4. Imunopatologie diagnostika a klinické aspekty

Transkript

1 4. Imunopatologie diagnostika a klinické aspekty 4/47 DETEKCE SUBPOPULACÍ INTRAEPITELIÁLNÍCH T-LYMFOCYTŮ V NÁDOROVÉ TKÁNI PACIENTEK S KARCINOMEM OVARIA Fialová A., Hromádková H., Brtnický T., Rob L., Bartůňková J., Špíšek R. Ústav imunologie, UK. LF a FN Motol v Praze Gynekologicko-porodnická klinika UK. LF a FN Motol Karcinom ovaria je každoročně diagnostikován u více než evropských žen a z gynekologických malignit má nejvyšší úmrtnost. Vzhledem k rychlému rozvoji nemoci a absenci senzitivních a specifických markerů je u 70 % pacientek diagnostikován karcinom ovaria ve stádiu rozvinuté diseminované nemoci s velmi nepříznivou prognózou. Standardní léčba zahrnuje chirurgické odstranění nádoru s následnou chemoterapií. U více než 80 % karcinomů ovaria se daří zredukovat množství nádorových buněk, nicméně perzistence malého množství buněk rezistentních k chemoterapii (minimální reziduální nemoc) vede u většiny pacientek během 5 let k recidivě, která bývá fatální. Pro zlepšení prognózy pacientek je třeba vyvinout terapeutické postupy, které by doplňovaly standardní léčbu a snížily riziko recidivy. Vzhledem k tomu, že imunitní systém hraje klíčovou úlohu v patogenezi nádorů a je schopný za určitých okolností nádor eliminovat, mohla by výrazně přispět k potlačení minimální reziduální nemoci imunoterapie. Pro vývoj účinných imunoterapeutických protokolů je důležité porozumění biologii imunitní odpovědi proti nádorovým buňkám a popsání mechanismů, které jsou pro eradikaci nádorových buněk klíčové. V našem projektu jsme porovnávali zastoupení jednotlivých subpopulací T-lymfocytů v nádorové tkáni a periferní krvi pacientek s nově diagnostikovaným karcinomem ovaria. Mezi T-lymfocyty infiltrujícími nádorovou tkáň bylo ve srovnání s periferní krví výrazně vyšší procento Th7-lymfocytů a CD4+CD5+FoxP+ regulačních T-lymfocytů. Procentuální zastoupení Th7-lymfocytů v nádoru negativně korelovalo s klinickým stádiem nemoci, pacientky s nižším rozsahem onemocnění měly vysoký počet Th7-lymfocytů. U regulačních T-lymfocytů byla korelace naopak pozitivní, jejich počet výrazně narůstal s rozsahem nádorového postižení. Naše výsledky tak ukazují, že při rozvoji nádorového onemocnění dochází v nádorové tkáni k akumulaci regulačních T-lymfocytů na úkor efektorových T-buněk a tedy k rozvoji výrazně supresivního mikroprostředí. Pro účinnou imunoterapii tak bude nutné kombinovat aktivaci specifické imunitní odpovědi s eliminací imunosupresivních faktorů. 4/48 ANTRACYKLINY INDUKUJÍ IMMUNOGENNÍ BUNĚČ- NOU SMRT U AKUTNÍ LYMFOBLASTICKÉ LEUKÉMIE Fučíková J., Budinský V., Králíková P., Bartůňková J., Špíšek R. Ústav imunologie, UK. LF a FN Motol v Praze Buněčná smrt indukovaná antracykliny je považována v současné době za imunogenní typ buněčné smrti. Imunogenní buněčná smrt je charakterizována povrchovou expresí molekul teplotního šoku heat shock protein 70 a 90 a calreticulinu. Tyto molekuly exprimované na povrchu nádorových buněk jsou následně schopné aktivovat dendritické bunky, které následně aktivují antigen-specifickou imunitní odpověď. V pozdních fázích imunogenní buněčné smrti je z jádra uvolňován protein High mobility group box (HMGB), který se váže na Toll-like receptor 4 (TLR4) a také zvyšuje prezentaci nádorových antigenů na dendritických buňkách. Všechny dosavadní studie, sledující imunogenní buněčnou smrt, byly provedeny na myších modelech. V naší práci sledujeme schopnost různých chemoterapeutik, včetně antracyklinů, indukovat imunogenní buněčnou smrt na třech nádorových liniích ovariální, prostatické a akutní lymfoblastické leukémii a na primárních buňkách pacientů s nádorem ovária, prostaty a na leukemických blastech. Pouze nádorové buňky ošetřené antracykliny jsou schopné vyvolat zvýšenou protinádorovou imunitní odpověď. Antracykliny indukují translokaci calreticulinu, hsp70 a 90 na buněčný povrch a uvolnění molekuly HMGB po hodinové expozici chemoterapeutiku, jak jsme dokázali pomocí cytometrie, konfokálního mikroskopu a metody western blot. Ke studiu mechanismů interakce dendritických buněk pulzovaných nádorovými buňkami s autologními lymfocyty byla použita nádorová linie REH (ALL). Dendritické buňky inkubované s nádorovými buňkami, které byly zabity imunogenní buněčnou smrtí, mají vyšší expresi aktivačních molekul, aktivují nádorově specifické T-lymfocyty a potlačují vznik inhibičních regulačních T-lymfocytů. Tato data prokazují, že léčiva ze skupiny antracyklinů indukují i u lidských nádorových buněk imunogenní buněčnou smrt a naznačují možnou strategii immunogenní chemoterapie u pacientů s ALL. Podpora: VZ MSM , GAČR 0/08/088, GAUK /49 IgA NEFROPATIE NORMÁLNÍ A PATOLOGICKÁ CESTA BIOSYNTÉZY IgA Horynová M.,, Takahashi K., Hall S., Renfrow M. B., Weigl E., Novák J., Raška M., Ústav imunologie, Lékařská fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci, Olomouc, ČR Department of Microbiology and Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, USA IgA nefropatie (IgAN) je autoimunitní onemocnění charakterizované ukládáním imunokomplexů (IK) IgA-IgG v glomerulárním mezangiu. IK jsou tvořeny polymerními IgA molekulami, které mají neúplné řetězce O-vázaných glykanů v pantové oblasti jejich těžkých řetězců. Pantová oblast IgA obsahuje 0-mer se čtyřmi Thr a pěti Ser tvořící potenciální místa pro O-glykosylaci, ale obvykle je jen až 6 míst obsazených. Řetězce O-vázaných glykanů na IgA jsou postupně syntetizovány nejprve připojením N-acetylgalaktosaminu (GalNAc) na Ser nebo Thr pomocí N-acetylgalaktosaminyl-transferázy (GalNAc-T). O-glykanový řetězec je dále prodloužen připojením galaktosy (Gal) na GalNAc pomocí core β,-galaktosyltransferázy (CGalT), jejíž stabilita závisí na CGalT-specifickém molekulovém chaperonu (Cosmc). Nakonec je pomocí α,6-sialytransferázy II (ST6GalNAc II) připojena sialová kyselina (SA) na GalNAc Alergie, Supplementum /00 8

2 nebo pomocí α,-sialytransferázy na galaktózu. U IgAN dochází k abnormální glykosylaci pantové oblasti IgA charakteristické sníženým množstvím Gal a vazbou SA na koncový GalNAc. Abnormální glykosylace je příčinou vazby některých přirozených protilátek (IgG, IgA), které se zde uplatňují jako autoprotilátky. Hlavním cílem této práce byla produkce rekombinantních enzymaticky aktivních lidských glykosyltransferáz GalNAc-T, CGalT, Cosmc, ST6GalNAc I a II pomocí Bakulovirového expresního systému (BES). Expresní kazeta kódující vlastní protein byla vnesena do bakulovirového vektoru, kterým byly transfekovány hmyzí buňky Sf9. Nově vytvořený rekombinantní virus dále zajišťuje produkci rekombinantního proteinu. Sekvence každého proteinu byla zkrácena o transmembránovou doménu a místo ní byla na N-konec proteinu vnesena sekretorní signalizační sekvence z lehkého řetězce myšího imunoglobulinu kappa a na C-konec vnesena krátká His tag značka umožňující afinitní purifikaci proteinu. Produkce GalNAc-T, CGalT, Cosmc, ST6GalNAc I a II byla optimalizována a rekombinantní proteiny byly izolovány pomocí afinitní NiNTA chromatografie. Proteiny byly identifikovány pomocí SDS PAGE a western blotování. Aminokyselinová sekvence některých rekombinantních proteinů byla potvrzena pomocí hmotnostní spektrometrie. Optimalizace podmínek exprese GalNAc-T umožnila izolovat protein v množství dostatečném pro následující biochemické analýzy. Aktivita GalNAc-T byla měřena průkazem připojení GalNAc na akceptorový syntetický peptid odpovídající pantové oblasti IgA. Jako donor GalNAc byl použit UDP-GalNAc. Využitím BES bylo dosaženo výtěžku 5 mg aktivního GalNAc-T proteinu z litru kultury. Izolace rekombinantních glykosyltransferáz umožňuje modelovat in vitro průběh glykosylace IgA a přispět tak k poznání molekulární podstaty tvorby abnormálně glykosylovaného IgA u IgAN. Tato práce vznikla za podpory grantu GAČR P0/0/055 a grantu z NIH DK07844, DK0875, DK0800, a DK /50 IZOLACE A CHARAKTERIZACE NÁDOROVÝCH BU- NĚK U PACIENTEK S KARCINOMEM OVARIA Hromádková H., Brtnický T., Rob L., Bartůňková J., Špíšek R., Rožková D. Ústav imunologie, UK. LF a FN Motol, Praha Gynekologicko-porodnická klinika, UK. LF a FN Motol, Praha Úvod: Karcinom ovaria je čtvrté nejčastější maligní onemocnění u českých žen. Z maligních gynekologických onemocnění má karcinom ovaria nejvyšší úmrtnost. Chirurgické odstranění nádoru a následná chemoterapie a /nebo radioterapie je standardním přístupem v léčbě ovariálního karcinomu. Nemoc je většinou diagnostikována v pokročilém stádiu, kdy je pravděpodobnost relapsu po úspěšné chemoterapii až 90 %. Imunoterapie podávaná ve stádiu minimální reziduální nemoci po chirurgickém zákroku a chemoterapii by mohla zlepšit prognózu tohoto onemocnění. Vypracovali jsme postupy pro přípravu vakcíny založené na dendritických buňkách (DC) pulzovaných apoptotickými nádorovými buňkami. Postup je však potřeba dále optimalizovat především získávání nádorových buněk a charakterizaci exprese nádorových antigenů. Cíl: Izolace nádorových buněk karcinomu ovaria a jejich charakterizace metodou kvantitativní PCR. Pacienti a metody: Optimalizovali jsme metodu izolace nádorových buněk z karcinomu ovaria pomocí disociátoru a enzymu Dispáza II. Izolovali jsme nádorové buňky z karcinomu ovaria 7 pacientek. Změřili jsme expresi 4 nádorových antigenů (Her- /neu, FBP, CA5 a MAGE-A) metodou kvantitativní PCR u 4 nádorových linií (OV-90, SK-OV-, OVCAR- a TOV-G) a buněk izolovaných z nádorů pacientek. Výsledky: Pro výrobu imunoterapeutické vakcíny je potřeba nejméně 0 06 nádorových buněk. Pro získání tohoto počtu by bylo potřeba v průměru litr ascitu. Oproti tomu z nádorové tkáně při použití disociatoru a Dispázy II jsme získali dostatečné množství buněk u 7 z 9 pacientek. Protein Her-/neu byl výrazně overexprimován na úrovni mrna jen u nádorové linie SK-OV-. Zvýšená exprese (minimálně 0 oproti kontrolním PBMC od zdravých dárců) byla u 55 % pacientek. Molekula CA-5 byla výrazně overexprimována u všech pacientek (více než 000 ), avšak jen u nádorové linie OVCAR-. MAGE-A byl nejvíce exprimován nádorovou linií OV-90, z ostatních linií dochází k overexpresi jen u linie SK-OV- (00 ). MAGE-A byl overexprimován u pacientek více než 00. Protein FBP byl overexprimován u všech vzorků, kromě pacientky, minimálně 00. U většiny vzorků byla exprese zvýšena více než 000. Závěr: Optimalizovali jsme metodu izolace nádorových buněk od pacientek s karcinomem ovaria. Získané množství je postačující k další charakterizaci, popř. použítí v protokolu pro výrobu imunoterapeutické vakcíny. Znalost expresního profilu nádorových buněk pacientek dovoluje individualizovanou přípravu protinádorové vakcíny. Práce byla podpořena VZ MŠMT MSM00608, grantem GAČR 0/08/088 a grantem GAUK /5 VPLYV OBEZITY NA IMUNITNÚ ODPOVEĎ Jahnová E., Horváthová M., Pružincová V., Nemessányi T., Tulinská J., Volkovová K., Dušinská M. Slovenská zdravotnícka univerzita v Bratislave, SR Obezita vplýva na reguláciu imunitnej a zápalovej odpovede, je asociovaná so zmenami hodnôt leukocytov, subpopulácii lymfocytov, cytokínov a zápalových markerov všeobecne. Epidemiologické dáta dokazujú vzťah medzi chronickým subklinickým zápalom a telesnou hmotnosťou. Zvýšené hodnoty zápalových markerov môžu súvisieť so zvýšeným BMI a predikovať rozvoj niektorých ochorení, napr. diabetes mellitus, hypertenziu, ale aj karcinogénne ochorenia. Parametre humorálnej a bunkovej imunity sme sledovali u 90 dobrovoľníkov v piatich skupinách.. s normálnou hmotnosťou (BMI 9,00 4,99). nadhmotnosťou (BMI 5,00 9,99). obezitou (BMI 0,00 9,99) 4. monštruóznou obezitou (BMI 40,00) a 5. podváhou (BMI < 9). Štatisticky signifikantné rozdiely sme zistili u CRP, C, C4, E-selektínu, leptínu, ktorých hodnoty boli v porovnaní s osobami s normálnou hmotnosťou vyššie u osôb s nadhmotnosťou, obezitou, morbídnou obezitou, u IL-6 len v porovnaní s obezitou a morbídnou obezitou. Hodnoty adiponektínu boli u osôb s nadhmotnosťou, obezitou, morbídnou obezitou signifikantne nižšie v porovnaní s normálnou hmotnosťou, naopak boli nad hranicou normy u osôb s podhmotnosťou. Nezistili sme rozdiely medzi hodnotami IgG, IgM, IL-0, TNFα, s-icam. 8 Alergie, Supplementum /00

3 U dobrovoľníkov s nadhmotnosťou a obezitou sme zaznamenali zvýšené percento CD9+ a zníženie NK buniek v porovnaní s jedincami s normálnou hmotnosťou. Adhezívna molekula ICAM- bola signifikantne zvýšená v skupine jedincov s monštruóznou obezitou na granulocytoch, u jedincov s obezitou bola naopak znížená na lymfocytoch. Dobrovoľníci s nadhmotnosťou mali nižšiu expresiu CDc na lymfocytoch ako skupina s normálnou hmotnosťou. Muži mali vyšší počet CD8+ buniek ako ženy, expresia ICAM- na monocytoch bola u žien signifikantne vyššia. Naše pozorovania poukazujú na modulačné zmeny súvisiace s výskytom obezity v populácii, ktoré ovplyvňujú reguláciu imunitnej a zápalovej odpovede. Nami pozorované zmeny v imunitnom systéme sú podobné tým, ktoré nachádzame u ľudí s chronickou aktiváciou imunitného systému. 4/5 REPRODUKČNÍ IMUNOLOGIE VYUŽITÍ VYBRANÝCH LABORATORNÍCH PARAMETRŮ V KLINICKÉ PRAXI Janatková I., Horká P., Procházková I., Malíčková K. Laboratoř klinické imunologie a alergologie ÚKBLD VFN a. LF UK, Praha Imunologická laboratorní vyšetření se v posledním desetiletí stala nedílnou součástí vyšetřovacího algoritmu u neplodných párů (Návrh doporučení pro stanovení parametrů protilátkové a buněčné imunity u žen a mužů s poruchami plodnosti viz Předkládaná práce hodnotí použití imunologických laboratorních metod u souboru pacientek s poruchami plodnosti. Zajímalo nás, jak výsledky imunologických vyšetření ovlivní terapeutickou úvahu a především úspěšnost terapie. V období leden prosinec 009 bylo v Laboratoři klinické imunologie a alergologie ÚKBLD VFN a. LF UK vyšetřeno 99 pacientek s podezřením na imunologickou příčinu poruch plodnosti. Jednalo se o první vyšetření reprodukčního souboru parametrů protilátkové i buněčné imunity (součástí předkládané analýzy tedy nejsou kontrolní vyšetření). U těchto nemocných jsme dle indikace klinika provedli mj. tato stanovení: sérové protilátky proti fosfolipidům (APLA), proti spermiím (ASA), zona pellucida (AZP), ovariím (AOVA), annexinu V (AANXV), vyšetření protilátek proti tkáňové transglutamináze (ATTA) a intracelulární produkce embryotoxických cytokinů (IC). U 5 (8 %) pacientek ze souboru byla prokázána možná imunologická příčina neplodnosti. Výskyt vybraných pozitivních nálezů ve vyšetřeném souboru byl následující: ASA %, AZP,5 %, AOVA %, APLA 7 %, AANXV, %, ATTA 0 % a vysoká i.c. produkce TNFalfa 5 %. Z ročního sledování celkové i imunointervenční terapie a dalšího vývoje zdravotního stavu těchto pacientek vyplývá, že po léčbě otěhotnělo event. již porodilo 8 % žen s pozitivitou ASA, 40 % žen AZP+, 0 % žen AOVA+, 80 % žen s pozitivitou AANXV, 4 % žen s pozitivitou APLA, 7 % ATTA+ pacientek a 4 % pacientek s původně vysokou i.c. produkcí embryotoxických cytokinů. Z našeho sledování vyplývá, že u pacientek s poruchami reprodukce je nutná včasná a správná indikace imunologického vyšetření a následně adekvátní terapie. Indikace a interpretace imunologických vyšetření patří do rukou odborníků z oblasti reprodukční imunologie nebo reprodukční medicíny. 4/5 KALPROTEKTIN U PACIENTŮ S AUTOIMUNNÍMI VAS- KULITIDAMI Jarešová M., Pagáčová L., Kica O., Stříž I. IKEM, Praha Autoimunní vaskulitidy jsou provázeny přítomností autoprotilátek namířených proti cytoplazmatickým antigenům neutrofilů. Vazbou autoprotilátek s antigeny neutrofilů dojde k aktivaci komplementu a tím pak k zánětu. Kalprotektin (MRP8/4, S00A8/ A9, 7E0) je protein, který váže zinek a vápník a který tvoří více než polovinu proteinů v neutrofilech. Protože byl kalprotektin detekován v akutní fázi zánětlivých reakcí u různých onemocnění, zajímalo nás, jaké jsou hladiny kalprotektinu u ANCA pozitivních pacientů ve srovnání se zdravou populací. Celkem bylo testováno 9 ANCA pozitivních sér pacientů hospitalizovaných v našem institutu. Za zdravou populaci byli považováni dárci kostní dřeně a dárci trombocytů, kterých bylo 40. ANCA byla vyšetřovaná nepřímou imunofluorescencí (The Binding Site, UK) a ELISA testem (The Binding Site, UK), kalprotektin byl stanoven ELISA testem (r-biopharm, Německo). Hladiny kalprotektinu byly výrazně vyšší u ANCA pozitivních pacientů než u zdravé populace (P < 0,005). Ještě výraznější rozdíl byl mezi zdravými jedinci a pacienty s diagnózou Wegenerova granulomatóza (P < 0,00) a pacienty s rychle progredující glomerulonefritidou (P < 0,00). U pacientů s primární sklerotizující cholangoitidou nebyl rozdíl se zdravou populací již tak výrazný, i když byl statisticky významný (P < 0,0). Nebyl nalezen statisticky významný rozdíl mezi zdravou populací a pacienty s ulcerózní kolitidou. Z našich výsledků lze usuzovat, že hodnoty kalprotektinu můžou mít vztah k patofyziologií ANCA protilátek na neutrofily u autoimunních onemocnění. 4/54 AUTOIMUNITNÍ PORUCHY PLODNOSTI MUŽŮ A ŽEN Madar J., Kestlerová A., Kadkalenko N., Šůla K., Urbánek V., Nouza K. Pracoviště reprodukční imunologie, Ústav pro péči o matku a dítě, Praha-Podolí Sexuologický ústav. LF UK a VFN, Praha Nové Město Centrum klinické imunologie, Praha Staré Město Podíl imunopatologických mechanismů na selhání reprodukčních funkcí u lidí je sledován již řadu let a zejména v poslední době se dostává do centra pozornosti lékařů zabývajících se reprodukční medicínou. Sledované imunologické relace jsou jednak alogenní (matka-spermie, matka-embryo), jednak autologní (autoimunita). Autoimunita může ovlivnit plodnost jednak nepřímo (systémové nebo orgánové autoimunitní onemocnění snižuje fertilitu ženy zhoršením jejího zdravotního stavu), jednak přímo (autoimunita napadá a poškozuje strukturu a/nebo funkci reprodukčních orgánů muže nebo ženy nebo jejich konečné produkty spermie či vajíčka, případně v graviditě napadá a poškozuje mateřskou část placenty). U mužů (78 normozoospermiků a 445 mužů s patologickým spermiogramem podle kritérií WHO) jsme sledovali jednak výskyt na spermie navázaných autoprotilátek (ASA) IgG a IgA třídy, jednak intenzitu spermiemi indukované buněčné imunity (BI). Stanovení ASA bylo prováděno testem MAR firmy FertiPro, stanovení BI pak testem inhibice migrace leukocytů pod agarózou (Dimit- Alergie, Supplementum /00 8

4 rov et al., J. Immunol. Methods 54,99, 47-5). ASA vázané na spermie se vyskytovaly ve všech sledovaných podskupinách včetně normozoospermiků, statisticky významné rozdíly nebyly nalezeny. Spermiemi indukovaná BI se statisticky významně častěji vyskytovala u mužů s patologickým spermiogramem, zejména u astenozoospermií, což svědčí pro patogenetickou roli stimulované BI v poruchách spermiogeneze. V souboru žen trpících opakovanými těhotenskými ztrátami jsme sledovali výskyt protilátek proti kardiolipinům (ACLA) ve třídách IgG a IgM. Ve srovnání se skupinou plodných žen (46 žen, které porodily zdravé dítě a nikdy nepotratily) byl výskyt ACLA u žen trpících těhotenskými ztrátami ve. trimestru (n = 45) výrazně častější. Rovněž ženy, které opakovaně potratily v. trimestru (n = 65), vykazovaly signifikantně častější pozitivitu ACLA. V souboru žen léčených pro primární sterilitu metodou IVF-ET byl ve skupině opakovaně neúspěšných pokusů (50 žen) signifikantně vyšší výskyt ACLA ve srovnání s ženami, kde byla léčba úspěšná ( žen). Do studie nebyli zařazeni pacienti s klinickými příznaky autoimunitního onemocnění. Závěr: V případě párů léčených pro poruchu plodnosti je i u mužů s normálním nativním spermiogramem vhodné sledovat výskyt na spermie vázaných autoprotilátek proti spermiím a u žen přítomnost autoprotilátek proti kardiolipinům. 4/55 ENTEROBACTER SAKAZAKII, NEBEZPEČNÝ PATOGEN PRO NOVOROZENCE A KOJENCE Matoušková I., Holý O. Ústav preventivního lékařství LF UP, Olomouc Enterobacter sakazakii byl až do roku 980 označován jako žlutě pigmentovaný Enterobacter cloacae. Brenner et al. v roce 977 poprvé použili názvu Enterobacter sakazakii. Návrh změn byl založen na rozdílech mezi E. cloacae a E. sakazakii v hybridizaci DNA-DNA, biochemických reakcích, produkci pigmentu a citlivosti na antibiotika. Od roku 007 je E. sakzakii uváděn jako rod Cronobacter spp., který zahrnuje 6 bioskupin. Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) patří do čeledi Enterobacteriaceae. Jedná se o fakultativně anaerobní, pohyblivou (peritricha) gramnegativní bakterii, která netvoří spóry. Teplotní rozmezí růstu je 6 45 C, optimum 7 4 C, některé kmeny rostou při 47 C a slabě při lednicové teplotě. Dobře je dokumentována jeho tepelná tolerance v rehydratované dětské mléčné výživě. Dobře snáší nízké ph (,9 4,) kultivačního média při teplotě 7 C. Rovněž je prokázána jeho schopnost tvorby biofilmu na různých površích a následně zvýšená odolnost vůči čisticím a dezinfekčním prostředkům. Jedná se o ubikvitérní organismus, jehož izolace byla spojována s kontaminovanou dětskou výživou (mlékem) a nápoji pro novorozence, kojenece a malé děti téměř na všech kontinentech. K její kontaminaci může docházet již na úrovni prvotních neopracovaných surovin, při průmyslové výrobě nebo při přípravě používaných lahví. Tato oportunní bakterie vyvolává především život ohrožující infekce novorozenců a kojenců. Jedná se o meningitidy, mozkové abscesy, sepse a nekrotizující enterokolitidy. První dva terminální případy neonatální meningitidy, způsobené žlutě pigmentovanými koloniemi Enterobacter cloacae, byly popsány již v roce 96 ve Velké Británii, přičemž oba novorozenci zemřeli. Vznik nekrotizující enterokolitidy bývá spojen s chirurgickým zákrokem na gastrointestinálním traktu novorozenců, mortalita bývá uváděna %. Friedmann v přehledném článku analyzuje problematiku novorozeneckých infekcí vyvolaných kmenem Cronobacter (Enterobacter sakazakii) v evropských zemích a USA. Upozorňuje na skutečnost, že tento kmen je izolován nejen z mléčné stravy pro novorozence a kojence, ale také z prostředí zdravotnických zařízení (inkubátory, stetoskopy, kontaminované infúze atd.). Za rizikové faktory pro lidské novorozence je považována nízká porodní hmotnost (< 500 g), nezralost (< 8 týdnů). Vždy je zdůrazňována nevyzrálost imunitního systému novorozenců a kojenců. V článcích z roku 00 je upozorňováno na možnou roli O-polysacharidu izolovaného z Cronobacter (Enterobacter sakazakii) v patogenezi těchto infekcí. Účinky O-polysacharidu jsou ověřovány ve zvířecím modelu. Infekce vyvolané Enterobacter sakazakii u dospělých jedinců jsou v odborné litaratuře uváděné nejčastěji jako kazuistiky. Jedná se o imunosuprimované pacienty nebo rizikové faktory pro vznik infekce nejsou známé. Infekce vyvolané patogenní bakterií Cronobacter (Enterobacter sakazakii) jsou stále závažným problémem na novorozeneckých jednotkách intenzívní péče. 4/56 PRIRODZENÁ A POSTVAKCINAČNÁ PROTILÁTKOVÁ IMUNITNÁ ODPOVEĎ DETÍ EXPONOVANÝCH POLY- CHLOROVANÝMI BIFENYLMI Nemessányi T., Jahnová E., Szabová M., Horváthová M., Palkovičová Ľ., Jusko T., Trnovec T., Hertz-Picciotto I. 4 Oddelenie imunológie a imunotoxikológie Oddelenie environmentálnej medicíny Oddelenie toxických organických polutantov, Slovenská zdravotnícka univerzita, Bratislava, SR 4 Division of Epidemiology, Department of Public Health Sciences, University of California, Davis, California, USA Polychlorované bifenyly (PCB) pôsobia ako vývojové a imunologické toxikanty v prenatálnej expozícii v experimente. Je uvádzaná asociácia so zvýšeným výskytom detskej chorobnosti najmä respiračných infekcií a zápaly stredného ucha. Existuje viacero príkladov, že environmentálna expozícia môže zapríčiniť dysfunkciu imunitného systému, alebo cielenú imunosupresiu naprieč populáciou a možno aj imunodeficienciu postihnutej populácie. Vývojové a imunologické toxikanty v prenatálnej expozícii môžu spôsobiť dysreguláciu imunitného systému a zvýšený výskyt alergických a autoimunitných ochorení. Práca nadväzuje na medzinárodnú spoluprácu v riešení problematiky expozície PCBs na východnom Slovensku. Protilátkovú odpoveď sme zisťovali v sére detí (n = 88), po 6 mesiacoch od narodenia z regiónu východného Slovenska (Michalovce, Svidník, Stropkov), kde boli namerané zvýšené hladiny PCB. Sledovali sme hladiny imunoglobulínov a špecifické protilátky po vakcinácii tetanus toxoid, diphtheria toxoid, haemophilus influenza a zisťovali sme hladiny protilátok bez vakcinácie k pneumokokovému kapsulárnemu polysacharidovému antigénu (PCP). Z analyzovaných vzoriek môžeme zatiaľ konštatovať, že u 6mesačných detí sme zistili nižšie hladiny IgA. Až 4 % detí v súbore malo vo veku 6 mesiacov zníženú hladinu IgA, v priemere 84 Alergie, Supplementum /00

5 nezmenené hladiny IgG a 6 % detí malo zvýšené hladiny IgM. Priemerné hladiny IgE v skupine boli zvýšené, ale u 7 % detí sme zaznamenali vysoké hladiny IgE. Z doterajších analýz sme nezistili významnú koleráciu s celkovými nameranými hladinami PCB. Špecifické protilátky proti postvakcinačným antigénom, ako tetanus toxoid a diphtheria toxoid predstavujú protilátky proti antigénom závislym na týmuse. Tvorba takýchto protilátok je závislá na prezentácii antigénu, funkcii T- a B-lymfocytov. Tvorba protilátok proti haemophilus influenza a pneumokokovému kapsularnému polysacharidovému antigénu (PCP) je na týmuse nezávilá a odpoveď je predovšetkým v triede IgG. Meranie týchto protilátok je relevantný nástroj, ktorý reflektuje účinnosť imunitného systému vo vzťahu k infekcii. Priemerné hodnoty uvedených protilátok u sledovanej skupiny boli nad minimálnou ochrannou hladinou. Najväčšie percento detí, nedosahovalo minimálnu ochrannú hladinu u protilátok proti diphtherii. Korelácie s celkovými hladinami PCB neboli významné, čo nevylučuje významnosť korelácií s jednotlivými druhmi PCB. U detí sme zaznamenali aj protilátky proti pneumokokovému kapsularnému polysacharidovému antigénu bez vakcinácie. Expozícia PCB ovplyvňuje nezrelý imunitný systém a s vekom sa môže vplyv ešte viac prejaviť a modifikovať aj ďalšími faktormi prostredia. Práca je podporovaná grantom MZ SR č.005/- SZU /57 IMUNOMODULAČNÉ ÚČINKY OLOVA A PRODUKCIA CYTOKÍNOV V PLACENTE Patayová H., Palkovičová Ľ., Ursínyová M., Rausová K., Reichrtová E., Saunders M. Slovenská zdravotnícka univerzita, Bratislava, SR University of Bristol, Bristol, UK Úvod: Dôležitým obdobím v procese alergickej senzibilizácie je intrauterinný vývoj plodu ako aj environmentálna expozícia v postnatálnom období. Matka, okrem genetického faktora, predstavuje počas tehotenstva pre vyvíjajúci sa plod aj environmentálne prostredie. Environmentálnu expozíciu matky čiastočne odráža koncentrácia cudzorodých látok xenobiotík v placente. Placenta nepredstavuje pre prestup xenobiotík do plodu neprekonateľnú bariéru, väčšina prechádza aspoň do určitej miery do krvného obehu plodu, kde môžu ovplyvniť jeho vývoj aj smerom k intrauterínnej senzibilizácii s možnou manifestáciou alergie v postnatálnom období. Trofoblastové bunky placenty sú významným miestom tvorby cytokínov, dôležitých pre úspešný priebeh tehotenstva. V tehotenstve je imunologické prostredie placenty charakterizované dominanciou cytokínov Th. Redukcia sekrécie IFNγ a posilnenie produkcie IL-4 môžu byť spojené so zvýšeným rizikom vzniku alergického ochorenia. Olovo (Pb) predstavuje toxický kov, ktorý nemá v ľudskom organizme žiadnu fyziologickú funkciu. Takmer 90 % Pb prechádza placentou do krvného obehu plodu. Cieľom našej štúdie bolo zistiť či rozdielna koncentrácia Pb v placente môže ovplyvniť produkciu Th, Th cytokínov trofoblastovými bunkami, a tak prispieť k vzniku alergického ochorenia. Metódy: Nábor matiek a zber vzoriek prebiehal na pôrodníckych oddeleniach v regiónoch Bratislava (SR; N = 8) a Bukurešť (RU; N = 85) v rokoch v rámci projektu 5RP EÚ PLUTOCRACY. Do štúdie boli zaradené matky s fyziologickým priebehom tehotenstva a pôrodom v termíne. Bezprostredne po pôrode sme izolovali trofoblastové bunky placenty podľa Klimana a kol. (999). Počet buniek bol 06 v ml kultivačného média. Bunky sme kultivovali pri teplote 7 C s atmosférou 5% CO. Supernatanty trofoblastových buniek sme odoberali po 48, 7 a 84 hodinách a následne zmrazili pri -80 C. Produkcia cytokínov IL-4, a IFNgamma trofoblastovými bunkami placenty bola stanovená v supernatantoch zbieraných po 7 hodinách kultivácie ELISA metódou (MRX revelation reader, Fi. DYNEX) s použitím Pelikine human IL-4 a IFNγ ELISA kit. Na stanovenie koncentrácie Pb v placente bola použitá metóda atómovej absorpčnej spektrofotometrie s použitím PHILIPS PU 9400X, GF-90 (AAS; Ursínyová a kol. 995). Výsledky: Vyššie koncentrácie Pb v placentách sme namerali v Bukurešti v porovnaní s Bratislavou (p < 0,00). Obdobne, medzi oboma krajinami sme zistili významný rozdiel v produkcii cytokínov IL-4 (p < 0,00) a IFNγ (p = 0,00) bunkami trofoblastu. Produkcia cytokínu IL4 v oboch regiónoch mierne klesala so stúpajúcou koncentráciou Pb v placente, avšak bez štatistickej významnosti. Na druhej strane, hladiny IFNγ (Th cytokín) mali mierne stúpajúci trend, avšak opäť bez štatistickej významnosti. Záver: Pb patrí medzi imunomodulačné toxické látky, ale v našej štúdii sme nezistili významný vzťah medzi koncentráciou Pb a produkciou Th/Th cytokínov v placente. Poďakovanie: Projekt 5 RP EÚ PLUTOCRACY QLK4- CT Literatura. Ursinyova, M., Hladikova, V. et al. (995). Determination of lead in whole blood using atomic absorption spectrometry. Chem. Listy. 89: /58 T-REGULAČNÍ LYMFOCYTY A VYBRANÉ CYTOKINO- VÉ SPEKTRUM U PACIENTŮ S BĚŽNOU VARIABILNÍ IMUNODEFICIENCÍ (CVID) Vokurková D., Králíčková P., Kondělková K., Melichar B., Rozsíval P., Řeháček V. 4 Ústav klinické imunologie a alergologie, Fakultní nemocnice v Hradci Králové, Karlova univerzita v Praze Onkologická klinika, Fakultní nemocnice Olomouc Dětská klinika, Fakultní nemocnice v Hradci Králové, Karlova univerzita v Praze 4 Transfuzní oddělení, Fakultní nemocnice v Hradci Králové, Karlova univerzita v Praze Abstrakt: Běžná variabilní imunodeficience (CVID) je klinicky nejvýzamnější primární humorální imunodeficience dospělého věku. Jedná se o heterogenní klinickou jednotku, která není spojena pouze s porušenou tvorbou protilátek, avšak i komplexní dysregulací imunitního systému vedoucí k řadě neinfekčních komplikací. Cíl práce: Porovnat množství T-regulačních lymfocytů a spektrum dalších vybraných cytokinů (IL-, IL-4, IL-6, IL-0, TNF, IFN-γ a IL7A) u pacientů s CVID (s přihlédnutím k rozdílům v rámci Freiburgské klasifikace) se skupinou zdravých osob. Soubor: pacientů s CVID, z toho 6 pacientů ze skupiny Ia, 8 ze skupiny Ib a 8 ze skupiny II dle Freiburgské klasifikace (věk 47, ± 6,). Kontrolní soubor tvořilo 5 zdravých dárců stejného věkového rozložení. Metodika: Pomocí průtokového cytometru jsme v daném souboru stanovili množství CD+CD4+CD5+FoxP+ Alergie, Supplementum /00 85

6 a CD+CD8+CD5+FoxP+ T-lymfocyty. Na měření cytokinů jsme použili firemní kit Human Th/Th/Th7 Cytokine Kit metodou Bead Array. Výsledky: Byl zjištěn statisticky významný rozdíl v počtu Treg FoxP+CD4+ mezi pacienty skupiny Ib a II (P = 0,0449) a v počtu FoxP+CD8+ mezi pacienty skupiny Ia a Ib (P = 0,076) a skupiny Ia a II (P = 0,046). Signifikantní statistické rozdíly nebyly nalezeny v porovnání daných buněčných subpopulací se zdravými kontrolami, stejně tak jako při statistickém porovnání sledovaného spektra cytokinů (vč. IL-7A) v rámci jednotlivých podskupin, či v porovnání se zdravými kontrolami. Diskuse a závěr: Jednalo se o pilotní projekt, který se pokusil přispět k dalšímu ozřejmění dysregulací imunitního systému u nemocných s CVID. Podporováno výzkumným záměrem MZ /59 SLEDOVÁNÍ VLIVU NANOČÁSTIC STŘÍBRA NA VIABI- LITU BAKTERIÍ A FUNKCI FAGOCYTŮ Žákovská A., Dušková M., Kavanová L., Krejčí K., Hubinka V., Panáček A. Oddělení fyziologie živočichů a imunologie, Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity, Brno Oddělení fyzikální chemie, Přírodovědecká fakulta Palackého univerzity, Olomouc Mikrobicidní vlastnosti stříbra jsou známy již od starověku. Většího využití dosáhl tento kov v období před rozšířením antibiotik. V současné době dochází ke zvýšení zájmu o stříbro z důvodů zvyšující se rezistence mikroorganismů k antibiotikům, dále se stříbro využívá pro úpravu vody, desinfekci povrchů apod. Zajímavé možnosti nabízí použití stříbra v tzv. nanotechnologiích, kdy lze využít unikátní chemické, fyzikální i biologické vlastnosti částic. Nanočástice dosahují velikosti do 00 nm a v případě stříbra obsahují atomů tohoto kovu. V literatuře je řada dokladů o baktericidních vlastnostech nanočástic stříbra, objevují se však také údaje o jejich inhibičním až toxickém působení na různé eukaryotické buňky, včetně buněk imunitního systému. V práci byl sledován vliv vybraných koncentrací koloidního stříbra na viabilitu bakterií a dále na funkce fagocytů in vitro. Cílem bylo ověřit, zda koncentrace, které vykazují baktericidní působení, nejsou zároveň toxické nebo inhibiční pro buňky nespecifické imunity. K tomuto účelu byly použity postupy: a) detekce baktericidního působení Chemiluminiscenční metodou byl sledován inhibiční účinek dvou různě připravených nanočástic stříbra (a) fyzikálně a (b) chemicky na patogenní bakterie Escherichia coli s plazmidem (KpGFplux Bamp) vyznačující se schopností luminiscence. Koloidní stříbro bylo ke vzorkům přidáváno v okamžiku začátku měření. ID50 u chemicky připraveného Ag+ bez kaseinu (stabilizační činidlo) se pohybovala v rozmezí,8,95 mg/l, s kaseinem,6,8 mg/l. Fyzikálně připravený Ag+ bez kaseinu použitý v rozmezí koncentrací 50 0,04 mg/l vykazoval ID50 při koncentracích 0,5 0,5 mg/l. Vyšší dávky u obou typů koloidů inhibovaly zcela růst bakterií. b) detekce oxidativního vzplanutí fagocytů v plné krvi in vitro: Byla použita luminolem zesílená chemiluminiscenční detekce oxidativního vzplanutí fagocytů, kde velikost chemiluminiscenčního signálu odráží míru produkce reaktivních kyslíkových radikálů a lze ji považovat za marker mikrobicidní funkce neutrofilů. Ve vzorcích byly použity mikrolitry lidské periferní plné krve, spontánní a zymosanem aktivovaná produkce reaktivních kyslíkových radikálů byla hodnocena v průběhu jedné hodiny. Fyzikálně připravené Ag+ bez kaseinu bylo ke vzorkům přidáváno v okamžiku začátku měření, v koncentračním rozmezí 50 0,04 mg/l ředěno fosfátovým pufrem. U sledovaných koncentrací koloidního stříbra nebyl pozorován žádný inhibiční vliv na fagocyty ve smyslu výrazného snížení oxidativního vzplanutí, ani u spontánní ani u aktivované chemiluminiscence. 86 Alergie, Supplementum /00