Test blastické transformace lymfocytů a hypersenzitivita na pšeničnou mouku a lepek

Transkript

1 Test blastické transformace lymfocytů a hypersenzitivita na pšeničnou mouku a lepek The lymphocyte transformation test and hypersenzitivity to wheat and gluten IVANA ŠETINOVÁ, MARIE HAVRANOVÁ, EVA DAŇKOVÁ Immunia spol. s r. o. Praha SOUHRN V současné době roste počet lidí se zdravotními problémy po požití lepku a pšeničné mouky, u kterých nebyla zjištěna celiakie ani IgE mediovaná alergie na pšeničnou mouku. Nasazení bezlepkové diety vede u těchto lidí k vymizení klinických obtíží. Jedná se o nově definovanou klinickou jednotku neceliatická citlivost na lepek (NCCL). Neexistuje dosud žádný biomarker, který by tuto diagnózu potvrdil. Cílem naší pilotní studie bylo ověřit využití testu blastické transformace lymfocytů (BTL) pro diagnostiku hypersenzitivity na pšeničnou mouku. Vyšetřili jsme 63 pacientů s projevy dráždivého tračníku. U všech pacientů byla vyloučena sérologickými testy celiakie, kožními testy a stanovením sige protilátek IgE mediovaná alergie na pšeničnou mouku, kravské mléko a sóju. Celkem 42 pacientů mělo pozitivní BTL s pšeničnou moukou, 3 pacienti zároveň i se sójou. Nasazená bezlepková dieta vedla k vymizení či zmírnění klinických obtíží u všech pozitivních pacientů, u 20 z nich byl proveden otevřený expoziční test s pšeničnou moukou s návratem symptomů. Dle našich výsledků může být test blastické transformace lymfocytů laboratorní metodou, která pomůže identifikovat mezi pacienty s dráždivým tračníkem ty, kteří trpí neceliatickou citlivostí na lepek, a u kterých lze očekávat zlepšení klinických obtíží po nasazení bezlepkové diety. Klíčová slova: neceliatická citlivost na lepek, celiakie, alergie na pšeničnou mouku, test blastické transformace lymfocytů SUMMARY A significant percentage of the general population report problems caused by wheat and gluten ingestion, even though do not have celiac disease or wheat allergy. All report improvement of symptoms on gluten-free diet. This clinical condition has been named non-celiac gluten senzitivity (NCGS). The reliable biomarkers for NCGS are not identified yet. The aim of our pilot study was to verify the diagnostic value of the lymphocyte transformation test in patients with irritable bowel syndrome as a diagnostic test for wheat hypersenzitivity. We investigated 63 patients who developed IBS. All patients had negative celiac disease serology and negative level of specific IgE antibodies to wheat, milk and soy allergens. 42 patients had positive LTT with a wheat commercial extract, 3 of them with wheat and soy extracts. All report improvement of symptoms on gluten-free diet. 20 patients had positive open challenge test with wheat. It seems that the lymphocyte transformation test is useful diagnostic tool for NCGS in patients with irritable bowel syndrome. Key words: non-celiac gluten sensitivity, celiac disease, wheat allergy, the lymphocyte transformation test Úvod V současné době roste počet lidí se zdravotními problémy po požití lepku a pšeničné mouky. V případě, že je u těchto pacientů vyloučena celiakie a IgE mediovaná alergie na pšeničnou mouku, je nutné uvažovat o neceliatické citlivosti na lepek (NCCL). Přecitlivělost na lepek byla popsána již v roce 1981 (4). V roce 2010 byla znovuobjevena. Vyšla práce popisující její klinické projevy a diagnostiku (3). Bylo zřejmé, že se jedná o novou klinickou jednotku. V roce 2011 se v Londýně sešla expertní skupina, která navrhla novou nomenklaturu a klasifikaci onemocnění způsobených lepkem. Vedle celiakie a alergie na pšenici (IgE-mediované) byla nově definována neceliatická citlivost na lepek NCCL (18). Pro NCCL dosud chybí specifické diagnostické biomarkery. V praxi je prvním krokem vyloučení celiakie a IgE mediované alergie na pšeničnou mouku. Diagnostika je tedy možná pouze po vyloučení jiných příčin obtíží a účinkem bezlepkové diety. Vymizení symptomů po několikatýdenní bezlepkové dietě a následně návrat klinických příznaků po expozičním testu lepkem tuto diagnózu podporuje. Je doporučován dvojitě slepý, placebem kontrolovaný expoziční test, který je však 257

2 v běžné praxi obtížně proveditelný (13, 15). Častá je frekvence NCCL u pacientů s dráždivým tračníkem, kolem 30 % (1). Předpokládá se, že existují dva subtypy NCCL: samostatný typ NCCL s hypersenzitivitou jen na lepek a pšeničnou mouku a typ spojený s hypersenzitivitou na další potraviny, především na kravské mléko a sóju. Některé práce zdůrazňují, že by se mohlo jednat o non-ige mediovanou alergii jak u samotné NCCL (15), tak především u subtypu s hypersenzitivitou na více potravin. U tohoto subtypu pacienti mají klinické příznaky více připomínající potravinovou alergii, v dětství přechodnou potravinovou alergii a koexistenci atopie. Dále je u těchto pacientů uváděna častější pozitivita protilátek proti gliadinu v izotypu IgG, pozitivita testu aktivace bazofilů s pšeničnou moukou a zvýšení počtu eosinofilů v lamina propria střevní sliznice. Celiakii predisponující genotypy HLA DQ2 a DQ8 byly zjištěny u 50 % pacientů s NCCL (13). U těchto pacientů byla prokázána duodenální lymfocytóza a předpokládá se, že mají predispozici pro atrofii střevních klků (15, 17). Poznatky o patogenezi NCCL jsou stále nekompletní, kromě lepku mohou hrát významnou úlohu inhibitory amylázy/trypsinu, obsažené v pšenici, a i jiné pšeničné antigeny, event. karbohydrátové řetězce (13, 15). U pacientů s NCCL bylo prokázáno snížení markeru regulačních T-lymfocytů FOXP3 ve střevní sliznici s narušením regulačních faktorů (13, 17). Dále bylo prokázáno zvýšení CD3+T-lymfocytů a intraepiteliálních lymfocytů alfa a beta na sliznici střeva (Marsh 1). Zvýšená exprese toll-like receptoru TLR2 potvrzená u NCCL ukazuje na důležitou roli vrozené imunity s indukcí zánětlivé odpovědi, která může vyústit ve specifickou adaptivní odpověď na antigeny (15). Poruchou regulačních mechanismů může tedy docházet k aktivaci specifických T-lymfocytů po kontaktu s pšeničnou moukou (13, 15). Na základě těchto znalostí jsme pro diagnostiku využili test blastické transformace lymfocytů (BTL). Test je již řadu let využíván pro diagnostiku imunodeficiencí nebo k prokázání specifické senzibilizace k některým antigenům, jako např. infekční agens, toxiny či léky (7, 10, 16). Poslední práce ukazují, že tento test by mohl být nadějným in vitro testem pro diagnostiku non-ige mediované potravinové alergie (6, 11, 12). Principem testu je měření klonální proliferace lymfocytů po 5 7 dnech stimulace potravinovým antigenem. Při využití tohoto testu pro diagnostiku přecitlivělosti na antigeny potravin se vychází z předpokladu, že pokud byly lymfocyty senzibilizovány určitým antigenem (v našem případě proteiny pšeničné mouky), stávají se paměťovými buňkami, které po dalším kontaktu s daným antigenem proliferují (5, 7). Metody Pacienti 1. skupina 63 pacientů (53 žen, 10 mužů, medián věku 33 let) s klinickými projevy dysmotility trávicího traktu (nadýmání, bolesti břicha, zácpa event. průjmy). U všech těchto pacientů jsme provedli sérologické testy na celiakii (protilátky proti tkáňové transglutamináze v izotopu IgA-tTGA, proti endomysiu a vyšetření hladiny sérového IgA). 2. skupina 6 pacientů s celiakií 2 nově diagnostikováni, 2 na bezlepkové dietě řadu let již s negativním výsledkem ttga a 2 pacienti po nasazení bezlepkové diety, u kterých nedošlo ještě k normalizaci hodnot protilátek proti tkáňové transglutamináze. 3. kontrolní skupina 10 zdravých neatopických jedinců, u kterých byla provedena stejná vyšetření včetně blastické transformace lymfocytů. U všech pacientů byla vyloučena IgE mediovaná potravinová alergie kožními prick testy s komerčními extrakty potravin Alyostal (Stallergenes) a vyšetřením sige protilátek (Immulite) s alergeny kravského mléka, pšeničné mouky a sóji. Test blastické transformace Test blastické transformace lymfocytů byl prováděn tak, jak je uvedeno v literatuře (2, 7). Lymfocyty byly separovány na Ficollu, propláchnuty médiem (X-VIVO, Lonza) a naředěny na koncentraci /ml. Jako pozitivní kontrola byl použit tetanus toxoid (Statena Serum Institut) o koncentraci 250 IU/ml. Pro stimulaci lymfocytů byly použity komerční extrakty potravin Alyostal 1000 IC/ml (Stallergenes) pšeničná mouka, sója, Casein kappa (2 mg/ ml) v ředěních 1:10 a 1:20. Tato ředění neměla cytotoxický vliv na buňky. Z našich interních výsledků a prováděné titrace považujeme za optimální koncentraci ředění 1:10. Inkubace lymfocytů s alergenem byla prováděna při teplotě 37 C, v prostředí 5% CO 2 po dobu 6 dní. Poté byly buňky přeneseny do zkumavek a separovány. Jejich DNA byla značena propidium iodidem (1 mg/ml). Měření bylo provedeno na cytometru FC500 (Beckman-Coulter). Jednotlivé fáze proliferujících buněk byly vyhodnoceny programem MultiCycle. Jako pozitivní výsledek bylo považováno více než 3% transformovaných lymfocytů při inkubaci s daným alergenem nebo stimulační index (SI) vyšší než 3 (SI = % proliferujících buněk po stimulaci s alergenem / % proliferujících buněk bez stimulace). Výsledky Do první skupiny bylo zařazeno 63 pacientů. Z toho 42 pacientů (66 %) reagovalo pozitivně v BTL na alergeny pšeničné mouky (tab. 1). Stimulační index se pohyboval v rozmezí 3 40, tj. od slabě pozitivního do silně pozitivního výsledku s mediánem SI = 6,1. U třech pacientů byla zaznamenána pozitivita i na sóju. Celkem 19 pacientů (31 %) reagovalo v tomto testu negativně (Obr. 1A, 1B, 1C). Všem 42 pozitivním pacientům byla doporučena bezlepková dieta po dobu jednoho měsíce. U všech došlo k vymizení či zmírnění klinických obtíží. Bezlepková dieta byla doporučena také 5 pacientům, kteří reagovali negativně v BTL s pšeničnou moukou; dieta u nich měla jen malý efekt na obtíže. Bylo vybráno 20 pacientů, u kterých došlo k úplnému vymizení klinických obtíží na bezlepkové dietě. Byla u nich zaznamenána vyšší hodnota SI, případně % proliferovaných lymfocytů (medián SI = 7,6; 258

3 Tab. 1: Výsledky pozitivních pacientů v testu blastické transformace lymfocytů s pšeničnou moukou diagnostika a laboratorní technika pacient dokonč. věk LTT % LTT stimul. index IgG gliadin IP klinické obtíže elimin. test expozič. test 1 1 4,7 4,7 -- B,V,Z pozit. pozit ,0 8,7 -- N,B,P pozit. pozit ,0 15,5 n P pozit ,0 7,6 -- V,Z pozit. pozit ,3 3,5 -- N,B,P, pozit ,3 14,7 -- N,Z,B pozit. pozit ,6 10,7 n Z,V,B pozit. pozit ,3 3,5 -- B,P pozit ,6 8,0 -- Z,B,V pozit. pozit ,0 8,4 0,96 N,Z,B pozit ,6 2,5 2,20 N,Z pozit ,3 3,3 1,70 N,Z,B pozit ,4 7,1 3,60 N,Z,B pozit. pozit ,7 6,7 -- N,Z,B pozit ,5 6,8 -- N,Z,B pozit ,0 7,2 n N,Z,B pozit. pozit ,7 6,7 -- N,Z,B pozit ,5 5,0 -- N,B,V pozit ,0 6,0 1,83 N,B,Z pozit. pozit ,1 4,1 n N,Z,B pozit. pozit ,0 40,0 1,41 N,Z,B pozit. pozit ,5 4,3 -- N,Z,B pozit ,1 12,2 -- N,Z,B pozit. pozit ,3 2,2 -- N,Z,P pozit ,2 4,8 2,44 N,Z,B pozit ,8 4,2 -- N,Z,B pozit ,0 3,8 2,60 N,Z,B pozit ,6 4,3 -- N,Z,B pozit ,2 3,9 -- P,B,N pozit. pozit ,5 3,5 n N,Z,B pozit ,7 9,7 -- N,Z,B pozit. pozit ,8 3,4 -- N,Z,B pozit ,8 10,4 -- N,Z,B pozit. pozit ,9 7,3 n N,Z,B pozit. pozit ,2 5,2 -- N,Z,B pozit ,7 6,1 -- N,Z,B pozit. pozit ,8 3,4 -- N,Z,B pozit ,8 22,5 -- N,Z,B pozit. pozit ,4 3,1 n N,Z,B pozit. pozit ,4 6,7 -- N,Z,B pozit ,0 3,1 n N,Z,B pozit. pozit ,5 5,0 1,45 N,Z,B pozit. Legenda: N nadýmání, Z zácpa, B bolesti břicha, P průjmy, U únava, V neprospívání, IP index pozitivity, n v normě, LTT test blastické transformace lymfocytů výsledek: % proliferovaných lymfocytů po stimulaci s alergenem pšeničné mouky tučná čísla pozitivní výsledek medián proliferovaných lymfocytů 8 %). U těchto pacientů jsme doporučili zátěž pšeničnou moukou otevřeným expozičním testem. Doporučovaný dvojitě slepý, placebem kontrolovaný expoziční test jsme z technických důvodů nebyli schopni provádět. Otevřeným expozičním testem jsme však bohužel nevyloučili možný placebový efekt dietních opatření. U všech 20 exponovaných pacientů (33 % z celkového počtu) došlo k návratu střevních obtíží většinou do dvou dnů po expozici. U 16 pozitivních pacientů jsme vyšetřili i protilátky proti gliadinu v izotopu IgG vzhledem k literárním údajům, že u neceliatické citlivosti na lepek je častější záchyt pozitivity těchto protilátek (13, 15). Zvýšenou hodnotu protilátek mělo 9 pacientů (56 %), 7 pacientů mělo hodnotu v mezích 259

4 1A 1B 1C Obr. 1: 1A Negativní kontrola 0,97% proliferujících buněk, 1B Pacient nereaguje na stimulaci alergenem pšenice -0,98 % proliferujících buněk, 1C Pacient reaguje na stimulaci alergenem pšenice -20,3% proliferujících buněk normy. U třech pozitivních pacientů byla zjištěna i pozitivita BTL na extrakt sóji. Ve 2.skupině 2 pacienti s nově diagnostikovanou celiakií a vysokou hodnotou ttga před nasazením bezlepkové diety reagovali výrazně pozitivně na alergeny pšenice v BTL (SI = 17 a 13,5). U 2 pacientů na dlouhodobé bezlepkové dietě a s negativní serologií protilátek proti tkáňové transglutamináze jejich lymfocyty v BTL s extraktem pšeničné mouky neproliferovaly. Jeden pacient s nasazenou dietou půl roku a poklesem ttga lehce nad normu reagoval hraničním zvýšením SI, další pacientka s nasazenou bezlepkovou dietou 3 měsíce bez poklesu hodnoty ttga měla SI = 4 (Tab. 2). Třetí kontrolní skupina neatopických jedinců byla v BTL se všemi alergeny negativní. Diskuse Naše zjištění, že pokud pacienti s celiakií nejsou na bezlepkové dietě, dochází k proliferaci T-lymfocytů po kontaktu s pšeničnou moukou, je ve shodě s literárními údaji. V letošním roce publikovaná práce autorů Liu a spol. (14) potvrdila, že u dětí s nově diagnostikovanou celiakií dochází k proliferaci CD4 T lymfocytů s alfa a gamma gliadinem. Vyšetření pacienti, kteří jsou již několik let na bezlepkové dietě s negativními protilátkami proti tkáňové transglutamináze byli v testu blastické transformace lymfocytů s pšeničnou moukou negativní. U celiatiků na dlouhodobé bezlepkové dietě dochází k výraznému snížení CD4 T ly (Th 17) ve střevní sliznici, což pravděpodobně vede ke snížené aktivitě specifických T-lymfocytů (15). Z našich výsledků je patrné, že podobně reagují i pacienti s neceliatickou citlivostí na lepek. Může u nich docházet vlivem snížení markeru regulačních FOXP3 ly ve střevní sliznici k narušení regulačních faktorů a k aktivaci specifických T-lymfocytů po kontaktu s lepkem a pšeničnou moukou. Paměťové T-lymfocyty jsou pak schopny proliferovat po inkubaci s antigenem in vitro v testu blastické transformace lymfocytů (5, 8, 20). Počet pozitivních pacientů s otevřeným expozičním testem z celkového počtu našich pacientů (33 %) souhlasí s udávanou incidencí NCCL u pacientů se syndromem dráždivého tračníku (1). Tito pacienti měli medián SI = 7,6 a medián proliferujících lymfocytů 8 %. Z malé skupiny náhodně vybraných pacientů s pozitivním výsledkem BTL jsme potvrdili, že více než 50 % z nich má pozitivitu protilátek proti gliadinu v izotopu IgG (13). Nález pozitivity testu u tří pacientů i na alergen sóji ukazuje, že by se mohlo u nich jednat o subtyp NCCL s mnohočetnou potravinovou senzitivitou. Tito pacienti mají v dětství udávanou potravinovou alergii, u jedné pacientky je přítomný atopický ekzém. Nepotvrdili jsme v literatuře udávanou pozitivitu testu aktivace bazofilů s pšeničnou moukou (15). Tab. 2: Test blastické transformace lymfocytů s pšeničnou moukou u pacientů s celiakií pacient dokonč. věk ttga U/ml LTT % LTT stimul. index IgG gliadin IP klinické obtíže 1 19 < 8 1,7 2,0 n celiakie dieta 5 let 2 20 < 8 1,0 1,1 n celiakie dieta 6 let ,8 2,7 3,3 -- celiakie dieta 1/2 roku 4 39 >100 2,0 4,0 -- celiakie dieta 3 měsíce 5 53 >100 13,5 13,5 -- celiakie záchyt 6 63 >100 24,3 24,0 2,43 celiakie záchyt Legenda: LTT test blastické transformace lymfocytů výsledek: % proliferovaných lymfocytů po stimulaci s alergenem pšeničné mouky tučná čísla pozitivní výsledek 260

5 Na základě našich výsledků se zdá být velmi nadějné, že test blastické transformace lymfocytů může být laboratorní metodou, která pomůže identifikovat mezi pacienty s dráždivým tračníkem ty, kteří trpí neceliatickou citlivostí na lepek, a u kterých lze očekávat zlepšení klinických obtíží po nasazení bezlepkové diety (1, 19, 21). Znalosti o NCLL jsou dosud nekompletní a stále není jasné, zda tato diagnóza je přechodná nebo perzistující. Pacienti s NCCL jsou sirotci pohybující se v zemi nikoho, kteří nejsou dostatečně vnímáni a diagnostikováni ani gastroenterology ani specialisty zabývající se celiakií (22). Rostoucí počet lidí, kteří se cítí lépe na bezlepkové dietě, je signálem pro nutnost zlepšení diagnostických kritérií a impulsem ke sledování incidence a prevalence této choroby. Závěr Test blastické transformace je nadějným in vitro testem pro diagnostiku přecitlivělosti na alergeny pšeničné mouky. Naším dalším cílem je: 1. Sledovat dynamiku proliferace lymfocytů s pšeničnou moukou u pozitivních pacientů na bezlepkové dietě. 2. Doporučit bezlepkovou dietu všem pacientům s projevy dráždivého tračníku, kteří reagovali negativně v BTL na pšeničnou mouku. Vyhodnotit efekt dietních opatření a ozřejmit tím i možnost vlivu karbohydrátových řetězců obsažených v obilovinách na střevní obtíže. LITERATURA 1. Aziz I, Sanders DS. The irritable bowel syndrome-celiac disease connection. Gastrointest endoscopy Clin N Am. 2012; 22: Baehr V, Mayer W, Liebenthal C, Baehr R, Volk HD. Improving the in vitro antigen specific T cell proliferation assay: the use of interferon-alpha to elicit antigen specific stimulation and decrease bystander proliferation. J Immunol Methods. 2001; 251: Carrocio A, Brusca I, Mansueto P, Pirrone G, Barrale M, Di Prima L, Ambrosiano G, Lacono G, Lospalluti ML, La Chiusa SM, Di Fede G. A cytologic assay for diagnosis of food hypersenzitivity in patients with irritable bowel syndrome. Clinical gastroenterology and hepatology 2010; 8: Cooper BT, Holmes GK, Ferguson R, Thompson RA, Allan RN, Cooke WT. Gluten-sensitive diarrhea without evidence of celiac disease. Gastroenterology 1981; 81: Eigenmann PhA, Frossard ChP. The T lymphocyte in food-allergy disorders. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2003; 3: Giavi S, Megremis S, Papadopoulos NG. Lymphocyte stimulation test for diagnosis of non-ige mediated cow s milk allergy: A step closer to a noninvasive diagnostic tool? Int Arch Allergy Immunolog. 2012; 157: Havranová M, Honzová S, Lehovcová A, Koubová J. Blastická transformace využití průtokového cytometru ke stanovení DNK. Klin Imunológia a Alergológia. 1998; 3: Hoffman KM, Ho DG and Sampson HA. Evaluation of the usefulness of lymphocyte proliferation assays in the diagnosis of allergy to cow s milk. J Allergy Clin Immunol. 1997; 99: Ikeda K, Ida S, Kawahara H, Kawamoto K, Etani Y, Kubota A. Improtance of evaluating for cows milk allergy in pediatric surgival patients with functional bowel symptoms. Journal of Pediatric Surgery. 2001; 46: Kano Y. Utility of the lymphocyte transformation test in the diagnosis of drug hypersenzitivity: dependence on its timing and the type of drug eruption. Allergy. 2007; 62: Kimura M, Oh S, Narabayashi S, Taguchi T. Usefulness of lymphocyte stimulation test for the diagnosis of intestinal cow s milk allergy in infants. Int Arch Allergy Immunolog. 2012; 157: Kondo N, Fukutomi HA and Yokoyama Y. Proliferative responses of lymphocytes to food antigens are useful for detection of allergens in nonimmediate type of food allergy. J Invest Allergol Clin Immunol. 1997; Vol. 7(2): Leonard MM, Vasagar B. US perspective on gluten-related disease. Clin Exp Gastroenterol. 2014; Jan 24(7): Liu E, McDaniel K, Case S, Liping Yu, Gerhartz B, Ostermann N, Fankhauser G, Hungerford V, Zou Ch, Luyten M, Seidl KJ, Michels AW. Exploring T cell reaktivity to gliadin in young children with newly diagnosed celiac disease. Autoimune Dis. 2014; Mansueto P, Seidita AD, Alcamo A, Carrocio A. Non-celiac gluten senzitivity: Literature rewiew. Journal of the American College of Nutrition. 2014; Vol. 33(1): Pichler WJ, Tilch J. The lymhocyte transformation test in the diagnosis of drug hypersenzitivity. Allergy. 2004; 59: Pietzak M. Celiac disease, wheat allergy and gluten senzitivity: When gluten free is not a fad. J Parenter Enteral Nutr. 2012; 36:68S. 18. Sapone A, Bai JC, Ciacci C, Dolinsek J, Green PH, Hadjivassiliou M, Kaukinen K, Rostami K, Sanders DS, Schumann M. Spectrum of gluten-related disorders: Consensus on new nomenclature and classification. BMC Med. 2012; Sapone A, Lammers KM, Mazzarella G, Mikhailenko I, Carteni M, Casolaro V, Fasano A. Differential mucosal IL-17 expression in two gliadin-induced disorders: Gluten sensitivity and the autoimmune enteropathy celiac disease. Int Arch Allergy Immunol. 2010; 152: Spergel JM. Nonimmunoglobulin E-mediated immune reactions to foods. Allergy Asthma Clin Immunol. 2006; Vol. 2(2): Vazquez-Roque MI, Camilleri M, Smirk T, Murray JA, Marietta E, O Neill J, Carlson P, Lamsam J. A controlled trial of gluten- -free diet in patients with irritable bowel syndrome-diarrhea: Effects on bowel frequency and intestinal function. Gastroenterology. 2013; 144: Verdu EF, Armstrong D, Murray JA. Between Celiac Disease and Irritable Bowel Syndrome: The No Man s Land of Gluten Senzitivity. Am J Gastroenterol. 2009; 104(6): MUDr. Ivana Šetinová IMMUNIA spol. s r.o. Thámova 183/ Praha 8-Karlín setinova@immunia.org 261