Základy princip pr tokové cytometrie

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Základy princip pr tokové cytometrie"

Mária Šimková
před 4 lety
Počet zobrazení:

1 Základy princip pr tokové cytometrie

2 Flow Cytometry Flow cytometrie je technologický proces, který umož uje individuální stanovení fluorescence jednotlivých bun k. Tento proces umož uje stanovit tisíce bun k za vte inu Informace jsou d ležité z hlediska charakterizace bun k

3 Historie Flow cytometrie je vyvinuta z mikroskopické techniky F.T. Gucker (1947) poprvé sestrojil p ístroj pro detekci bakterií v laminárním proudu vzduchu L. Kamentsky (IBM Labs), a M. Fulwyler (Los Alamos Nat. Lab.) dále experimentovali s íd ním bun k podle jednotlivých charakterizací V roce 1972 L. Herzenberg (Stanford Univ.) vyvinul t ídi, který rozd loval bu ky obarvené fluorescen zna enými Ab - Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS).

4 Aktiva ní proces fluorescence nebo Imunofluorescence Antibodies recognize specific molecules in the surface of some cells Antibodies are artificially conjugated to fluorochromes FITC FITC Antibodies FITC FITC FITC FITC When the cells are analyzed by flow cytometry the cells expressing the marker for which the antibody is specific will manifest fluorescence. Cells who lack the marker will not manifest fluorescence But not others

5 Bun né parametry, které mohou být eny pomocí FC Hlavní No reagents or probes required (Structural) Cell size(forward Light Scatter) Cytoplasmic grabularity(90 degree Light Scatter) Photsynthetic pigments Vedlejší Reagents are required. Structural DNA content DNA base ratios RNA content Functional Surface and intracellular receptors. DNA synthesis DNA degradation (apoptosis) Cytoplasmic Ca++ Gene expression

6 Aplikace FC Immunofluorescence Kinetika bun ného cyklu Bun ná kinetika Genetika Molekulární biologie Mikrobiologie Parasitologie

7 Tyto aplikace zahrnují zjišt ní: Velikosti bun k Cytoplazmatické granularity Povrchových antigen Apoptózy Intracelulární produkce cytokin Intracelulární signalizace Bun ného cyklu, množství DNA. Vázaného a volného kalcia Bun né proliferace

8 Flow cytometrie v sob integruje elektroniku, fluidiku, PC, optiku, software a laser technologie v relativn jednoduchém uspo ádání

9 Z Y Sample Sheath Hydrodynamická fokusace X Flow chamber Y Z Laser optics Laser Beam X

10 Laminar Fluidic Sheath Core Sheath FITC FL PE FL Outer Sheath 488nm Sct

11 Each cell generates a quanta of fluorescence Photomultiplier Tubes (PMT s) PE FL FITC FL 488nm Sct Discriminating Filters Dichroic Lenses Confocal Lens Forward Light Scattering Detector

12 Optical Bench Schematic FL2 Sensor 575BP FL3 Sensor 620BP FL4 Sensor 675BP FL1 Sensor 525BP SS Sensor Fluorescence Pickup Lens 600DL 645DL Laser Beam 488BK 550DL 488DL Flow Cell FS Sensor

13 From Fluorescence to Computer Display Bun ná fluorescence je detekována r znými detektory(pmt s). PMT s convert light into electrical pulses. These electrical signals are amplified and digitized using Analog to Digital Converters (ADC s). Each event is designated a channel number (based on the fluorescence intensity as originally detected by the PMT s) on a 1 Parameter Histogram or 2 Parameter Histogram. All events are individually correlated for all the parameters collected.

14 Light Scattering, 2 Parameter Histogram Bigger 90 degree Light Scatter Y Axis Apoptotic Cells Dead Cells Bigger Cells More Granular X Axis Forward Light Scatter (FLS) Live Cells

15 1 Parameter Histogram Negative Positive Count Dimmer Brighter Channel Number Fluorescence picked up from the FITC PMT

16 Single Positive PI Population 2 Parameter Histogram Double Positive Population PE FL Negative Population FITC FL Single Positive FITC Population

17 Flow Cytometry Data Smaller Region, Live cells mostly Larger Region includes all cells

18 Flow Cytometry and sorting Pressurized Cell Sample Ultrasonic Transducer 488nm Formard Light Scatter Detector Collimated Light Path Through Dichroic and Band Pass Filters Pressurized 1X PBS(Sheath) PMTs FL4 Pulse Height (0-10Volts) Analog Data Time(useconds) SS FL1 FL2 FL3

výsledky ovlivn ny zne išt ním a technickým stavem p

19 ení trombocyt na analyzátoru SYSMEX XE-2100 U analyzátor využívající pr tokové cytometrie mohou být výsledky ovlivn ny zne išt ním a technickým stavem p ístroje a ítomnosti jiných krevních element jedná se o metodu nep ímou.

20 Stanovení trombocyt opticky 4,5 l vzorku je na ed no 895,5 l Ret Search (II) diulentem vzorek je injektován do RET reak ního kanálu, kde je ke vzorku p idáno 18 l barva, která proniká p es membránu do bun k a barví RNA retikulocyt a DNA/RNA v jaderných bu kách (reagencie Ret Search (II) dye) po 31 vte inách dochází k obarvení vzorku vzorek je analyzován metodou pr tokové cytometrie za použití semikonduktorového laseru Vyhodnocení zm ené výsledky jsou zobrazeny pro jednotlivé parametry na displeji ístroje a na monitoru po íta e analyzátor podává p esné informace i o po tech erytrocyt a leukocyt

Podobné dokumenty

Principy a instrumentace

Průtoková cytometrie Principy a instrumentace Ing. Antonín Hlaváček Úvod Průtoková cytometrie je moderní laboratorní metoda měření a analýza fyzikálních -chemických vlastností buňky během průchodu laserovým