puc18 (2,69 kb) reprezentuje klonovací vektor (puc znamená plasmid Universal Cloning). Používá se ke klonování DNA do velikosti 10 kb. Obsahuje 13 restrikčních míst, tři geny rezistence k ampicilinu, lacz kódující enzym b-galaktosidasu. Bakteriofág l je vektor klonující DNA do 16 kb.

89 Technologie rekombinantní DNA - klonovací techniky Rekombinantní DNA neboli chiméra (podle řecké mytologie obluda se lví hlavou, kozím tělem a hadím ocasem) složená DNA. Ligace (vazba). DNA segment, který má být klonován má obvykle lepivé konce. DNA ligasa je enzym katalyzující spojení segmentu DNA s klonovacím vektorem. Transformace exprese chimerního plasmidu do hostitelské bakterie.

90 Konstrukce rekombinantní DNA molekuly

91 Inzerce DNA do plasmidu

92 Namnožení DNA Molekulární klonování in vivo - pomocí prokaryot (bakterie, např. E. coli), - pomocí eukaryot (kvasinky), - pomocí buněk savců rostoucích v tkáňových kulturách. Molekulární klonování in vitro - procesem polymerázové řetězové reakce (PCR)

93 TRANSFORMACE baktérii a kvasinek přímý přenos genetické informace z okolí do organismu buňka schopná přijmout DNA (plasmid) se nazývá KOMPETENTNÍ přirozeně kompetentní jsou některé kmeny Bacillus subtilis, Hemorheae influenze atd. všechny ostatní se mohou transformovat po uvedení do kompetentního stavu dvěma způsoby: A) ELEKTROPORACE B) CHEMICKÁ METODA buňky se pořádně promyjí dih 2 O smíchají s plasmidovou DNA rozpuštěnou také v dih 2 O a vloží do elektroporátoru buňky se ošetří roztokem rubidné a vápenaté soli, které způsobují větší permeabilitu membrány DNA se smísí s těmito buňkami a provede se tzv. HEAT SHOCK (45 sec. 42 C) EFEKTIVITA NÁROČNOST

94 Technologie rekombinantní DNA - klonovací techniky

95 Schéma bakteriální transformace

96 Transformace cizí DNA do bakterie Úspěšnost transformace cizí DNA je sledována na základě marker genů, které novou buněčnou kolonii odlišují na kultivačním mediu od kolonií bez přenesené DNA. Marker geny: pro rezistenci vůči antibiotiku; b-galaktosidasy (enzymy štěpící galaktosu na laktosu a glukosu) zajišťující barevnou odlišnost kolonií atd.

97 Transformace a selekce transformovaných buněk Selekce oddělení pouze těch hostitelských organismů, které byly transformovány a obsahují správně konstruovaný vektor. V případě plasmidového vektoru lze provést výběr za použití antibiotik a nebo chromogenních látek. Např. lacz gen v puc18 plasmidu kóduje enzym b-galaktosidasu, který štěpí bezbarvou látku X-gal na modrý produkt. E.coli transformované nemodifikovaným puc18 plasmidem tvoří modré kolonie. V případě, že plasmid obsahuje cizí DNA inkorporovanou do jeho polylinker regionu, jsou kolonie bezbarvé, protože kódující sekvence lacz byla přerušena netvoří se funkční b-galaktosidasa.

98 Transformace a selekce transformovaných buněk Bakterie, do kterých nebyl vnesen plasmid jsou také bezbarvé. Tyto bakterie mohou být odděleny přidáním antibiotika ampicilinu do růstového média (plasmid obsahuje gen rezistence k ampicilinu).

99 Příprava rekombinantního proteinu

100 Usnadnění izolace rekombinantního proteinu nejpoužívanější N a C-terminální značky (tagy): His-tag pro metal chelatační chromatografii (Ni) FLAG epitope - tag DYKDDDDK (Sigma; specifická protilátka) CBP - calmodulin binding peptide (26 AK) CBD - cellulose binding domain

101 Genová knihovna DNA knihovny - kolekce klonovaných DNA fragmentů genomu určitého organismu (cdna), které jsou skladovány uvnitř hostitelských organismů (zejména bakterií). cdna (copy DNA, complementary DNA) je získávána přepisem z mrna pomocí enzymu reverzní transkriptázy.

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY ELEKTROFORÉZA K čemu to je? kritérium čistoty preparátu stanovení molekulové hmotnosti makromolekul stanovení izoelektrického

Více

Klonování DNA a fyzikální mapování genomu

Klonování DNA a fyzikální mapování genomu Klonování DNA a fyzikální mapování genomu. Terminologie Klonování je proces tvorby klonů Klon je soubor identických buněk (příp. organismů) odvozených ze společného předka dělením (např. jedna bakteriální

Více

Izolace nukleových kyselin

Izolace nukleových kyselin Izolace nukleových kyselin Požadavky na izolaci nukleových kyselin V nativním stavu z přirozeného materiálu v dostatečném množství požadované čistotě. Nukleové kyseliny je třeba zbavit všech látek, které

Více

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin Metody používané v MB analýza proteinů, nukleových kyselin Nukleové kyseliny analýza a manipulace Elektroforéza (délka fragmentů, čistota, kvantifikace) Restrikční štěpení (manipulace s DNA, identifikace

Více

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin Metody používané v MB analýza proteinů, nukleových kyselin Nukleové kyseliny analýza a manipulace Elektroforéza (délka fragmentů, čistota, kvantifikace) Restrikční štěpení (manipulace s DNA, identifikace

Více

Elektromigrační metody

Elektromigrační metody Elektromigrační metody Princip: molekuly nesoucí náboj se pohybují ve stejnosměrném elektrickém Arne Tiselius rozdělil proteiny krevního séra na základě jejich rozdílných rychlostí pohybu v elektrickém

Více

Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ / /0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR

Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ / /0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ.04.3.07/4.2.01.1/0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR SEPARACE PROTEINŮ Preparativní x analytická /měřítko, účel/ Zvláštnosti dané povahou materiálu

Více

DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH. Michaela Nesvadbová

DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH. Michaela Nesvadbová DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH Michaela Nesvadbová Význam identifikace živočišných druhů v krmivu a potravinách povinností každého výrobce je řádně a pravdivě označit

Více

Seminář izolačních technologií

Seminář izolačních technologií Seminář izolačních technologií Zpracoval: Karel Bílek a Kateřina Svobodová Podpořeno FRVŠ 2385/2007 a 1305/2009 Úpravy a aktualizace: Pavla Chalupová ÚMFGZ MZLU v Brně 1 Lokalizace jaderné DNA 2 http://www.paternityexperts.com/basicgenetics.html

Více

Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ

Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Ivo Frébort 4. Metody molekulární biologie I Izolace DNA a RNA Specifické postupy pro baktérie, kvasinky, rostlinné a živočišné tkáně U RNA nutno zabránit kontaminaci

Více

Hybridizace nukleových kyselin

Hybridizace nukleových kyselin Hybridizace nukleových kyselin Tvorba dvouřetězcových hybridů za dvou jednořetězcových a komplementárních molekul Založena na schopnosti denaturace a renaturace DNA. Denaturace DNA oddělení komplementárních

Více

Metody práce s proteinovými komplexy

Metody práce s proteinovými komplexy Metody práce s proteinovými komplexy Zora Nováková, Zdeněk Hodný Proteinové komplexy tvořeny dvěma a více proteiny spojenými nekovalentními vazbami Van der Waalsovy síly vodíkové můstky hydrofobní interakce

Více

Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ

Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ 4. Metody molekulární biologie I Izolace DNA a RNA Specifické postupy pro baktérie, kvasinky, rostlinné a živočišné tkáně U RNA nutno zabránit kontaminaci RNasami

Více

Metody molekulární biologie

Metody molekulární biologie Metody molekulární biologie 1. Základní metody molekulární biologie A. Izolace nukleových kyselin Metody využívající různé rozpustnosti Metody adsorpční Izolace RNA B. Centrifugační techniky o Princip

Více

Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci. reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/

Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci. reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/ Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/28.0088 Hybridizační metody v diagnostice Mgr. Gabriela Kořínková, Ph.D. Laboratoř molekulární

Více

Stručný úvod ke cvičnému programu purifikace proteinů:

Stručný úvod ke cvičnému programu purifikace proteinů: Stručný úvod ke cvičnému programu purifikace proteinů: zopakovaní základních principů a postupů Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbe.cas.cz Na Sádkách 7, 1. patro, č. dveří 140 Acidobazické rovnováhy

Více

Zkušební okruhy k přijímací zkoušce do magisterského studijního oboru:

Zkušební okruhy k přijímací zkoušce do magisterského studijního oboru: Biotechnologie interakce, polarita molekul. Hydrofilní, hydrofobní a amfifilní molekuly. Stavba a struktura prokaryotní a eukaryotní buňky. Viry a reprodukce virů. Biologické membrány. Mikrobiologie -

Více

MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII. Martina Nováková, VŠCHT Praha

MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII. Martina Nováková, VŠCHT Praha MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII Martina Nováková, VŠCHT Praha MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE V BIOREMEDIACÍCH enumerace FISH průtoková cytometrie klonování produktů PCR sekvenování

Více

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti NUKLEOVÉ KYSELINY

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti NUKLEOVÉ KYSELINY Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti NUKLEOVÉ KYSELINY 3 složky Nukleotidy dusík obsahující báze (purin či pyrimidin) pentosa fosfát Fosfodiesterová vazba. Vyskytuje se mezi

Více

Příprava vektoru IZOLACE PLASMIDU ALKALICKÁ LYZE, KOLONKOVÁ IZOLACE DNA GELOVÁ ELEKTROFORÉZA RESTRIKČNÍ ŠTĚPENÍ. E. coli. lyze buňky.

Příprava vektoru IZOLACE PLASMIDU ALKALICKÁ LYZE, KOLONKOVÁ IZOLACE DNA GELOVÁ ELEKTROFORÉZA RESTRIKČNÍ ŠTĚPENÍ. E. coli. lyze buňky. Příprava vektoru IZOLCE PLSMIDU LKLICKÁ LYZE, KOLONKOVÁ IZOLCE DN E. coli plasmidová DN proteiny proteiny + + vysrážená plasmidová lyze buňky + snížení ph chromosomální DN centrifugace DN chromosomální

Více

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin Metody používané v MB analýza proteinů, nukleových kyselin Proteiny analýza a manipulace Izolace, purifikace (rozdělovací metody) Centrifugace Chromatografie Elektroforéza Blotting (identifikace, western

Více

Molekulární základy dědičnosti. Ústřední dogma molekulární biologie Struktura DNA a RNA

Molekulární základy dědičnosti. Ústřední dogma molekulární biologie Struktura DNA a RNA Molekulární základy dědičnosti Ústřední dogma molekulární biologie Struktura DNA a RNA Ústřední dogma molekulární genetiky - vztah mezi nukleovými kyselinami a proteiny proteosyntéza replikace DNA RNA

Více

Polymerázová řetězová reakce. Základní technika molekulární diagnostiky.

Polymerázová řetězová reakce. Základní technika molekulární diagnostiky. Polymerázová řetězová reakce Základní technika molekulární diagnostiky. Kdo za to může? Kary Mullis 1983 Nobelova cena 1993 Princip PCR Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction PCR) umožňuje

Více

IMUNOANALÝZA elektroforetické separační metody. 3. ročník Klinická biologie a chemie

IMUNOANALÝZA elektroforetické separační metody. 3. ročník Klinická biologie a chemie IMUNOANALÝZA elektroforetické separační metody 3. ročník Klinická biologie a chemie Princip elektroforézy I. Separační metoda využívající různé pohyblivosti různých iontů (složek směsi) ve stejnosměrném

Více

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální

Více

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti CHROMATOGRAFIE

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti CHROMATOGRAFIE Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti CHROMATOGRAFIE Chromatografie co je to? : široká škála fyzikálních metod pro analýzu nebo separaci komplexních směsí proč je to super?

Více

MIKROBIOLOGIE V BIOTECHNOLOGII

MIKROBIOLOGIE V BIOTECHNOLOGII Biotechnologie MIKROBIOLOGIE V BIOTECHNOLOGII Využití živých organismů pro uskutečňování definovaných chemických procesů pro průmyslové nebo komerční aplikace Organismus je geneticky upraven metodami genetického

Více

2. Z následujících tvrzení, týkajících se prokaryotické buňky, vyberte správné:

2. Z následujících tvrzení, týkajících se prokaryotické buňky, vyberte správné: Výběrové otázky: 1. Součástí všech prokaryotických buněk je: a) DNA, plazmidy b) plazmidy, mitochondrie c) plazmidy, ribozomy d) mitochondrie, endoplazmatické retikulum 2. Z následujících tvrzení, týkajících

Více

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti. Translace, techniky práce s DNA

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti. Translace, techniky práce s DNA Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti Translace, techniky práce s DNA Translace překlad z jazyka nukleotidů do jazyka aminokyselin dá se rozdělit na 5 kroků aktivace aminokyslin

Více

První testový úkol aminokyseliny a jejich vlastnosti

První testový úkol aminokyseliny a jejich vlastnosti První testový úkol aminokyseliny a jejich vlastnosti Vysvětlete co znamená pojem α-aminokyselina Jaký je rozdíl mezi D a L řadou aminokyselin Kolik je základních stavebních aminokyselin a z čeho jsou odvozeny

Více

ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN

ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN Fragmenty nukleových kyselin lze dle jejich velikosti rozdělit elektroforézou. Elektroforéza využívá rozdílné pohyblivosti jednotlivých fragmentů, danou právě

Více

Exprese rekombinantních proteinů

Exprese rekombinantních proteinů Exprese rekombinantních proteinů Exprese rekombinantních proteinů je proces, při kterém můžeme pomocí různých expresních systémů vytvořit protein odvozený od konkrétního genu, nebo části genu. Tento protein

Více

Typy molekul, látek a jejich vazeb v organismech

Typy molekul, látek a jejich vazeb v organismech Typy molekul, látek a jejich vazeb v organismech Typy molekul, látek a jejich vazeb v organismech Organismy se skládají z molekul rozličných látek Jednotlivé látky si organismus vytváří sám z jiných látek,

Více

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální

Více

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE. 2. Polymerázová řetězová reakce (PCR)

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE. 2. Polymerázová řetězová reakce (PCR) MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE 2. Polymerázová řetězová reakce (PCR) Náplň praktik 1. Izolace DNA z buněk bukální sliznice - izolační kit MACHEREY-NAGEL 2. PCR polymerázová řetězová reakce (templát gdna) 3. Restrikční

Více

IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I. Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek

IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I. Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek Studium aktinu, mikrofilamentární složky cytoskeletu pomocí dvou metod: detekce přímo v buňkách - fluorescenční barvení

Více

Rekombinantní protilátky, bakteriofágy, aptamery a peptidové scaffoldy pro analytické a terapeutické účely Luděk Eyer

Rekombinantní protilátky, bakteriofágy, aptamery a peptidové scaffoldy pro analytické a terapeutické účely Luděk Eyer Rekombinantní protilátky, bakteriofágy, aptamery a peptidové scaffoldy pro analytické a terapeutické účely Luděk Eyer Virologie a diagnostika Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i., Brno Alternativní

Více

Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk

Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk

Více

Izolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD..

Izolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD.. Izolace RNA doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD.. Metodiky izolace RNA celková buněčná RNA ( total RNA) zahrnuje řadu typů RNA, které se mohou lišit svými fyzikálněchemickými vlastnostmi a tedy i nároky na jejich

Více

Imunochemické metody. na principu vazby antigenu a protilátky

Imunochemické metody. na principu vazby antigenu a protilátky Imunochemické metody na principu vazby antigenu a protilátky ANTIGEN (Ag) specifická látka (struktura) vyvolávající imunitní reakci a schopná vazby na protilátku PROTILÁTKA (Ab antibody) molekula bílkoviny

Více

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Inovace studia molekulární a buněčné biologie Inovace studia molekulární a buněčné biologie Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. MBIO1/Molekulární biologie 1 Tento projekt je spolufinancován

Více

Replikace, transkripce a translace

Replikace, transkripce a translace Replikace, transkripce a translace Pravděpodobnost zařazení chybné báze cca 1:10 4, reálně 1:10 10 ; Proč? Výběr komplementární base je zásadní pro správnost mezigeneračního předávání genetické informace

Více

POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR)

POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR) POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR) Polymerázová řetězová reakce (PCR, z anglického Polymerase Chain Reaction) je metoda rychlého zmnožení (amplifikace) vybraného úseku DNA. Množený (amplifikovaný) úsek

Více

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální choroby

Více

Ivo Papoušek. Biologie 8, 2015/16

Ivo Papoušek. Biologie 8, 2015/16 Ivo Papoušek Biologie 8, 2015/16 Doporučená literatura: Metody molekulární biologie (2005) Autoři: Jan Šmarda, Jiří Doškař, Roman Pantůček, Vladislava Růžičková, Jana Koptíková Izolace nukleových kyselin

Více

urychlit sedimentaci pevných částic v hustota, viskozita

urychlit sedimentaci pevných částic v hustota, viskozita Centrifugace Literatura Centrifugace Důvodem použití centrifug je nutnost urychlit sedimentaci pevných částic v kapalném prostředí. Nasedimentacimávliv 1. vlastnost látky: velikost, tvar, hustota 2. vlastnost

Více

Bi5130 Základy práce s lidskou adna

Bi5130 Základy práce s lidskou adna Bi5130 Základy práce s lidskou adna Mgr. et Mgr. Kristýna Brzobohatá pizova@sci.muni.cz Laboratoř biologické a molekulární antropologie, ÚEB, PřF, Mu Bi5130 Základy práce s lidskou adna PCR polymerase

Více

MIKROBIOLOGIE V BIOTECHNOLOGII

MIKROBIOLOGIE V BIOTECHNOLOGII Biotechnologie MIKROBIOLOGIE V BIOTECHNOLOGII Termín biotechnologie byl poprvé použit v roce 1917 Procesy, při kterých se na tvorbě výsledného produktu podílejí živé organismy Širší definice: biotechnologie

Více

Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii

Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr 1/1 Proč biofyzikální metody? Biofyzikální metody využívají fyzikální principy ke studiu biologických systémů Poskytují kvantitativní

Více

Molekulární genetika

Molekulární genetika Molekulární genetika Genetické inženýrství Technologie rekombinantní DNA Vektor Genomová DNA Štěpení RE Rozštěpení stejnou RE, lepivé konce Ligace Transformace Bakteriální chromozóm Rekombinantní vektor

Více

USING OF AUTOMATED DNA SEQUENCING FOR PORCINE CANDIDATE GENES POLYMORFISMS DETECTION

USING OF AUTOMATED DNA SEQUENCING FOR PORCINE CANDIDATE GENES POLYMORFISMS DETECTION USING OF AUTOMATED DNA SEQUENCING FOR PORCINE CANDIDATE GENES POLYMORFISMS DETECTION VYUŽITÍ AUTOMATICKÉHO SEKVENOVÁNÍ DNA PRO DETEKCI POLYMORFISMŮ KANDIDÁTNÍCH GENŮ U PRASAT Vykoukalová Z., Knoll A.,

Více

Molekulárn. rní. biologie Struktura DNA a RNA

Molekulárn. rní. biologie Struktura DNA a RNA Molekulárn rní základy dědičnosti Ústřední dogma molekulárn rní biologie Struktura DNA a RNA Ústřední dogma molekulárn rní genetiky - vztah mezi nukleovými kyselinami a proteiny proteosyntéza replikace

Více

Izolace, klonování a analýza DNA

Izolace, klonování a analýza DNA Izolace, klonování a analýza DNA Ing. Pavel Kotrba, Ph.D., Ing. Zdeněk Knejzlík, Ph.D., Ing. Zdeněk Chodora Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha HTpavel.kotrba@vscht.czTH, HTzdenek.knejzlik@vscht.czTH,

Více

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Inovace laboratorních úloh genetických předmětů metodikami pracujícími s ribonukleovými kyselinami pšenice Metodické návody pro laboratorní

Více

laktoferin BSA α S2 -CN α S1 -CN Popis: BSA bovinní sérový albumin, CN kasein, LG- laktoglobulin, LA- laktalbumin

laktoferin BSA α S2 -CN α S1 -CN Popis: BSA bovinní sérový albumin, CN kasein, LG- laktoglobulin, LA- laktalbumin Aktivita KA 2340/4-8up Stanovení bílkovin v mléce pomocí SDS PAGE (elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s přídavkem dodecyl sulfátu sodného) vypracovala: MVDr. Michaela Králová, Ph.D. Princip: Metoda

Více

urychlit sedimentaci pevných částic v hustota, viskozita

urychlit sedimentaci pevných částic v hustota, viskozita Centrifugace Literatura Centrifugace Důvodem použití centrifug je nutnost urychlit sedimentaci pevných částic v kapalném prostředí. Nasedimentacimávliv 1. vlastnost látky: velikost, tvar, hustota 2. vlastnost

Více

Zdrojem je mrna. mrna. zpětná transkriptáza. jednořetězcová DNA. DNA polymeráza. cdna

Zdrojem je mrna. mrna. zpětná transkriptáza. jednořetězcová DNA. DNA polymeráza. cdna Obsah přednášky 1) Klonování složených eukaryotických genů 2) Úprava rekombinantních genů 3) Produkce rekombinantních proteinů v expresních systémech 4) Promotory 5) Vektory 6) Reportérové geny Zdrojem

Více

Základy biochemie KBC / BCH. Nukleové kyseliny. Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu CZ / /0407

Základy biochemie KBC / BCH. Nukleové kyseliny. Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu CZ / /0407 Základy biochemie KBC / BC ukleové kyseliny Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu CZ.04.1.03/3.2.15.3/0407 Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem

Více

Genové knihovny a analýza genomu

Genové knihovny a analýza genomu Genové knihovny a analýza genomu Klonování genů Problém: genom organismů je komplexní a je proto obtížné v něm najít a klonovat specifický gen Klonování genů Po restrikčním štěpení genomové DNA pocházející

Více

Molekulární biotechnologie č.9. Cílená mutageneze a proteinové inženýrství

Molekulární biotechnologie č.9. Cílená mutageneze a proteinové inženýrství Molekulární biotechnologie č.9 Cílená mutageneze a proteinové inženýrství Gen kódující jakýkoliv protein lze izolovat z přírody, klonovat, exprimovat v hostitelském organismu. rekombinantní protein purifikovat

Více

1. Metodika. Protokol č. F1-4 Metodika: Srovnávací analýza efektivity přípravy rekombinantního proteinu ve fermentoru

1. Metodika. Protokol č. F1-4 Metodika: Srovnávací analýza efektivity přípravy rekombinantního proteinu ve fermentoru Protokol č.: F1-4 Datum: 20.12.2010 Metodika: analýza efektivity přípravy výběr z výsledků ze zkušebních provozů výroby antigenů. Vypracoval: Ing. Václav Filištein, Mgr. Tereza Chrudimská, Spolupracující

Více

Základy biochemie KBC / BCH. Nukleové kyseliny. Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu CZ.04.1.03/3.2.15.3/0407

Základy biochemie KBC / BCH. Nukleové kyseliny. Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu CZ.04.1.03/3.2.15.3/0407 Základy biochemie KBC / BC ukleové kyseliny Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu CZ.04.1.03/3.2.15.3/0407 Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem

Více

SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE)

SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE) SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE) Princip SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza slouží k separaci proteinů na základě jejich velikosti (molekulové hmotnosti). Zahřátím vzorku za

Více

Nukleové kyseliny. DeoxyriboNucleic li Acid

Nukleové kyseliny. DeoxyriboNucleic li Acid Molekulární lární genetika Nukleové kyseliny DeoxyriboNucleic li Acid RiboNucleic N li Acid cukr (deoxyrobosa, ribosa) fosforečný zbytek dusíkatá báze Dusíkaté báze Dvouvláknová DNA Uchovává genetickou

Více

Separační metody používané v proteomice

Separační metody používané v proteomice Separační metody používané v proteomice Proteome = komplexní směsi proteinů Lidská buňka 10,000 typů proteinů Rozdíl v koncentraci 10 6,plasma10 9 Nutnost separace, frakcionace Na úrovni Proteinů Obtížně

Více

OBSAH. PP Master Mixy... 11 PPP Master Mix 12 Plain PP Master Mix 13 Combi PPP Master Mix 14

OBSAH. PP Master Mixy... 11 PPP Master Mix 12 Plain PP Master Mix 13 Combi PPP Master Mix 14 OBSAH DNA polymerázy pro PCR a pufry.................. 3 Taq DNA polymeráza 4 Taq DNA polymeráza Unis 5 TaqPurple DNA polymeráza 6 Taq DNA polymeráza 1.1 7 Combi Taq DNA polymeráza 8 LA DNA Polymerases

Více

Příprava vzorků pro proteomickou analýzu

Příprava vzorků pro proteomickou analýzu Příprava vzorků pro proteomickou analýzu 1) Úvod Proteomické analýzy mohou být naprosto odlišné cíle... Detekce změn v mozkové kůře při Alzheimerově chorobě Identifikace plazmatických markerů karcinomu

Více

Elektroforéza Sekvenování

Elektroforéza Sekvenování Elektroforéza Sekvenování Výsledek PCR Elektroforéza V molekulární biologii se používá k separaci nukleových kyselin a bílkovin Principem je pohyb nabitých molekul v elektrickém poli Gelová, polyakrylamidová

Více

Determinanty lokalizace nukleosomů

Determinanty lokalizace nukleosomů METODY STUDIA CHROMATINU Topologie DNA a nukleosomů Struktura nukleosomu 1.65-1.8 otáčky Struktura nukleosomu 10.5 nt 1.8 otáčky 10n, 10n + 5 146 nt Determinanty lokalizace nukleosomů mechanické vlastnosti

Více

Chromatografie. Petr Breinek

Chromatografie. Petr Breinek Chromatografie Petr Breinek Chromatografie-I 2012 Společným znakem všech chromatografických metod je kontinuální dělení složek analyzované směsi mezi dvěma fázemi. Pohyblivá fáze (mobilní), eluent Nepohyblivá

Více

Metody izolace a purifikace antigenů a protilátek IMUNOCHEMIE. Separační metody. Cíl izolace. Zuzana Bílková. Rozbíjení buněk, tkání, homogenizace

Metody izolace a purifikace antigenů a protilátek IMUNOCHEMIE. Separační metody. Cíl izolace. Zuzana Bílková. Rozbíjení buněk, tkání, homogenizace Cíl izolace Metody izolace a purifikace antigenů a protilátek Ověření účinnosti separace, čistoty a charakterizace produktů IMUNOCHEMIE Získání biopolymeru (proteiny, polysacharidy, glykoproteiny.) definované

Více

Tématické okruhy pro státní závěrečné zkoušky

Tématické okruhy pro státní závěrečné zkoušky Tématické okruhy pro státní závěrečné zkoušky Obor Povinný okruh Volitelný okruh (jeden ze dvou) Forenzní biologická Biochemie, pathobiochemie a Toxikologie a bioterorismus analýza genové inženýrství Kriminalistické

Více

Hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrometrie Princip: 1. Ze vzorku jsou tvořeny ionty na úrovni molekul, nebo jejich zlomků (fragmentů), nebo až volných atomů dodáváním energie, např. uvolnění atomů ze vzorku nebo přímo rozštěpení

Více

Chromatofokusace. separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení. není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost

Chromatofokusace. separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení. není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost Chromatofokusace separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost Polypufry - amfolyty Stacionární fáze Polybuffer 96 - ph 9-6

Více

Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie

Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie IZOLACE GENOMOVÉ DNA Deoxyribonukleová kyselina (DNA) představuje základní genetický materiál většiny

Více

NUKLEOVÉ KYSELINY. Základ života

NUKLEOVÉ KYSELINY. Základ života NUKLEOVÉ KYSELINY Základ života HISTORIE 1. H. Braconnot (30. léta 19. století) - Strassburg vinné kvasinky izolace matiére animale. 2. J.F. Meischer - experimenty z hnisem štěpení trypsinem odstředěním

Více

Klonování gen a genové inženýrství

Klonování gen a genové inženýrství Klonování gen a genové inženýrství Genové inženýrství užite né termíny Rekombinantní DNA = DNA, ve které se nachází geny nejmén ze dvou zdroj, asto ze dvou zných druh organism Biotechnologie = manipulace

Více

Ivo Papoušek. Biologie 6, 2017/18

Ivo Papoušek. Biologie 6, 2017/18 Ivo Papoušek Biologie 6, 2017/18 Doporučená literatura: Metody molekulární biologie (2005) Autoři: Jan Šmarda, Jiří Doškař, Roman Pantůček, Vladislava Růžičková, Jana Koptíková Izolace nukleových kyselin

Více

SYNTETICKÉ OLIGONUKLEOTIDY

SYNTETICKÉ OLIGONUKLEOTIDY Oddělení funkční genomiky a proteomiky Přírodovědecká fakulta Masarykovy university SYNTETICKÉ OLIGONUKLEOTIDY Hana Konečná CENTRÁLNÍ LABORATOŘ Masarykovy Univerzity v Brně ODDĚLENÍ FUNKČNÍ GENOMIKY A

Více

Příprava rekombinantních molekul pro diagnostické účely

Příprava rekombinantních molekul pro diagnostické účely 1 Příprava rekombinantních molekul pro diagnostické účely doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. bartosm@vfu.cz Přírodovědecká fakulta MU, 2014 2 Obsah přednášky 1) Pojem rekombinantní DNA 2) Historické milníky

Více

1. Definice a historie oboru molekulární medicína. 3. Základní laboratorní techniky v molekulární medicíně

1. Definice a historie oboru molekulární medicína. 3. Základní laboratorní techniky v molekulární medicíně Obsah Předmluvy 1. Definice a historie oboru molekulární medicína 1.1. Historie molekulární medicíny 2. Základní principy molekulární biologie 2.1. Historie molekulární biologie 2.2. DNA a chromozomy 2.3.

Více

ÚSTAV LÉKAŘSKÉ BIOCHEMIE 1.LF UK. Elektroforesa. v biochemii. Jan Pláteník. (grafická úprava obrázků Richard Buchal)

ÚSTAV LÉKAŘSKÉ BIOCHEMIE 1.LF UK. Elektroforesa. v biochemii. Jan Pláteník. (grafická úprava obrázků Richard Buchal) ÚSTAV LÉKAŘSKÉ BIOCHEMIE 1.LF UK Elektroforesa v biochemii Jan Pláteník (grafická úprava obrázků Richard Buchal) 2007/2008 Pojem elektroforesa znamená jakoukoliv experimentální techniku, založenou na pohybu

Více

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 16 Iontová chromatografie Iontová chromatografie je speciální technika vyvinutá pro separaci anorganických iontů a organických

Více

Separační metody Historie: Rozvoj separačních metod od minulého století Postavení separačních metod v rámci analytické chemie Význam chromatografie a

Separační metody Historie: Rozvoj separačních metod od minulého století Postavení separačních metod v rámci analytické chemie Význam chromatografie a Úvod do separačních metod pro analýzu léčiv Příprava předmětu byla podpořena projektem OPP č. CZ..7/3..00/3353 Separační metody Historie: Rozvoj separačních metod od minulého století Postavení separačních

Více

Identifikace mikroorganismů pomocí sekvence jejich genu pro 16S rrna

Identifikace mikroorganismů pomocí sekvence jejich genu pro 16S rrna Praktická úloha Identifikace mikroorganismů pomocí sekvence jejich genu pro 16S rrna Pro spolehlivou identifikaci mikroorganismů pomocí genetických metod se velmi často využívá stanovení nukleotidové sekvence

Více

Biologie buňky. systém schopný udržovat se a rozmnožovat

Biologie buňky. systém schopný udržovat se a rozmnožovat Biologie buňky 1665 - Robert Hook (korek, cellulae = buňka) Cytologie - věda zabývající se studiem buňek Buňka ozákladní funkční a stavební jednotka živých organismů onejmenší známý uspořádaný dynamický

Více

Název: Vypracovala: Datum: 7. 2. 2014. Zuzana Lacková

Název: Vypracovala: Datum: 7. 2. 2014. Zuzana Lacková Název: Vypracovala: Zuzana Lacková Datum: 7. 2. 2014 Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023 Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu MĚLI BYCHOM ZNÁT: informace,

Více

Název: Vypracovala: Datum: Zuzana Lacková. záleží na tom, co chceme dělat 1) METHALOTIONEIN 2) GFP

Název: Vypracovala: Datum: Zuzana Lacková. záleží na tom, co chceme dělat 1) METHALOTIONEIN 2) GFP Název: Vypracovala: Zuzana Lacková Datum: 7. 2. 2014 Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/323 Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu MĚLI BYCHOM ZNÁT: informace, které

Více

Molekulárně biologické metody v mikrobiologii. Mgr. Martina Sittová Jaro 2014

Molekulárně biologické metody v mikrobiologii. Mgr. Martina Sittová Jaro 2014 Molekulárně biologické metody v mikrobiologii Mgr. Martina Sittová Jaro 2014 Harmonogram 1. den Izolace DNA 2. den Měření koncentrace DNA spektrofotometricky, real-time PCR 3. den Elektroforéza Molekulární

Více

ÚPRAVA VODY V ENERGETICE. Ing. Jiří Tomčala

ÚPRAVA VODY V ENERGETICE. Ing. Jiří Tomčala ÚPRAVA VODY V ENERGETICE Ing. Jiří Tomčala Úvod Voda je v elektrárnách po palivu nejdůležitější surovinou Její množství v provozních systémech elektráren je mnohonásobně větší než množství spotřebovaného

Více

Analýza DNA. Co zjišťujeme u DNA DNA. PCR polymerase chain reaction. Princip PCR PRINCIP METODY PCR

Analýza DNA. Co zjišťujeme u DNA DNA. PCR polymerase chain reaction. Princip PCR PRINCIP METODY PCR o zjišťujeme u DN nalýza DN enetickou podstatu konkrétních proteinů Mutace bodové (sekvenční delece nebo inzerce nukleotidů), chromosomové aberace (numerické, strukturální) Polymorfismy konkrétní mutace,

Více

Column DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202)

Column DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202) Column DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202) Popis Column DNA Lego Kit je základ moderní stavebnicové (Lego) soupravy pro izolaci čisté DNA různého

Více

Vizualizace DNA ETHIDIUM BROMID. fluorescenční barva interkalační činidlo. do gelu do pufru barvení po elfu SYBR GREEN

Vizualizace DNA ETHIDIUM BROMID. fluorescenční barva interkalační činidlo. do gelu do pufru barvení po elfu SYBR GREEN ETHIDIUM BROMID fluorescenční barva interkalační činidlo do gelu do pufru barvení po elfu Vizualizace DNA SYBR GREEN Barvení proteinů Coommassie Brilliant Blue Coomassie Blue x barvení stříbrem Porovnání

Více

Analýza DNA. Co zjišťujeme u DNA

Analýza DNA. Co zjišťujeme u DNA Analýza DNA Co zjišťujeme u DNA Genetickou podstatu konkrétních proteinů Mutace bodové (sekvenční delece nebo inzerce nukleotidů, záměny), chromosomové aberace (numerické, strukturní) Polymorfismy konkrétní

Více

Typy nukleových kyselin. deoxyribonukleová (DNA); ribonukleová (RNA).

Typy nukleových kyselin. deoxyribonukleová (DNA); ribonukleová (RNA). Typy nukleových kyselin Existují dva typy nukleových kyselin (NA, z anglických slov nucleic acid): deoxyribonukleová (DNA); ribonukleová (RNA). DNA je lokalizována v buněčném jádře, RNA v cytoplasmě a

Více

Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ

Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Ivo Frébort 5. Metody molekulární biologie II DNA footprinting hledání interakcí DNA s proteiny Polymerázová řetězová reakce (Polymerase chain reaction PCR) Malé

Více

Terapeutické klonování, náhrada tkání a orgánů

Terapeutické klonování, náhrada tkání a orgánů Transfekce, elektroporace, retrovirová infekce Vnesení genů Vrstva fibroblastů, LIF Terapeutické klonování, náhrada tkání a orgánů Selekce ES buněk, v nichž došlo k začlenění vneseného genu homologní rekombinací

Více