2. Laboratorní vyšetření v imunologii

Transkript

1 / VZTAH VYDECHOVANÉHO OXIDU DUSNATÉHO, TES- TU KONTROLY ASTMATU A PLICNÍCH FUNKCÍ U PA- CIENTŮ S BRONCHIÁLNÍM ASTMATEM Vávrová H., Kučera P.,, Cvačková M.,, Heroldová M., Ort J. Oddělení alergologie a klinické imunologie FN Královské Vinohrady, Praha Ústav imunologie. LF UK, Praha Úvod: Informace o aktivitě onemocnění a stavu postiženého orgánu u pacientů s bronchiálním astmatem lze získat pomocí Testu kontroly astmatu, vyšetření plicních funkcí a neinvazivním monitorováním alergického zánětu stanovením koncentrace oxidu dusnatého (eno). Hodnota eno může pomoci při stanovení diagnózy, v predikci odpovědi na léčbu inhalačními ketosteroidy (IKS), při rozhodování o redukci dávky IKS, může být jedním z varovných signálů o ztrátě kontroly astmatu či upozornit na riziko relapsu po vysazení IKS. Metodika: Na souboru pacientů léčených pro asthma bronchiale (AB) jsme zjišťovali závislost naměřené hodnoty eno během výdechu konstantní rychlostí 50 ml/s ze střední frakce vydechovaného vzduchu (přístroj NIOX MINO) a kontroly astmatu hodnocené pomocí Testu kontroly astmatu (TKA) a vliv těchto ukazatelů na léčbu. Spirometrie křivka průtok/objem byla součástí každého vyšetření. Cílem bylo získání dat během návštěv. Statistická významnost byla posuzována pomocí Spearmanova korelačního koeficientu a sestavení regresního modelu. Výsledky: Při první návštěvě jsme získali klíčové údaje eno a TKA u 0 pacientů (58 mužů a 7 žen). Průměrná hodnota eno byla,4 ppb (5 78), průměrné skore TKA bodů (6,0 5). Při druhém vyšetření jsou data k dispozici u 85 osob, pouze 59 z nich však má současně TKO i eno, části pak chybí kompletní údaje z. kontroly. Kompletní údaje z obou návštěv jsme získali u 4 pacientů. Při. kontrole byla průměrná hodnota eno 5, ppb (7 0), průměrné skóre TKA, bodů (9 5), prům. hodnota FEV 99,8% (69,4,6) a prům. hodnota MEF 50 77,8% (0,6 55,6). V této skupině nedošlo mezi první a druhou kontrolou ke statisticky prokazatelné změně průměrné hodnoty eno (p = 0,0), TKA (0,087), FEV (p = 0,476) ani MEF50 (p = 0,56). Hledali jsme korelaci mezi hodnotami eno, TKA, FEV a MEF50 pomocí testování korelačního koeficientu. Nabýval hodnot kolem nuly, korelace nebyla nalezena. Avšak slabá korelace je patrna u osob s nízkou hodnotou TKA, která u vyšších vymizí. Veškeré vztahy nejsou však statististicky významné (p vyšší než 0,6). Závěr: Měření eno je přínosné neinvazivní vyšetření rozšiřující možnosti diagnostiky a monitorování léčby AB. I naše výsledky na malé skupině pacientů ukazují, že není významná asociace s ostatními parametry a že je obtížné na podkladě znalosti aktivity onemocnění nebo plicních funkcí predikovat intenzitu zánětu vyjádřenou pomocí eno. Nadále je proto vhodné individuálně vyšetření eno indikovat jako cenný další diagnostický parametr u jednotlivých pacientů. /4 OBJEKTIVIZACE PROTIZÁNĚTLIVÉHO EFEKTU SYS- TÉMOVÉ ENZYMOTERAPIE U PRŮDUŠKOVÉHO AST- MATU DALŠÍ ZKUŠENOSTI Vokálová I., Šimková P., Hantáková M. Kralupy n. Vltavou, ČR Handlová, SR Dubnica n. Váhom, SR První poznatky týkající se možnosti monitorovat pomocí sledování FENO protizánětlivý efekt systémové enzymoterapie použité v rámci komplexní léčby astmatu, byly prezentovány na kongresu ČSAKI 008 (Bergendiová). U 5 pacientek byl pozorován pokles hodnot FENO po přidání Wobenzymu k nezměněné dlouhodobé léčbě a jejich opětovný nárůst po vysazení enzymoterapie. Výsledky další skupiny ( pacientů) shrnovala přednáška na ČSAKI 009 (Vokálová). Obdobným způsobem pokles FENO v průběhu měsíců podávání enzymoterapie s následným vzestupem po jejím vysazení zareagovalo 9 (75 %) jedinců. V tomto sdělení autorky referují výsledky dalších pacientů, které jsou ve většině případů podobné jako v minulých letech. U malého procenta pacientů se však jednoznačné zlepšení klinického stavu, případně i laboratorních hodnot, ve změně FENO neodráží.. Laboratorní vyšetření v imunologii /5 PROTILÁTKY ANTI-RA A ALELY HLA-DRB*08, HLA- DQB*04 PRI JUVENILNEJ IDIOPATICKEJ ARTRITÍDE Bošák V.,, Kozáková D., Košková E. Národný ústav reumatických chorôb, Piešťany, SR Fakulta zdravotníctva a sociálnej práce, Trnavská univerzita, Trnava, SR Úvod: Juvenilná idiopatická artritída (JIA) je heterogénne ochorenie, ktoré zahŕňa viacero subtypov/foriem. Každú z nich charakterizujú rozdielne asociácie s antigénmi HLA systému. V slovenskej populácii sa zistil vzťah medzi antigénom HLA-B7 a JIA spojenou s entezitídou, antigénom HLA-DR a séropozitívnou (RF+) polyartikulárnou JIA, HLA-DR8,DQ4 a séronegatívnou (RF-) polyartikulárnou JIA a HLA-DR8, HLA-DR, HLA-DR a oligoartikulárnou JIA. V literatúre sa diskutuje o tom, že asociované HLA-DR,DQ antigény môžu súvisieť s produkciou niektorých autoprotilátok, najmä ANA a anti-ccp. V našej zostave chorých s JIA sme zistili možnú súvislosť medzi HLA-DR,DQ antigénmi a výskytom protilátok anti-ra (hnrnp-a/b). Pretože týmto protilátkam sa pri JIA doteraz nevenovala pozornosť a protilátky sú typické najmä pre reumatoidnú artritídu, prezentujeme výsledky našej štúdie. Súbor chorých a metódy: Súbor chorých tvorilo 8 pacientov s JIA (7 dievčat, 45 chlapcov vo veku 5 rokov, diagnostické kritériá ILAR). 57 pacientov malo oligoartikulárnu (48, %), 66 Alergie, Supplementum /00

2 polyartikulárnu séronegatívnu (8,6 %), 5 polyartikulárnu séropozitívnu (4, %), 8 systémovú JIA (5, %), pacientov JIA spojenú s entezitídou (,0 %), traja psoriatickú artritídu (,5 %). Kontrolná populácia 57 zdravých detí bez známok reumatického ochorenia vo veku 7 5 rokov. HLA antigény sa vyšetrovali mikrolymfocytotoxickým testom vo fluorescenčnej modifikácii (BAG GmbH). CD8+ a DR+ bunky krvi sa izolovali imunomagneticky (Dynabeads Invitrogen). Protilátky anti-ra sa určovali metódou ELISA (IMTEC). Pri štatistickej analýze sa použil chí test a Fisherov test. Miera pozorovaných vzťahov sa vyjadrila pomocou odds ratio (OR) s 95% konfidenčným intervalom (CI). Výsledky: Protilátky anti-ra sa zistili u % pacientov s JIA, najčastejšie pri polyartikulárnej séronegatívnej JIA (9 %). Výskyt protilátok pri ostatných formách JIA bol nasledovný systémová (6 %), entezitická (5 %), oligoartukulárna (5 %), polyartikulárna séropozitívna (0 %), psoriatická artritída (0 %). U chorých s pozitivitou anti-ra sa pozorovala významne vyššia frekvencia antigénov HLA-DR8 a HLA-DQ4 ako u chorých anti-ra negatívnych (DR8 5,7 % vs.,5 %, P < 0,0, OR = 4; DQ4 8,6 % vs. 8,7 %, P < 0,0, OR = 5). Tieto výsledky poukazujú na možnú súvislosť medzi anti-ra a antigénmi HLA-DR8 (alely DRB*08) a HLA-DQ4 (alely DQB*04) pri JIA. Tieto antigény sú vo výraznej väzbovej nerovnováhe a dedia sa ako haplotyp HLA-DR8, DQ4 [frekvencia haplotypu h = 0,066; miera väzbovej nerovnováhy D = 0,056 (85 %)]. U chorých s pozitivitou anti-ra sa zistil významne častejší výskyt (P < 0,05) polyartritídy (64 % vs. 4 % OR = 4), symetrickej artritídy (7 % vs. 9 % OR = 4), súčasného postihnutia malých a veľkých kĺbov (86 % vs. 4 % OR = 8) a koxitídy (6 % vs. 8 % OR = 7). Prítomnosť anti-ra pri JIA nekorelovala s uveitídou a súčasným postihnutím horných a dolných končatín. Závery: Protilátky anti-ra nepatria medzi často sa vyskytujúce protilátky pri JIA. Naše výsledky však naznačujú, že môžu nájsť uplatnenie pri posúdení priebehu a prognózy JIA (závažnejší kĺbový nález polyartritída, koxitída), pričom nemožno vylúčiť ich súvislosť s HLA haplotypom HLA-DR8,DQ4. Vzhľadom na to, že ide o prvé pozorovanie takýchto vzťahov, treba ich potvrdiť ďalšími štúdiami v iných populáciách. /6 PENTRAXIN V PLODOVÉ VODĚ JAKO POTENCIÁLNÍ MARKER INTRAAMNIÁLNÍHO ZÁNĚTU U TĚHOTEN- STVÍ KOMPLIKOVANÉHO PŘEDČASNÝM ODTOKEM PLODOVÉ VODY Flídrová E., Drahošová M., Kacerovský M., Tošner J., Hornychová H., Andrýs C. Ústav klinické imunologie a alergologie LF a FN Hradec Králové Porodnická a gynekologická klinika LF a FN Hradec Králové Fingerlandův ústav patologie LF a FN Hradec Králové Cíl: Pentraxin (PTX) je identifikovaný reaktant akutní fáze, který patří mezi solubilní receptory pro nebezpečné vzory přirozené imunity a účastní se tak zánětlivé odpovědi organismu. Cílem této studie bylo stanovit hladiny PTX v plodové vodě pacientek s předčasným odtokem plodové vody (PPROM) mezi 4. a 6. gestačním týdnem a určit, zda jeho koncentrace může sloužit jako ukazatel pro prenatální diagnostiku intraamniálního zánětu u pacientek s těhotenstvím komplikovaným PPROM. Metody: Do studie bylo zahrnuto 40 gravidních žen s PPROM mezi 4. a 6. týdnem těhotenství, které byly rozděleny na dvě skupiny podle přítomnosti/absence intraamniálního zánětu (IAI), který byl určen přítomností akutní histologické chorioamnionitidy:. s IAI (n = 9);. bez IAI (n = ). Jako kontrola sloužila skupina zdravých žen ve druhém trimestru těhotenství (n = 4), u nichž byla plodová voda odebrána v rámci screeningu vrozených vývojových vad. Koncentrace PTX v plodové vodě byla stanovena metodou ELISA (R&D Systems Inc., Minneapolis, USA). K vyhodnocení výsledků byl použit neparametrický test (Mann-Whitney test) vzhledem k nesplnění požadavku normality rozdělení dat (Shapiro-Wilk test). Výsledky: U pacientek s IAI byl signifikantně zvýšen medián koncentrace PTX v plodové vodě v porovnání se skupinou pacientek bez IAI (,69 ng/ml, 0,5 06,8 versus 0,8 ng/ml, 0,6,0; p = 0,05). Skupina s PPROM měla výrazně vyšší medián koncentrace PTX v plodové vodě ve srovnání se souborem zdravých žen ve druhém trimestru těhotenství (,0 ng/ml, 0,6,0 versus 0,67 ng/ml, 0,4,8; p = 0,007). Závěr: PTX je fyziologickou složkou plodové vody. Zvýšená koncentrace v plodové vodě byla nalezena u pacientek s PPROM a přítomností IAI. PTX se proto jeví jako potenciální marker IAI u pacientek s touto velmi závažnou porodnickou komplikací. Vznik práce byl podpořen grantem GAČR č /7 VYUŽITÍ SOUPRAV HEVYLITE TM PRO STANOVENÍ IgAκ A IgAλ V DIAGNOSTICE A HODNOCENÍ MONO- KLONÁLNÍCH GAMAPATIÍ Heřmanová Z., Pika T., Minařík J., Ščudla V., Novotný D., Lochman P. Ústav imunologie, LF UP a FN Olomouc III. interní klinika, LF UP a FN Olomouc Oddělení klinické biochemie a imunogenetiky FN Olomouc Úvod: Monoklonální gamapatie (MG) je charakterizována proliferací jednoho klonu B-lymfocytů, které produkují monoklonální homogenní imunoglobulin náležející vždy k jednomu izotypu imunoglobulinu s jedním typem lehkého řetězce (κ nebo λ). Diagnostika těchto stavů je v současné době doplňována o senzitivní, kvantitativní imunochemickou analýzu HevyliteTM, která je založena na principu nefelometrie. Výhodou této analytické metody je především přesné měření i v nízkých koncentracích. Test HevyliteTM IgAκ a IgAλ využívá polyklonální monospecifické ovčí protilátky, které jsou namířeny proti junkčním epitopům mezi doménami těžkého (α) a lehkého řetězce (κ nebo λ) v konstantní části IgA. Cíl: V pilotní studii zhodnotit přínos systému HevyliteTM při monitorování průběhu mnohočetného myelomu (MM) a monoklonální gamapatie nejistého významu (MGUS) izotypu IgA. Soubor pacientů a metody: Ve vyšetřovaném souboru pacientů (0 žen, mužů) bylo s MG typu IgAλ a 8 typu IgAκ. 9 pacientů bylo v aktivním stádiu onemocnění MM (odběry při stanovení dg., v průběhu nemoci, v relapsu a v progresi nemoci), 5 pacientů bylo v remisi a 7 jedinců mělo monoklonální gamapatii nejistého významu (MGUS). Pro stanovení sérových hladin IgAκ, IgAλ byla použita souprava HevyliteTM (The Binding Site, UK) a analyzátor BN II (Siemens Healthcare Diagnostics). Výpočtem byl určen poměr IgAκ/IgAλ, který vyjadřuje míru klonality plazmocelulární populace a zohledňuje míru suprese nenádorového imunoglobulinu. Alergie, Supplementum /00 67

3 Výsledky: Ve skupině nemocných s MM byla u většiny jedinců zjištěna dobrá korelace mezi poměrem IgAκ/IgAλ a typem paraproteinu při elektroforetickém vyšetření, navíc pak nemocní vyšetření v době diagnózy a v průběhu onemocnění vykazovali rovněž i výrazně nižší hladiny alternativní molekuly IgA v důsledku imunitní suprese. Referenční hodnoty u dospělých jedinců v séru se pohybují v následujících hodnotách: IgAκ 0,48,8 g/l, IgAλ 0,6,98 g/l, poměr IgAκ/IgAλ 0,8,04. Poměr IgAκ/ IgAλ u pacientů v remisi byl v rozsahu 0,86,5. U 7 pacientů s dg. MGUS byl poměr IgAκ/IgAλ mimo referenční oblast ( pod referenční mez a 5 nad). Ve skupině pacientů s aktivní formou nemoci mělo 7 pacientů nižší poměr IgAκ/IgAλ, pacientů vyšší poměr IgAκ/IgAλ a jeden pacient měl poměr IgAκ/IgAλ v referenčním intervalu. Spearmanova korelační analýza prokázala velmi silnou pozitivní korelaci mezi hodnotami parametru IgA kappa a hladinou M-proteinu (stanoveného membránovou elektroforézou) (r = 0,946, p < 0,000), silnou pozitivní korelaci mezi hodnotami parametru IgA lambda a hladinou M-proteinu (r = 0,87, p = 0,000) a dále prokázala velmi silnou pozitivní korelaci mezi součtem IgA kappa + IgA lambda a hodnotou celkového IgA (r = 0,994, p < 0,000). Závěr: První výsledky jsou příslibem, že systém HevyLiteTM IgAκ a IgAλ doplní škálu vyšetření, která jsou běžně používaná při sledování MG. HevyLiteTM IgAκ a IgAλ poskytne informace o monoklonálním proteinu IgA, který může být zakryt jinými proteiny při použití elektroforézy. V blízké době budou k dispozici nové soupravy HevyLiteTM IgGκ a IgGλ, a dále soupravy i pro třídu IgM i IgD, které umožní sledování i v těchto skupinách pacientů. Nejen větší soubor pacientů, ale i monitorování hladin MIg v průběhu nemoci přinese další potřebné poznatky a zhodnocení významu tohoto vyšetření. S podporou: Internal grant agency of Palacky University, grant No. LF 000. /8 STANOVENIE PROTILÁTOK PROTI DEAMIDOVANÉMU GLIADÍNU U PACIENTOV SO SÚČASNÝM VÝSKYTOM PROTILÁTOK PROTI GLIADÍNU A KRAVSKÉMU MLIEKU Hinďoš M., Malíčková K., Janatková I. Laboratoř klinické imunologie a alergologie, ÚKBLD VFN a. LFUK, Praha Celiakia je autoimunitná enteropatia spôsobená pretrvávajúcou citlivosťou vnímavých jedincov na lepok prijímaný z potravy. Častými prejavmi tohoto ochorenia bývajú chronické hnačky, únava, bolesti v oblasti brucha, úbytok váhy, neprospievanie, anémia, osteoporóza a ďalšie. Pri jej laboratórnej diagnostike sú využívané testy sérologické, histologické a genetické. Zo sérologických vyšetrení je to stanovenie protilátok proti tkanivovej transglutamináze v triedach IgA a IgG, endomýziu v IgA a IgG (EMA, EMG) a ev. gliadínu v IgA a IgG (aga, agg). Táto paleta vyšetrení bola naviac doplnená o stanovenie protilátok proti deamidovanému gliadínu v IgA a IgG (deamidovaným/modifikovaným gliadínovým peptidom; adga, adgg). V porovnaní so stanovením protilátok proti gliadínu sa vyznačuje vyššou citlivosťou i špecificitou, čo je výhodne aplikovateľné najmä v prípadoch, kedy je test prítomnosti aga či agg pozitívny z iného dôvodu, než je intolerancia k lepku. O niečo častejšie vyskytujúcim sa ochorením (u detí do 7 %), ktoré môže byť svojimi prejavmi podobné celiakii, je intolerancia kravského mlieka. U tohoto ochorenia sú u pacienta prítomné protilátky proti kravskému mlieku v triede IgG alebo IgA (akma, akmg), prípadne oboje. Súčasný výskyt aga a/alebo agg s akma a/alebo akmg nie je výnimočným javom a je pravdepodobne dôsledkom zvýšenej permeability črevnej sliznice v dôsledku zápalu s následnou produkciou príslušných protilátok. Z tohoto dôvodu môžeme u pacienta s celiakiou detekovať protilátky proti kravskému mlieku a naopak, u pacienta s intoleranciou voči kravskému mlieku protilátky proti gliadínu. Vhodným nástrojom k rozlíšeniu oboch horeuvedených stavov sa ukazuje byť práve stanovenie adga a adgg, ktoré pomerne spoľahlivo odhalí falošne pozitívne stanovenie aga či agg u pacientov bez celiake a s intoleranciou kravského mlieka. Týmto poskytne klinikovi cennú informáciu, či ďalej uvažovať o možnej celiakii. Naviac, v prípade použitia screeningového vyšetrenia adga/g, je náklad na otestovanie významne nižší než pri indikácii stanovenia protilátok proti endomýziu a tkanivovej transglutamináze súčasne. V tejto práci bola testovaná skupina pacientov s rôznymi poruchami imunity, inými než celiakia, u ktorých bol pozorovaný súčasný výskyt protilátok proti gliadínu a kravskému mlieku v triedach IgG a/alebo IgA. Následné screeningové stanovenie protilátok proti deamidovanému gliadínu bolo u viac než 80 % pacientov negatívne a mohlo by byť tým pádom i postačujúce, bez nutnosti stanovenia protilátok proti tkanivovej transglutamináze a endomyziu. Tento výsledok nám naznačuje prítomnosť enteropatie z iného dôvodu, než je celiakia. /9 TVORBA PROTILÁTEK PROTI OspC PO IMUNIZACI BO- RRELIA AFZELII S CPG JAKO ADJUVANS U MYŠÍ Hubinka V., Dušková M., Slámová I., Nepeřený J., Dendis M. 4, Jelínková P., Žákovská A. Ústav experimentální biologie, PřF MU, Brno Institut biostatistiky a analýz, MU, Brno Bioveta a.s., Ivanovice na Hané 4 GeneProof a.s., Brno Lymeská borelióza je vážné onemocnění, způsobené spirochetami, které jsou na hostitele přenášeny klíšťaty. Jedná se o nejčastější onemocnění přenášené členovci na člověka, avšak vakcína, která by pomohla zabránit šíření tohoto onemocnění u člověka, prozatím není dostupná. Dříve užívaný LymeRix, založený na OspA jako imunogenu, byl z trhu stažen kvůli nízkým tržbám a kvůli riziku vyvolání autoimunitních reakcí. OspC je dalším z hlavních povrchových antigenů Borrelia afzelii sp., který je exprimovaný během sání infikovaného klíštěte. Exprese tohoto antigenu pokračuje během migrace spirochet z trávicího traktu klíštěte do slinných žláz a pravděpodobně ovlivňuje obsazení finálního hostitele. OspC má tedy žádané vlastnosti, které by mohly být, při správné kombinaci s adjuvantní látkou, využity při konstrukci vakcíny proti borelióze. Z moderních adjuvantních látek pak můžeme jmenovat například CpG DNA. Na rozdíl od savčí DNA může totiž bakteriální DNA aktivovat různé buněčné typy, jako jsou B-lymfocyty, makrofágy, dendritické buňky nebo NK buňky, stimulací Th imunitní dráhy. Za tyto imunostimulační účinky bakteriální DNA jsou zodpovědné krátké (6 bp) nemethylované úseky, obsahující cytosin-guaninové dinukleotidové jádro. Tyto úseky se označují jako CpG motivy a DNA obsahující CpG motivy pak CpG DNA. Jako 68 Alergie, Supplementum /00

4 CpG oligodeoxynukleotidy (ODN) se pak označují syntetické oligodeoxynukleotidy, které kopírují imunostimulační vlastnosti CpG DNA, podle které byly syntetizovány. Cílem práce bylo popsat vliv CpG ODN podaného v kombinaci s boreliovým antigenem na tvorbu protilátek proti OspC. Myším byly podány různé kombinace antigenu a CpG ODN a sledovala se kinetika produkce anti-ospc protilátek v čase metodou ELISA. Simultánní podání CpG ODN jako adjuvans spolu s boreliovým antigenem vedlo takřka ke,5násobnému zvýšení anti-ospc protilátek. Vliv CpG ODN byl patrný více u nižších koncentrací imunogenu, kdy snížení koncentrace antigenu na / vyvolalo jen nepatrně sníženou hladinu anti-ospc protilátek. /0 SOUČASNÉ MOŽNOSTI A ÚSKALÍ DIAGNOSTIKY PER- TUSE Chrudimská R., Stiborová I., Richter J., Král V. Centrum mikrobiologie a imunologie, Zdravotní ústav, Ústí nad Labem V současné době dochází ke změnám průběhu a klinických projevů onemocnění pertusí. To vede ke značným potížím v diagnostice tohoto onemocnění. Mimo jiné i proto, že lékaři jsou přesvědčeni o úplném ochranném efektu vakcinace. Vzestup incidence černého kašle, ve světě pozorovaný téměř již 5 let, je znatelný i v naší republice. Z těchto důvodů nabývá účelné využití laboratorních metod v diagnostice onemocnění stále většího významu. Přitom všechny dostupné metody diagnostiky pertuse mají svá omezení (např. Environmental Protection Agency, USA dodnes žádnou z metod průkazu tohoto onemocnění nedoporučila). Mimo jiné i tato skutečnost nás vedla k provedení detailního rozboru literatury dostupné v internetových databázích s následnou analýzou možných aplikací, které by mohly zlepšit laboratorní diagnostiku pertuse. Literární údaje porovnáváme s výsledky testování pacientů naší ambulance. Věnujeme pozornost analýze laboratorních postupů s výběrem optimálních metod a jejich významu pro diagnostiku onemocnění. Rutinní aglutinační stanovení specifických protilátek doplňujeme sledováním hladin protilátek IgG, IgM a IgA proti toxinům B. pertussis metodou ELISA. Tato metoda přispívá k možnosti odlišení hladin protilátek po vakcinaci a po infekci. Vyšetření doplňujeme přímým průkazem agens B. pertussis a B. parapertussis metodou PCR. Kromě klasického výtěru nosohltanu úspěšně provádíme metodu výplachu nosohltanu a v souladu s literaturou dosahujeme vyšší úspěšnosti průkazu infekčního agens. Ve výše uvedených diagnostických postupech věnujeme pozornost neustálému hodnocení způsobu odběru materiálu a rizikům vedoucím k falešně negativním nebo pozitivním nálezům. Výsledkem studie je záchyt 4 pozitivních nálezů ve skupině 75 podezřelých jedinců ve věku 4 75 let (u vzorků byla prokázána reaktivita protilátek, v 9 případech byl pozitivní přímý průkaz metodou PCR). U všech sledovaných byla zjištěna vakcinace podle odpovídajícího schématu. Autoři předpokládají sledování vývoje možností diagnostiky této infekce, neboť neustálý nárůst incidence již není možné podceňovat. / ANALÝZA HLADINY PROZÁPALOVÉHO PROTEÍNU HMGB U DETÍ S INFEKCIOU MOČOVÝCH CIEST Kanáliková H., Ďurmanová V., Bucová M., Paulovičová E., Červeňová O., Liptáková A. Imunologický ústav, Lekárska fakulta UK, Bratislava, SR Chemický ústav, Centrum excelencie, SAV, Bratislava, SR I. Detská klinika, FNsP Bratislava, SR Úvod: HMGB (high mobility group box protein) je vnútrojadrový proteín s vysokou mobilitou. Pôvodne sa považoval len za proteín regulujúci transkripciu, avšak neskôr sa zistilo, že po uvoľnení z jadier nekrotických buniek a z aktivovaných monocytov a makrofágov stimuluje zápalový proces. Sekretovaná forma HMGB podnecuje monocyty a makrofágy k produkcii ďalších prozápalových cytokínov (TNF-alfa, IL- a IL-6), čo vedie k rozvoju zápalovej imunitnej odpovede. Zistilo sa, že hladina HMGB v plazme začína stúpať po 8 hod. od indukcie lipopolysacharidom a maximum dosahuje po 4 hod. Súbor a metodika: Hladiny HMGB sme vyšetrovali v plazme a v moči u detských pacientov s infekciou močových ciest. Celkovo sme vyšetrili pacientov (8 dievčat, 4 chlapcov) vo vekovom rozmedzí 5 rokov. Na vyšetrenie sme použili metódu ELISA (HMGB ELISA kit II, Shino-Test Corporation). Výsledky: V plazme pacientov s infekciou močových ciest sme zistili hladiny HMGB dvojnásobne zvýšené oproti hladinám v kontrolných vzorkách plazmy zdravých detí (40,5 ng/ ml vs. 75, ng/ml). V moči pacientov sme však zvýšené hladiny HMGB oproti kontrolným vzorkám moči nezistili (8,40 ng/ml vs. 7,75 ng/ml). Záver: Z predbežných výsledkov možno usudzovať, že hladina HMGB v plazme sa počas infekcie močových ciest zvyšuje, a preto možno HMGB považovať za ďalší potenciálny marker v diagnostike infekčného zápalu. V ďalšej časti práce plánujeme koreláciu hladín HMGB v moči s vyšetrovanými močovými parametrami a klinickými údajmi pacientov. / IDENTIFIKACE CYSTEIN DIOXYGENÁZY U TRICHO- PHYTON MENTAGROPHYTES Kašperová A., Kunert J., Šebela M., Raška M. Ústav imunologie a biologie Lékařská fakulta a Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci Cystein dioxigenáza (CDO, EC...0) katalyzuje oxygenaci cysteinu na cysteinsulfinovou kyselinu, což vede finálně k tvorbě siřičitanů uplatňujících se při sulfitolýze disulfidických vazeb keratinu a jeho následné vnímavosti k proteázám. CDO se tak významně uplatňuje při degradaci keratinu, což je jeden z klíčových mechanismů patogeneze dermatofytů. Pro identifikaci CDO cdna z významného dermatofyta Trichophyton mentagrophytes byly na základě vysoké homologie CDO genu navrženy primery. PCR produkt byl klonován do expresního vektoru, sekvenován a po přenesení cdna do expresního plazmidu byl připraven rekombinantní protein pomocí expresního systému E. coli. Protein byl následně purifikován pomocí Ni-NTA afinitní kolony za nativních i denaturačních podmínek. Jeho identita byla Alergie, Supplementum /00 69

5 ověřena jednak pomocí SDS-PAGE, western blotování a pomocí hmotnostní spektrometrie tryptických štěpů. U rekombinantní CDO izolované za nativních podmínek byla prokázána enzymatická aktivita spočívající v oxidaci L-cysteinu na cystein sulfinát. Jelikož CDO T. mentagrophytes přispívá k degradaci keratinu, byla v dalších experimentech měřena míra transkripce CDO mrna po stimulaci kultury T. mentagrophytes substrátem CDO (L-cystin) nebo po přidání sterilních vlasů (zdroje keratinu) do kultury. Po - a 7denní kultivaci T. mentagrophytes na živném médiu s L-cystinem, jakož i po denním růstu T. mentagrophytes na lidských vlasech byl pomocí real-time RT-PCR potvrzen významný nárůst množství CDO mrna. Toto množství bylo normalizováno pomocí kontrolního genu (housekeeping genu). Práce umožnila identifikovat CDO kožního patogena T. mentagrophytes a prokázala nárůst CDO po kontaktu houby se zdrojem keratinu, což svědčí pro její zapojení do degradace keratinu. Získání rekombinantní, enzymaticky aktivní formy CDO T. mentagrophytes je významný krok k dalšímu studiu patogeneze dermatofytóz a eventuálnímu návrhu nových terapeutických postupů. Práce vznikla za podpory grantu MSM a MSM / EXPRESE VYCHYTÁVACÍHO RECEPTORU PRO HE- MOGLOBIN CD6 NA MONOCYTECH PACIENTŮ S PSORIÁZOU A ZMĚNY PO GOECKERMANOVĚ TE- RAPII Kondělková K., Andrýs C., Hamáková K., Řeháček V., Borská L. 4 Ústav klinické imunologie a alergologie, Univerzita Karlova, Lékařská fakulta v Hradci Králové, Fakultní nemocnice, Hradec Králové Klinika nemocí kožních a pohlavních, Fakultní nemocnice, Hradec Králové Transfúzní oddělení, Fakultní nemocnice, Hradec Králové 4 Ústav patologické fyziologie, Univerzita Karlova, Lékařská fakulta v Hradci Králové Úvod: Psoriáza je definována jako T-lymfocyty zprostředkovaná imunitní systémová zánětlivá choroba s manifestací na pokožce. V léčbě psoriázy se uplatňuje kromě řady dalších postupů i Goeckermanova metoda terapie (GT), která je založená na denní aplikaci 5% farmaceutického uhelného dehtu na zasaženou pokožku s následnou expozicí těla kontrolovanému množství UV záření. CD6 je monocyto/makrofágový receptor. Velmi důležitou funkcí CD6 je vychytávání komplexů haptoglobinu s hemoglobinem. Cílem této práce bylo zjistit, zda existují významné rozdíly v sérových hladinách solubilní molekuly CD6 (scd6) a v expresi membránové molekuly CD6 na monocytech periferní krve mezi skupinou pacientů s psoriázou a kontrolní skupinou zdravých dobrovolníků. Dalším cílem bylo určit, zda dochází ke změnám těchto ukazatelů v průběhu GT terapie. Metody: Ve studii jsme sledovali povrchový znak CD6 na monocytech periferní krve u 7 pacientů ( mužů, 4 žen, průměrný věk 4,4 let v rozsahu 8 8) s psoriázou a 5 zdravých dobrovolníků (8 mužů, 7 žen, průměrný věk 9, let v rozsahu 6). scd6 jsme měřili u 48 pacientů ( žen, 7 mužů, průměrný věk 4, let v rozsahu 8 8) s psoriázou a zdravých dárců krve ( žen, 0 mužů, průměrný věk 6 let v rozsahu 4 59). Účinnost Goeckermanovy terapie byla sledována pomocí PASI skóre. Buňky periferní krve byly naznačeny standardním postupem 4barevným panelem, který obsahoval kombinaci protilátek CD6-FITC/TL- R-PE/CD4-PerCP/CD-APC. Vzorky jsme analyzovali pomocí průtokového cytometru FACSCalibur (Becton Dickinson). Míra exprese molekuly CD6 je vyjádřena pomocí průměrné intenzity fluorescence. Solubilní CD6 jsme detekovali použitím sendvičové ELISA techniky Macro6TM od firmy Trillium Diagnostics. Výsledky: Statistické rozdíly mezi skupinami byly stanoveny pomocí nepárového a párového t-testu a Wilcoxonova testu (MedCalc software) po zhodnocení normality dat. Výsledky jsou udány jako aritmetický průměr ± směrodatná odchylka. P hodnoty menší než 0,05 jsou považovány za statisticky významné. Hladina scd6 u pacientů s psoriázou před GT (584,9 ng/ml ± 47, ng/ml) byla významně (P = 0,07) vyšší než hladina tohoto znaku u zdravých kontrol (955,0 ng/ml ± 4, ng/ml). V porovnání s hladinami před Goeckermanovou terapií (584,9 ng/ml ± 47, ng/ml) byly hladiny scd6 u pacientů s psoriázou po terapii (05,4 ng/ml ± 75,9 ng/ml) významně nižší (P = 0,000). Exprese povrchového CD6 znaku na monocytech zdravých dobrovolníků (64,5 ± 8,6) byla statisticky signifikantně nižší než u pacientů s psoriázou před GT (84, ± 7,9, P = 0,07) i po GT (84,9 ± 7,, P = 0,0060). GT neměla významný vliv na expresi CD6. Závěr: Goeckermanova terapie je vysoce efektivní v léčbě psoriázy a dosahuje dobrých klinických výsledků s dlouhodobou remisí u většiny pacientů. Sérové hladiny scd6 u pacientů s psoriázou jsou před Goeckermanovou terapií významně vyšší v porovnání s hladinami zdravých dobrovolníků. Když jsme porovnali koncentrace scd6 u pacientů s psoriázou před a po Goeckermanově terapii, zjistili jsme výrazné snížení hladin scd6 po této terapii. Hladiny povrchového CD6 znaku se sice před a po terapii neliší, ale jsou signifikantně vyšší u pacientů s psoriázou než u zdravých kontrol. Tato studie byla podpořena Výzkumným záměrem Ministerstva zdravotnictví ČR, č , a vnitřním grantem Lékařské fakulty UK v Hradci Králové s podporou fi rmy Roche. /4 VÝZNAM VYŠETŘOVÁNÍ HLADIN A FUNKCE CINH U PACIENTŮ S ANGIOEDÉMY Kopelentová Š., Jůzová O., Jirsáková D. OAKI, FN Královské Vinohrady, Praha Klinický obraz různých forem angioedémů je obdobný, a proto k rozlišení hereditární formy angioedému a získaných forem angioedému přispívá také stanovení hladin C4 komplementu, CINH a funkce CINH, které je prováděno v naší laboratoři. Prezentace kazuistiky pacienta s pravděpodobnou diagnózou získaného angioedému. 70 Alergie, Supplementum /00

6 /5 ZMĚNY V EXPRESNÍM PROFILU CHEMOKINŮ CCL7, CCL8 A CCL U PACIENTŮ S RŮZNOU KLINICKOU MANIFESTACÍ PLICNÍ SARKOIDÓZY Kriegová E., Fillerová R., Tománková T., Mrázek F., Žurková M., Kolek V., Petřek M. Laboratoř imunogenomiky a proteomiky, Ústav imunologie, Lékařská fakulta Univerzity Palackého, Olomouc Klinika plicních nemocí a tuberkulózy, Lékařská fakulta Univerzity Palackého a Fakultní nemocnice Olomouc Sarkoidóza je Th zánětlivé onemocnění typické CD4+ lymfocytární alveolitidou, při níž hrají důležitou roli chemokiny. Současné studie naznačují, že některé CC chemokiny mohou být zapojeny také v protizánětlivé odpovědi díky jejich antagonistům, které vznikají štěpením metaloproteinázami (MMP). Cílem této práce bylo sledovat expresní profily CCL, CCL7, CCL8, CCL a MMP u pacientů se sarkoidózou a jejích klinických fenotypů. Pomocí kvantitativní RT-PCR jsme sledovali mrna expresi CCL, CCL7, CCL8, CCL a MMP v buňkách bronchoalveolární laváže (BAL) pacientů se sarkoidózou (n = 8) a kontrolních jedinců (n = 5). Byla použita kvantitativní RT-PCR s fluorescenčně značenými sondami, relativní genová exprese byla vyhodnocena pomocí metody druhé derivace, jako referenční gen byl použit PSMB. Subanalýza expresních profilů byla provedena u podskupin pacientů dle přítomnosti Löfgrenova syndromu a rentgenologického stádia. Zvýšená mrna exprese chemokinů CCL7 (p = 0,0), CCL8 (p = 0,000) a CCL (p = 0,00) byla zjištěna u pacientů se sarkoidózou ve srovnání s kontrolními jedinci. Zvýšené množství CCL7, CCL8 a CCL transkriptů bylo detekováno u pacientů s postižením plicního parenchymu (rtg stádia II-III) ve srovnání s pacienty s izolovanou hilovou lymfadenopatií (rtg stádium I) (p < 0,05). Ačkoliv se nelišily mrna expresní profily chemokinu CCL mezi skupinou pacientů se sarkoidózou a kontrolami (p > 0,05), byla detekována zvýšená exprese tohoto chemokinu u pacientů s postižením plicního parenchymu (rtg. stádium I vs. stádia II-III: p = 0,0). Také mrna exprese matrix metaloproteinázy MMP byla zvýšena u pacientů se sarkoidózou ve srovnání s kontrolami (p = 0,00000), přičemž expresní profily u jednotlivých klinických fenotypů se nelišily. Prokázali jsme zvýšenou expresi chemokinů CCL7 (MCP-), CCL8 (MCP-), CCL (MCP-4) a MMP v bronchoalveolárních buňkách pacientů se sarkoidózou, a to zejména u pacientů s parenchymálním postižením. V dalších studiích bude nutno ověřit, zda-li upregulovaný MMP štěpí CC chemokiny přítomné v plicích pacientů se sarkoidózou na menší molekuly s protizánětlivým účinkem. Grantová podpora: IGA MZ CR NT/7-6, IGA MZ CR NS/067-, PU LF_00_008. /6 NAŠE PRVNÍ ZKUŠENOSTI S IMUNOLOGICKÝM PRO- CESOREM IPRO SE ZPRACOVÁNÍM VZORKŮ PRO ME- TODY IFA Krpcová L., Kuhejdová J., Bystrianská J. Oddělení imunologie a alergologie, Zdravotní ústav Ostrava Stejně jako u celé řady laboratorních postupů i v případě metody nepřímé imunofluorescence (IFA) se objevila zařízení vedoucí k automatizaci a robotizaci této metody. Zařízení vyvinutá pro tyto metody zahrnují naředění vzorků, jejich aplikaci na příslušná substrátová skla, inkubaci, aplikaci příslušného konjugátu a promytí, takže v konečné fázi laboratorní personál provádí pouze konečnou fázi, tzn. aplikaci montovacího média a překrytí preparátu krycím sklíčkem. V naší laboratoři jsme měli možnost vyzkoušet zařízení ipro vyvinuté pro tuto činnost firmou Biosystem. Vzhledem k tomu, že se jednalo o jeho premiéru v České republice, bylo zařízení instalováno jako uzavřený systém, tzn. umožnilo zpracování pouze substrátových skel dodávaných firmou Biosystem. Naší laboratoři umožnilo testování protilátek ANA, EMA, dsdna, AMA, ASMA a LKM. Zařízení bylo v činnosti od ledna do března 00. Obsluha tohoto procesoru je jednoduchá, zařízení je vybaveno uživatelsky vstřícným programovým vybavení v češtině. V jedné sérii je možno zpracovat l6 substrátových skel, přičemž je možno kombinovat jednotlivé testy i provádět titraci jednotlivých sér. Vlastní proces aplikace naředěných sér a konjugátů i promývání je šetrný a nebylo pozorováno poškození jednotlivých substrátů. Minimální množství vzorku k analýze činí v tomto případě 00 ul. Zavedení takového systému šetří nejen lidskou práci ale rovněž množství promývacích roztoků. Z výše uvedeného hlediska je celý systém nastaven pro větší laboratorní provoz. /7 METALOCHELATAČNÍ VAZBA REKOMBINANTNÍHO PROTEINU OspC BORRELIA BURGDORFERI NA PO- VRCH NANOLIPOSOMŮ SE ZABUDOVANÝMI SYNTE- TICKÝMI ANALOGY NOR-MURAMYL DIPEPTIDU ZVY- ŠUJE IMUNOGENICITU A UMOŽŇUJE MODULOVAT SPECIFICKOU IMUNITNÍ ODPOVĚĎ K řupka M., Czerneková L., Mašek J., Bartheldyová E., Kulich P., Turánek J., Ledvina M. 4, Šebela M., Weigl E., Raška M. Ústav imunologie, Lékařská fakulta a Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta Univerzita Palackého v Olomouci, Výzkumný ústav veterinárního lékařství, Brno; 4 Ústav organické chemie a biochemie, AV ČR, Praha Spirochety Borrelia burgdorferi sensu lato jsou původci lymské boreliózy, nejrozšířenější antropozoonózy na území Evropy a USA. Choroba postihuje hlavně kožní, nervovou a pohybovou soustavu. I přes antibiotickou léčbu přechází onemocnění u určitého procenta pacientů do chronicity. Specifická prevence onemocnění zatím není dostupná. Protein OspC (Outer Surface Protein C) je jedním z kandidátních antigenů pro konstrukci preventivní vakcíny. Jeho schopnost vyvolat protektivní imunitní odpověď byla již prokázána na zvířecím modelu. Ve spirochetách je OspC posttranslačně upravován připojením triacyl glycerolu po odštěpení signalizační sekvence. Alergie, Supplementum /00 7

7 Vzniká tak molekula lipoproteinu. V expresní linii E. coli (BL) se exprese plné verze ukázala jako neefektivní a nepodařilo se získat nativní protein o vyšší čistotě. Vytvoření rekombinovaného expresního plazmidu kódujícího OspC bez signalizační sekvence s C terminálně připojenou histidinovou kotvou umožnilo zvýšit významně výtěžnost exprese OspC v E. coli (0 mg na litr bakteriální kultury). Stejně tak byla zvýšena čistota finálního proteinu na hodnotu přesahující 90 %. Na závěr byl pomocí fázové separace odstraněn endotoxin. Liposomy jsou vezikulární částice tvořené lipidickou membránou. Mohou být použity k zabudování lipofilních i hydrofilních molekul a sloužit tak jako nosiče účinných látek. Byl také prokázán jejich imunostimulační potenciál. V naší studii byly testovány nanoliposomy s navázanými molekulami niklu (EPC/ DOGS-NTA-Ni), které umožnily metaloafinitní vazbu rekombinantního OspC pomocí připojené histidinové kotvy. Jako adjuvans byly k proteoliposomům přidány syntetické deriváty nor-muramyl dipeptidů (norabumdp) označené MT05 a MT06. Oba preparáty byly použity k intradermální imunizaci Balb/C myší. (0 μg OspC na myš, ve dvou dávkách s odstupem 4 dnů). Jako kontroly byly použity samotné OspC, OspC + Freundovo adjuvans a OspC + muramyldipeptid. Analýza protilátkové odpovědi pomocí ELISA prokázala silnou specifickou odezvu na imunizaci oběma preparáty. Proteoliposomy obsahující MT06 indukovaly OspC-specifické protilátky tříd IgGa a IgGb (významné pro aktivaci komplementu). Proteoliposomy obsahující MT05 indukovaly preferenčně protilátky IgG. Výsledky potvrzují, že využití proteoliposomů v kombinaci s různými syntetickými analogy nor-muramyl dipeptidů významně zvyšují imunogenicitu antigenu, umožňují cíleně modulovat imunitní odpověď (Th, Th) při eliminované pyrogenitě a vysoké tolerabilitě použité aplikační formy. Práce byla podpořena výzkumným záměrem MSM698959, granty LF_00_04; GAČR P04/0/95; MZE ; KAN AVČR a KAN /8 STANOVENÍ SÉROVÝCH PROTILÁTEK PROTI INFLIXI- MABU A SÉROVÝCH HLADIN INFLIXIMABU KDY, PROČ A JAK? Malíčková K., Janatková I. Klinická imunologie a alergologie laboratoř, ÚKBLD VFN a. LF UK v Praze Infliximab je chimérická anti-tnf-alfa monoklonální protilátka izotypu IgG, která obsahuje ze 75 % lidskou a z 5 % myší bílkovinu. Váže se s vysokou afinitou na solubilní transmembránovou formu TNF-alfa, čímž inhibuje funkční aktivitu TNF-alfa. Mechanismus účinku infliximabu nebyl dosud zcela objasněn: po podání infliximabu dochází k neutralizaci TNF-alfa, což vyvolá zřejmě též apoptózu a komplementem zprostředkovanou cytotoxicitu. Infliximab se používá k biologické léčbě revmatoidní artritidy, ankylozující spondylitidy, Crohnovy nemoci dospělých a dětí, ulcerózní kolitidy, psoriázy a psoriatické artritidy. Jako chimérický protein obsahuje infliximab součásti pro lidský organismus imunogenní. Lidské protichimérické protilátky (human anti-chimeric antibodies, HACA) mohou být příčinou vzniku reakcí přecitlivělosti po podání infliximabu, případně mohou ovlivnit účinnost léčby. Polékové reakce vznikají do hodin po podání infliximabu u cca 0 % léčených pacientů. Mohou se vyskytnout rovněž pozdní reakce (7. 0. den po podání), projevující se jako sérová nemoc (v klinické studii ACCENT I byla incidence serumsickness-like projevů,4 %). V různých klinických studiích (s různým dávkováním infliximabu, 0 mg/kg) byly protilátky proti infliximabu (antibodies to infliximab, ATI) detekovány u 4 % nemocných s průvodní imunosupresivní terapií a až u 4 % bez průvodní imunosupresvní léčby. Stanovení ATI by mohlo mít praktický význam pro možnost predikce výše uvedených komplikací. Doposud však nebylo dosaženo konsensu ohledně metody stanovení ATI, nedořešena je rovněž problematika potenciální interference některých sérových faktorů (například revmatoidních faktorů) s analýzou. Ideální metodou detekce ATI se jeví enzymová imunoanalýza pro jednoduchost a přesnost provedení. Problémem ELISA metod při detekci ATI je volba správného konjugátu, který musí reagovat pouze se sérovými HACA, nikoliv s terapeutickou monoklonální protilátkou v séru nemocného. Tento problém řeší výrobci diagnostických souprav v zásadě třemi způsoby: ) konjugát je namířen proti determinantě lambda-řetězce (protože infliximab má pouze kappa lehké řetězce), nebo ) jako antigen jsou na mikrotitrační destičku naneseny Fab fragmenty infliximabu a konjugátem je anti-ch a/nebo anti-ch IgG, případně ) využitím tzv. bridging assay, ve které není využito klasického konjugátu, ale enzymem značené samotné terapeutické monoklonální protilátky, která zkříženě reaguje s monoklonální protilátkou navázanou na pevné fázi. Monitorování sérových hladin infliximabu je novinkou, která nebyla dosud široce komerčně dostupná. Dle dosavadních výzkumů je detekovatelná hladina infliximabu před podáním následné infuze Remicadu prognosticky příznivým faktorem pro úspěšnost léčby. Byl rovněž prokázán významně nižší výskyt postinfúzních reakcí u osob s detekovatelnou sérovou hladinou infliximabu. /9 SOUVISLOST FUNKČNÍCH VARIANT GENU TGFB S KOSTNÍMI DEFEKTY V OKOLÍ FEMORÁLNÍ KOM- PONENTY U TOTÁLNÍ ENDOPROTÉZY KYČLE Mrázek F., Gallo J., Sťahelová A., Petřek M. Laboratoř imunogenomiky a proteomiky, Ústav imunologie, Lékařská fakulta Univerzity Palackého a Fakultní nemocnice, Olomouc Ortopedická klinika, Lékařská fakulta Univerzity Palackého a Fakultní nemocnice, Olomouc Úvod: Periprotetická osteolýza (PPOL) a aseptické uvolnění jsou významnými dlouhodobými komplikacemi totální náhrady (TEP) kyčle. PPOL se rozvíjí jako komplexní odpověď organizmu na přítomnost mikročástic uvolňujících se z povrchu endoprotézy. Významnou složku etiopatogeneze tvoří prozánětlivé cytokiny a molekuly podmiňující akumulaci a vyzrávání osteoklastů. Naše skupina nedávno popsala souvislost určitých funkčních variant cytokinových genů s PPOL acetabula a dlouhodobým přežíváním protézy (). Cíl: Zjistit, zda některé z funkčních polymorfismů genů pro cytokiny a jejich receptory mohou souviset s rozsahem kostních defektů v okolí femorální komponenty TEP kyčle. Pacienti a metody: Do studie bylo zahrnuto 05 nepříbuzných pacientů české národnosti s necementovanou TEP kyčle, která byla implantována v jediném centru (Fakultní nemocnice Olomouc). Pacienti byli rozděleni do skupin podle závažnosti femorálních 7 Alergie, Supplementum /00

8 kostních defektů (klasifikace podle Saleha a spol.), (): Skupina : žádné/dutinové kostní defekty (Saleh, N = 94), Skupina : středně závažné defekty (Saleh, N = 77), Skupina : závažné defekty (Saleh 5, N = 4). Genotypy polymorfismů ve třinácti genech pro cytokiny a cytokinové receptory byly určeny u všech zařazených pacientů metodou PCR-SSP. Výsledky: Zjistili jsme, že se zastoupení CC homozygotů polymorfismu genu pro transformující růstový faktor, beta (TGFB codon 0, rs800470) zvyšuje se závažností femorálních kostních defektů (Skupina : %, Skupina : %, Skupina : 9 %, p = 0,0; Skupina versus Skupina ; p = 0,0; OR =,5; 95 % CI:, 9,). Vzácní CC homozygoti dalšího TGFB polymorfismu (codon 5, rs80047) se navíc vyskytovali pouze u pacientů s těžkými femorálními defekty (Skupina, %), ale zcela chyběli mezi pacienty s mírnými nebo středními defekty (p = 0,00). Závěr: Funkční varianty genu TGFB mohou v homozygotním stavu podmiňovat vnímavost k závažným femorálním kostním defektům po TEP kyčle. Naše výsledky by měly být nezávisle replikovány; žádoucí je i bližší objasnění role cytokinu TGFbeta a jeho genových variant v patogenezi femorální PPOL. Grantová podpora: IGA MZ NS/060-; IGA UP projekt č. LF_00_008, ČR. Literatura. Gallo et al. BMC Med Genet. 009;0:09.. Saleh et al. J Bone Joint Surg Am. 00;8-A(7): /0 DIFERENCIÁLNÍ LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA AU- TOPROTILÁTEK P ůtová I., Vencovský J. Revmatologický ústav, Praha Rozvoj oboru revmatologie nepochybně souvisí s kontinuálním vývojem imunologických vyšetřovacích technik, které umožňují a usnadňují diferenciální diagnostiku onemocnění. Vzhledem k tomu, že metody užívané k detekci autoprotilátek mají svá omezení různou senzitivitu a specificitu, není možné zajistit spolehlivou identifikaci protilátek pouze na základě indikace jedné vyšetřovací techniky. Zlatým standardem ke stanovení přítomnosti ANA, dsdna a ANCA protilátek zůstává metoda nepřímé imunofluorescence. K další a podrobnější typizaci je nutné užít jiných vyšetřovacích technik (ELISA, RIA, Dot bloty, Western bloty). Hojně jsou v laboratořích využívány komerčně dostupné diagnostické soupravy zaměřené na diferenciální laboratorní diagnostiku určitého onemocnění (např. SLE, SCL, PM/DM). Diagnóza RA (revmatoidní artritidy) je primárně založena na pozitivních nálezech klinických, radiologických a imunologických vyšetření. Přítomnost revmatoidního faktoru (RF) je stále jedním z kritérií American College of Rheumatology pro klasifikaci RA. RF není specifický pouze pro nemocné s RA, jelikož je často přítomen u nemocných s jinými autoimunitními chorobami (SLE, SS), chronickými infekcemi (HCV) a u starších zdravých jedinců (nad 65 let). Pro rutinní laboratorní praxi jsou k dispozici pod názvem ACPA (anti citrullinated protein antibodies) komerčně dostupné diagnostické soupravy s vyšší senzitivitou a specificitou pro RA než stejné údaje týkající se RF. Velice důležitý je také jejich prognostický význam, neboť jejich přítomnost souvisí se závažnějším průběhem RA. V současné době jsou pro diagnostiku RA k dispozici rovněž komerčně dostupné ELISA soupravy pro detekci anti-mcv (mutovaného citrulinovaného vimentinu) a anti Sa (citrulinovaný vimentin). V souvislosti s diferenciální laboratorní diagnostikou SLE stojí za zmínku detekce antinukleozomálních protilátek a anti-cq protilátek, které jsou přítomny zvláště u nemocných s lupusovou nefritidou. V rámci laboratorní diagnostiky revmatických onemocnění by neměl být ze strany laboratorního pracovníka zanedbatelný popis cytoplazmatického fluorescenčního obrazu (anti-jo- a anti SRP protilátky pro diferenciální diagnostiku PM/DM, protilátky proti cytokeratinu u pacientů s RA, autoimunitními hepatitidami, malobuněčným karcinomem plic a Crohnovou chorobou, protilátky proti aktinu u nemocných s aktivní hepatitidou, PBC a smíšeným onemocněním pojiva). Rovněž důležité je upozornění na výskyt protilátek proti mitochodriím (u nemocných s PBC, u nemocných se sklerodermií, CREST, SLE a SS) a protilátek proti ribozomům (0 0 % SLE nemocných bez přítomnosti ds DNA protilátek, u nemocných s neuropsychiatrickými symptomy). Závěr: Výsledky imunologických vyšetření stejně jako ostatní laboratorní vyšetření je nutno posuzovat komplexně a vždy s ohledem na klinický stav pacienta. / MUTAČNÍ ANALÝZA PACIENTŮ S HEREDITÁRNÍM AN- GIOEDÉMEM MOŽNÁ ÚSKALÍ MOLEKULÁRNÍ DIA- GNOSTIKY Ravčuková B., Grodecká L., Nejedlík J., Plotěná M., Kuklínek P., Litzman J., Freiberger T. Genetická laboratoř Centra kardiovaskulární a transplantační chirurgie, Brno Ústav klinické imunologie a alergologie LF MU a FN u Sv. Anny, Brno Identifikaci genových mutací, které jsou příčinou PID, je možno úspěšně provést jen na základě přesného klinického nálezu pacienta, doplněného imunologickými laboratorními výsledky. Při vyšetřování DNA pacientů se s výhodou využívají skenovací metody denaturační gradientová gelová elektroforéza (DGGE), konformační polymorfismus jednořetězců (SSCP), heteroduplexní analýza (HA) aj., které ale mají svá omezení. Tyto metody jsou následně doplněny přímou sekvenací jako zlatého standardu molekulární diagnostiky. Citlivá a ekonomicky výhodná se jeví detekce mutací na úrovni cdna, doplněná sekvenováním příslušného exonu. Na případech našich dvou pacientů bychom chtěli ukázat důležitost ověření získaného výsledku dvěma nezávislými metodami. V laboratoři jsme vyšetřovali DNA izolovanou z leukocytů pacientů s podezřením na hereditární angioedém. Gen pro C inhibitor byl lokalizován na. chromozomu a je tvořen 8 exony, kódujícími C-INH plazmatický protein, tvořený 478 aminokyselinami. Pro prvotní detekci změny standardní sekvence využíváme metodu DGGE s následným přesným určením změny sekvenací, v obou případech se specificky navrženými primery pro PCR. V popsaných případech metoda DGGE odhalila změnu ve 4. exonu genu pro C inhibitor. Následná sekvenace však podezření nepotvrdila. Vzhledem k opakovanému výskytu odlišného výsledku obou metod jsme sekvenovali jednotlivé fragmenty, rozdílně se pohybující v denaturačním gelu. V tomto případě byla sekvenční změna u obou pacientů ve 4. exonu genu pro C INH zachycena. Stejně byla tato změna potvrzena i při využití primerů, komplementárních Alergie, Supplementum /00 7

9 k vzdálenější intronové sekvenci. Při této sekvenaci byla nalezena i pravděpodobná příčina odlišných výsledků obou metod, a to změna nukleotidu na. pozici sekvenačního R-primeru (jednalo se o polymorfismus ve 4. intronu vyšetřovaného genu, v současné době již popsaný). Následně byly u obou pacientů nalezeny kauzální mutace: g.444gtot s výslednou záměnou aminokyselin p.cys8phe a g.45-a > g s významným vlivem na splicing. Uvedený případ ukazuje na význam potvrzení získaného výsledku dvěma nezávislými detekčními metodami. Falešně negativní i falešně pozitivní výsledky mutačních analýz dědičně podmíněných chorob mohou mít různé příčiny (Amy P. Hsu, Curr Opin Allergy Clin. Imunol, 009 December:9(6):57-54) a jsou stále řešeným problémem. / AESCULAB JE SYSTEMATICKÉ LABORATORNÍ VZDĚ- LÁVÁNÍ STUDENTŮ PŘÍRODOVĚDNÝCH OBORŮ NA VYSOKÝCH ŠKOLÁCH Raška M., Luhová L. Ústav imunologie, Lékařská fakulta, Olomouc Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci Cílem projektu AescuLab je systematické laboratorní vzdělávání studentů postgraduálního a magisterského studia přírodovědných oborů na vysokých školách a pracovníků vědy a výzkumu v oblasti Life Sciences s podporou e-learningu, vedoucí ke zkvalitnění odborné přípravy studentů v laboratorních postupech v oblasti molekulární a buněčné biologie, biochemie a imunologie. Projekt je realizován ve spolupráci tří pracovišť Přírodovědecké a Lékařské fakulty UP, které se zabývají výzkumem a vývojem v oblasti Life Sciences: Katedry biochemie PřF UP, Laboratoře růstových regulátorů PřF UP a AV ČR a Ústavem imunologie LF UP. V rámci řešení projektu budou popsány a zdokumentovány nejdůležitější experimenty a pokročilé laboratorní techniky v oborech molekulární a buněčné biologie, biochemie a imunologie. Každý experimentální modul bude obsahovat teoretický úvod s odkazy na literaturu, detailní popis materiálů, přístrojů, chemikálií včetně fotodokumentace, podrobný textový popis pracovního postupu a metodiku vyhodnocení výsledků. U každého modulu jsou uvedena možná úskalí experimentu a na závěr zkrácená verze laboratorního postupu v české a anglické verzi. V rámci přípravy jednotlivých modulů budou natočeny videosekvence dokumentující klíčové úseky experimentů. Celkem bude zdokumentováno alespoň 00 experimentálních modulů a laboratorních postupů. V rámci projektu budou po dobu semestrů od LS 0 pořádány laboratorní workshopy, na kterých se studenti, případně pracovníci za pomoci portálu seznámí s experimenty, které jsou relevantní jejich výzkumu a tématům disertačních a diplomových prací. Osvojené postupy si prakticky vyzkouší v laboratoři za pomoci laborantů a odborných řešitelů projektu. Předpokládá se proškolení asi 00 studentů a pracovníků PřF a LF UP. Informace o postupu řešení projektu a přístup k webové aplikaci s uvedenými moduly je dostupný na Práce vznikla za podpory projektu AescuLab systematické laboratorní vzdělávání studentů a pracovníků VaV v oblasti Life Sciences s podporou e-learningu, CZ..07/..00/ / AUTOPROTILÁTKY U PERNICIÓZNÍ ANÉMIE POROV- NÁNÍ DETEKČNÍCH METOD Sedláčková L., Průcha M., Dubská L. Oddělení klinické biochemie, hematologie a imunologie Nemocnice Na Homolce, Praha Úvod: Perniciózní anémie je chronické onemocnění autoimunitního původu spojené s deficitem vitamínu B a chronickou atrofickou gastritidou. Typické hematologické projevy (megaloblastová anémie) se vyvíjí s latencí 0 0 let od počátku choroby a neléčené onemocnění vede ke komplikacím včetně ireverzibilních neurologických. Diagnostika zahrnuje změny v krevním obraze, nízkou hladinu vitamínu B, historicky Schillingův test (tč. prakticky nedostupný), endoskopické vyšetření žaludku a průkaz protilátek proti parietálním buňkám žaludku (terčovému antigenu H+/K+ ATPáze, přítomny u 90 % pacientů) a protilátek proti vnitřnímu faktoru (až u 70 % pacientů). Léčba spočívá v doživotní substituci vitamínu B. Cíl: Porovnat výsledky stanovení protilátek proti vnitřnímu faktoru a proti terčovému antigenu parietálních buněk H+/K+ ATPáze různými metodami (luminex, ELISA, imunochemiluminiscence). Metodika: V souboru A (54 pacientů) byly stanoveny protilátky proti vnitřnímu faktoru metodami luminex (souprava FIDIS Gastric firmy BMD) a imunochemiluminiscence (souprava Access firmy Beckman Coulter). V souboru B (48 pacientů) byly stanoveny protilátky proti vnitřnímu faktoru a H+/K+ ATPáze metodami luminex (souprava FIDIS Gastric f. BMD) a ELISA (soupravy Aeskulisa Intrinsic factor a Parietal cell). U všech pacientů byly také stanoveny protilátky proti parietálním buňkám nepřímou imunofluorescencí (souprava RL/RK/RS firmy BioSystems). Výsledky: Studované metody spolu velice dobře korelují, nejlépe protilátky proti vnitřnímu faktoru metodou ELISA a luminex (korelační koeficient r = 0,976 při p < 0,000). Protilátky proti H+/K+ATPáze metodou ELISA a luminex měly korelační koeficient r = 0,886 při p < 0,000 a protilátky proti vnitřnímu faktoru metodou luminex a imunochemiluminiscencí měly korelační koeficient r = 0,7949 při p < 0,000. ROC křivky všech metod mají podobné AUC: 0,865 (H+/K+ATPáza luminex), 0,858 (H+/ K+ATPáza ELISA), 0,85 (vnitřní faktor imunochemiluminiscence), 0,844 (vnitřní faktor ELISA), 0,754 (vnitřní faktor luminex). Všemi použitými metodami a v souladu s literaturou má stanovení protilátek proti H+/K+ ATPáze dobrou senzitivitu (77,8 8, %) a stanovení protilátek proti vnitřnímu faktoru vysokou specificitu (87,5 94,9 %). Závěr: Časná diagnostika onemocnění je žádoucí vzhledem k dlouhé době latence mezi začátkem procesu (atrofická gastritis často klinicky němá) a typickým pozdním hematologickým projevem (megaloblastová anémie). Kombinace senzitivního stanovení protilátek proti terčovému antigenu parietálních buněk (H+/K+ ATPáze) a specifického vyšetření protilátek proti vnitřnímu faktoru jasně zlepšuje diagnostické možnosti oproti samotnému stanovení protilátek proti parietálním buňkám nepřímou imunofluorescencí. Výsledky všech tří studovaných metod (ELISA, luminex či imunochemiluminiscence) dávají srovnatelně kvalitní výsledky. 74 Alergie, Supplementum /00