Zvyšování konkurenceschopnosti studentů oboru botanika a učitelství biologie CZ.1.07/2.2.00/

Transkript

1 Zvyšování konkurenceschopnosti studentů oboru botanika a učitelství biologie CZ.1.07/2.2.00/

2 Molekulární markery ve šlechtění rostlin Petr Smýkal Katedra botaniky, PřF UPOL

3 1. Mikrosatelitní markery 2. Retrotransposonové markery 3. Genově specifické markery SNP, CAPS, dcaps 4. Příklady použití markerů ve šlechtění rostlin 5. Využití markerů/sekvencí ve fylogenetických analýzách

4

5 Mikrosatelitní markery Typy- klasifikace (dle sekvence): Perfect / simple perfect složené z jednoho motivu (CA)n DI/TRI/TETRA CA/CCA/CCAA Simple imperfect repeats přerušený motiv (CA)n N (CA)n Compound repeats složené ze 2 a více motivů (CA)n (GA)n Interupted compound repeats přerušené, složené s mutací (CCA)n NN(GCA)n+1

6 Mikrosatelitní markery V genech - v kódujících oblastech (exonech) často Trinukleotidové - v intronech, UTR oblastech, promotorech Mezi geny - intergenerické Mechanismus vzniku Single-strand slippage (svezení) DNA polymerasy během replikace Unequal crossing over a genová konverze během DNA rekombinace Interakce mezi replikační svezením a rekombinací

7 Mikrosatelitní markery - detekce 1) PCR amplifikace Forward primer--- >>>>>> A1 A2 A3 A4 TGAATGGTGACAACACCTCTACTCAGTTCACACGTGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAGAGAGAGAGAGAGAGACGAAATTTCATCTGAACAAATGCTTCTGCAC TGAATGGTGACAACACCTCTACTCAGTTCACACGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT--GAGAGAGAGAGAGAGAGACGAAATTTCATCTGAACAAATGCTTCTGCAC TGAATGGTGACAACACCTCTACTCAGTTCACACGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAGAGAGAGAGAGAGAGACGAAATTTCATCTGAACAAATGCTTCTGCAC TGAATGGTGACAACACCTCTACTCAGTTCACACGTGTGTGTGTGTG AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACGAAATTTCATCTGAACAAATGCTTCTGCAC <<<< ---Reverse primer Nutnost znát sekvenci přilehlou k repetici tj. druhová specificita což je nejnákladnější pro vývoj nových SSR markerů pro daný druh a omezuje to následně i transferibilitu

8 Mikrosatelitní markery - detekce 1) Elektroforetická separace fragmentů (odlišení cca 8-10 bp) 2-3% NuSieve agarózový gel, 10-12% PAGE CACACACACACA A CACACA B CACACACACACACACA ---- C A B C

9 Mikrosatelitní markery automatická fragmentační analýza

10 Mikrosatelitní markery - detekce 1) Elektroforetická separace fragmentů ( ideálně 1-2 bp) sekvenační denaturační Urea-akrylamidový gel (6% PAGE) 2) Detekce barvení gelu (EtBr/UV nebo Ag/ VIS) fluorescenční značení primerů - automatizace

11 Mikrosatelitní markery odečet velikosti 1) Elektroforetická separace fragmentů Fluorescenčně značené fragmenty - odečet laserem, přesný standard

12 Mikrosatelitní markery Výhody: * vysoký polymorfismus multi-alelismus * ko-dominance (možnost detekce heterozygotního stavu, směsi) * jednoduchost aplikace metodiky * Mapovatelnost znalost pozice (lokusu) Nevýhody: * homoplasie, vysoká mutační rychlost ( na lokus a generaci) * přenos mezi druhy není zcela možný/ aplikovatelný * pro de novo vyvinutí - potřeba sekvenování, obohacené knihovny * přesnost odečtu alel

13 Mikrosatelity a stabilita

14 Genetická mapa hrachu, mikrosatelitní lokusy 2n= 14, 4000 Mbp Loridon et al. (TAG) 2005 Jing et al. (Genetics) 2005

15 Mikrosatelitní repetice Crop Nr. Nr.DNA Name P SMAD -270 PSAD-9 P SAM-14 P SAM L Dětenický žlutý velkozrnný L Klatovsky zeleny L Liblicky bastard L Milion zeleny L Milion zluty L Slovensky expres L Slovensky konservovy L Viktoria L Viktoria

16 Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) Výhody: * vysoký polymorfismus * není třeba spec. primerů * jednoduchost aplikace metodiky Nevýhody: * malá reprodukovatelnost * dominantní marker

17

18 GENOM Geny versus mobilní elementy Genomové duplikace

19 Složení eukaryotického genomu (hrách) množství repetitivních sekvencí, méně genů % repetetivní DNA, 20 40% geny + regulační sekvence

20 Retrotransposony Transposony

21 Rozdíl mezi transposony a retrotransposony Transposony cut and paste nestabilní/mobilní šíření mechanismem inzerce v daném místě četnost v genomu Retrotransposony copy and paste stabilní X 100 x 1000/ využití jako markeru nevhodné vhodné / fylogeneticky informativní

22 LTR retrotransposons Ty1-copia type Ty3-gypsy type non-ltr retrotransposons autonomous LINE non-autonomous SINE E. coli genes 4.6 Mb size Yeast Fruitfly human pea Arabidopsis Medicago Lotus maize wheat

23 Repetetivní sekvence jsou často ve shlucích Mla lokus rezistence ječmene k padlí - Weis et al. Plant Cell 2002

24 Evolutionary conserved lineage of Angela-like retrotransposons as a genome-wide microsatellite repeat dispersal agent / 1045 bp / microsatellite repeat motif Pisum_sat-arvense GTGGTTCTATAAATAGA-CCCCTTGGGTAGAAGCATTATCACTCAGACTGAAACTCAAGTAAAGACTTGGAATTTCGTT (TC) 23 ACTC ACTCAAAGC-CTTCATTCGT Pisum_elatius GTGGTTCCATAAATAGAACCC-TTGGGTAGAAGCATTGTCACTCTTTTTGTTTCT (TC) 7 GC ACTCAAAGC-CTTCATTC Pisum_abyssinicum GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCAGAAGCACAAAGTGCGGTTGCATTATTTTCGTTTTCT (TC) 8 ACTC ACTCAAAGC-CTTCAT Pisum-sativum (c4) GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCAGAAGCACAGTCGGTTGCATTCTTTTCGTTT (TC)14 ATACTCT --TCAAAGC-CTTCATTCGT Pisum_fulvum GTGGTTCTATAAATAGAGCTC-TTGTGCAGAAGCTTTGCAAGTGAATACAACACAACTGAAGAGTTGGAATTTCGTA (TC) 7 ACTCAAAGC-CTTCATTC Lotus_corniculatus GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCAGAAGCAAAAATTTGCGGTTGCATTCTTTTCGTTT (TC) 5 ACTCATC GCTCGAAGG-CTTCATTCGT Phaseolus_vulgaris GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCAGAAGCATTAAATGGCGGTTGCATTATTTTCGTTT (TC)3 AC(TC)6 AC(TC)2 --TCAAAGC-CTTCATTCGT Cicer_arietinum GTGGTTCTATAAATAGAACCCCTTGGGTAGAAGCATTGTTACTCCACAGTAACTCATGAGACAGACAACACAACTGAAGAGTTGGAATTTCGTA (TC)5 ACTCAAAAGCCTTCATTC Lupinus_angustifolius GTGGTTCTATAAATAGAACCCCTTGGGTAGAAGCATTGTAACTCATGAGAAAGAAAACACAACTGAAGAGTTGGAATTTTGTA (TC) 5 ACTCAAAAGCCTTCATTCGT Vigna_radiata GTGGTTCTATAAATAGAACCCCTTGGGTAGAAGCATTGTCACTCCATTCCACTCAGACAGAAATTCAAGTAGAGACTTGGAATTTTGTCTCC (TC)10 ACTCAAAGC-CTTCATTC Lupinus_albus GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGTAAAAGCATTGTAACAGACTTGAAATTTCGTTTCT (TC)26 TACACTCTTAC ACTCAAAG-TCTTC Glycine_max GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGTAGAAGCATTGTTACACTTGCAATTTCGTTT (TC) 22 TAC(TC) 3 TATACGTC ACTCAAAGC-CTTCATTCGT Medicago_truncatula GTGATTCTATAAATAGAACCC-TTGTGTTGAAGCATTATCAAAAGTTGTGAAACCCTAGCCGCCGC (TC) 3TAAACCTTGT(TC) 3 TGAATCTTCGTTGGAATTGG Vicia_sativa GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCTGGAGCATTTAGATCTGATGAAAATTTGGTCTTGAAATCCTAGCCATATTT (TC)2 TTAT (CT)4ACTC ACTCAAAG-CTTTC Vicia_narbonensis GTGAGTCTATAAAAGGAACCC-TTGTGCTGAAGCTTTCATCTAATGAAATTCGGTTTTGAC (TC) 6 ACTCA-AGGTTTCC Vicia_faba GTGATTCTATAAATAGATCCC-TTGTGATGAAGCATTTTCACTTGATGCAATTTCTTCTTGC (TC) 3AC(TC) 4AC(TC) 3TTTATC(TA) 3TC(TA) 4TATCTGTCC ACTCA-AGGTTTCC Lathyrus_sativus TTTGTTCTATAAATAAAACCT-TTGTGCAGAAGCATTCACTCTTGATGAAAATTTGGACTGCGAAACCCTAACCGTATT (TC)4 GC (TC)4ACTC ACCCAAAGC-CTTCA Lens_culinaris GTGGTTGTATAAATTGAACAC-TTGTGCATAAGCTAAGTTCAATTGTTGAAACCCTACTGAATTTC (TC) 3 CC (TC) 3 ACTCAAAGGCCTTCATTC Trifolium_repens GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCTGAAGCAATTCCCTTGATGAAAATTTGGTCTTGAAAGTCTTATTGC (TC) 20 ACTCAAAG-TTTTC Arachis_hypogea GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCAGAAGTATTTGTTCAGATGAAAATTTTGCTT (TC)10 ACTCAAAGC-CTTCATTCGT Senna_ meridionalis GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCAGAAGCAAAAATTGGCGGTTGCATTATTTCGTTTT (TC) 9 ACTCAAAGC-CTTCATTCGT Cassia_sp. GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCAGAAGCATTTTTGCGGTTGCATTATTTTCGTTT (TC) 9(AC) 2TC ACTCAAAGC-CTTCATTC Sophora_tomentosa GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCAGAAGCAAAAATTTGCGGTTGCATTCTTTTCGTTTTCACTCT (TC)6 ACTCAAAGC-CTTCATTCGT Schotia_afra GTAGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCAGAAACATATATAGCGTTTGCATTTCGTTT (TC) 6 ACTCAAAGC-CTTCATTCGT Erythrina_caffra GTGGTTCTATAAATAGAACTC-TTGTGCAGAAGCATTCATGGCGGTTGCATTATTTTCGTTT (TC) 4 AC (TC) 6 ATCAAAGC--CTTCATTCGT Delonia_regia GTGGTTCTAAAAATAGAACCC-TTGTGCAAAAGCATTGATTGCGGTTGCATTATTTTTGTTT (TC)2 AC(TC)10 AC(TC)6 ACTCACTCAAAGCC Bauhinia_sp. GTTCTATGAATAGAACTC----TTGTGCAGAAGCATTGTATGGGAATACAACGCAACTGAAGAGTTGGAATTTCGTA (TC) 8 ACTCAAAGC-CTTCATTC Accacia_karaoo GTGGTTCTATAAATAGAACCCCTTGGGTAGAAGCATTTAGACTCCAGACAACACAACTGAAGAGTTGGAATTTCGTA (TC) 7 ACTCAAAGC-CTTCA Leucena_leucephala GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGGGTAGAAGCATTATCACTCTTGCATTTTCGTT (TC)6 ACTCAAAGC-CTTCA Gleditchia_triacantha GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGTAGAAGCATTGACACATTTGAAATTTCGTT (TC) 11 ACTCAAAGC-CTTCATTCGT Smýkal et al. Heredity 103: , 2009

25 Aplikace retrotransposonů jako markerů

26 Příklad SSAP analýzy hrachu s PDR-1 elementem Genomic DNA TaqI digest PDR-1 adaptor genomic DNA restriction adaptor ligation PCR amplification gel separation analysis Nevýhody: jako AFLP technicky náročné na přesnost provedení mnoho kroků možnost chyby

27 Inter-Retrotransposone Amplified Polymorphism (IRAP) Long Terminal Repeat LTR Gag Pol LTR Primer Binding Site PPT

28 Inter-Retrotransposone Amplified Polymorphism (IRAP)

29 Vliv výběru retrotransposonu na IRAP

30 Vliv metody isolace DNA a Taq polymerázy na IRAP fingerprinting

31 Vliv koncentrace Mg na IRAP fingerprinting

32 Inter-Retrotransposone Amplified Polymorphism (IRAP) RETROTRANSPOSONOVÉ MARKERY Nr. Odrůda A B C D F G I J M 2 Alan Bohatýr Canis Jackpot Garde Grana Harnas Madonna Kamelot Herold Menhir Odrůdy hrachu Cyclop a Ogre LTR fingerprinting 15 Janus Romeo Zekon Hardy Primus Merkur Sonet Sponsor Tyrkys Olivín Terno Catania Baryton Carrera Gotik Komet Power Smaragd Tempra Lantra Adept

33 REMAP - Retrotransposon x Mikrosatelitní polymorfismus SSR repetice

34

35 Výhody použití IRAP / REMAP / ipbs metod jednoduchost není třeba žádných předchozích kroků, jen isolované DNA PCR univerzálnost (ipbs) vhodné pro studium vnitrodruhového polymorfismu/diverzity Nevýhody: opakovatelnost podobně jako u jiných fingerprintových metod potřeba použití stejné Taq polymerázy odečitatelnost délkového polymorfismus fragmentů problematické srovnání mezi laboratořemi

36 Retrotransposon-based insertion polymorphism (RBIP) + - Nr. Nam e Ye a r RBIP-1 RBIP-2 RBIP-3 RBIP-4 RBIP-5 RBIP-6 RBIP-7 RBIP-8 RBIP-9 RBIP-10 RBIP HS nsl '/'-' LU -DIK ZL LU -DK ZEL T ola r CH Od eon T y rky s HM 1926 nsl '/'-' HC 52 nsl LU FK nsl HS nsl Senator Junak Eme rald Flavell et al. 1998, 2003 Jing et al. 2005, 2010

37 High throughput analysis Retrotransposon-based insertion polymorphism (RBIP) Heterozygote No PCR amplification (primer mismatch) Flavell et al. 1998, 2003 Jing et al. 2005

38 L1 člověk šimpanz gorila orangutan gibon I I I I I + element - element L3 L2 L1 člověk šimpanz gorila L2 člověk šimpanz gorila orangutan gibon I I I I I orangutan gibon I I I I I milióny let L3 člověk šimpanz gorila orangutan gibon I I I I I SINE element obsazené místo (+) PCR amplifikace prázdné místo (- ) Inzerce retrotransposonu jako fylogenetická značka

39 Alu- elementy a lidská diversita

40 SSAP Hrách

41 Retrotransposonové markery Výhody: * Abundatní složka eukaryotických genomů * Dominantní (IRAP/SSAP) / ko-dominantní markery (RBIP) * Rychlá aplikace na nové druhy Nevýhody: Dominantní markery (IRAP/SSAP) nepřesné pro fylogenezi vhodné pro studium vnitrodruhové diverzity Ko-dominantní (RBIP) přesné, ale náročné na vývoj

42 Genově specifické markery

43

44 Využití syntenie s modelovými organismy Hrách Versus Medicago truncatula

45

46 Single nucleotide polymorphism EXON 1 Intron 1 EXON 2 Intron 2 EXON 3 55 bp AGCcTATT 250 bp EXON 1 EXON 2 EXON 3 AGCgTATT 55 bp 200 bp indel inzertion / deletion

47 Distribuce a typy SNP(ů)

48 Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

49 Gen po genu - sekvenováním Pomalé, nákladné vhodné pro menší počet vzorků

50 Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences (dcaps)

51 Cleavage Amplified Polymorphic Sequence (CAPS-PCR) GTTCTCTTTGTTGCACGTAATTAACTCATCATTCTTGTATATTAATTAAT GTTCTCTTTGTTGCACGTAAGTAACTCATCATTCTTGTATATTAATTAAT MseI site TTAA 1. PCR 2. štěpení X Pokud existuje vhodné restrikční místo v cílovém fragmentu

52 Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences (dcaps) Pokud NEexistuje vhodné restrikční místo v cílovém fragmentu Nutno jej vytvořit nově v PCR primeru Následně je rozdíl jen o délku primeru (16-25 bp) potřeba dobrého rozlišení

53

54

55 Genově specifické markery CAPS/dCAPS Výhody: ko-dominantní locus-specifické jednoduše hodnotitelné a interpretovatelné lehce adaptovatelné mezi laboratořemi Nejlépe pro mapování mezi 2 genotypy/rodiči Nevýhody: nutnost sekvenování často malý polymorfismus mezi příbuznými genotypy malá produktivita - gen po genu

56 Příklad mapování pomocí CAPS markerů Marker PA-5 AB-111 Gpt Cdk3 PSAS1 Fw Green Arrow A A A A A A PI B B B B B B PRIL7-01 B B B B B A PRIL7-02 B A A A A B PRIL7-03 B A A A A B PRIL7-04 B A A A A B PRIL7-05 A A A A A B PRIL7-06 B B B B B A PRIL7-07 A B B B B A PRIL7-08 A B B B B A PRIL7-09 A A A A A B PRIL7-10 A A A A B B PRIL7-11 A B B B A B PRIL7-12 B A A A A B PRIL7-13 B B B B B A PRIL7-14 A B B B B A PRIL7-15 A B B B B A PRIL7-16 B B B B B A PRIL7-17 B B B B B A PRIL7-18 B B B B B A PRIL7-19 A A A A A B PRIL7-20 B A A A A B PRIL7-21 B B B B B A PRIL7-22 A B B B B A

57 Co je potřeba pro mapování? Dva kontrastní rodičovské genotypy v dané/-ných vlastnostech Jejich křížením získaný soubor rekombinantních inbredních linií (RIL) v F5:6 generaci Jejich fenotypová charakterizace v dané vlastnosti/znaku Nejlépe existující základní genetická mapa pro daný druh Soubor polymorfních markerů

58 Kolik SNPs detekujeme versus kolik vzorků najednou

59 Specificita detekce dané během PCR reakce

60

61 Detekce založená na rozdílné Tm teplotě

62 Hybridizací na chipech

63 1 Hybridization-based methods 1.1 Dynamic allele-specific hybridization 1.2 Molecular beacons 1.3 SNP microarrays 2 Enzyme-based methods 2.1 Restriction fragment length polymorphism 2.2 PCR-based methods 2.3 Flap endonuclease 2.4 Primer extension (Illumina Infinium) nuclease (TaqMan) 2.6 Oligonucleotide ligase assay 3 Other post-amplification methods based on physical properties of DNA 3.1 Single strand conformation polymorphism 3.2 Temperature gradient gel electrophoresis 3.3 Denaturing high performance liquid chromatography 3.4 High-resolution melting of the entire amplicon 3.5 Use of DNA mismatch-binding proteins 3.6 SNPlex 4 Sequencing Možnosti detekce SNP polymorfismu

64

65 Tetra-primer ARMS-PCR

66 Z laboratoře na pole:

67 Marker Assisted Breeding/Selection (MAS) šlechtění molekulární biologie Marker assisted breeding

68 Laboratorní, skleníkové, polní testování fenotypu

69 Schéma Bulked Segregant Analysis pro získání markeru k MAS Rodiče X Resistentní Náchylný F2 F1 fenotypické hodnocení - DNA analýza

70 Princip BSA pro získání markeru genetické základy

71 Proč používáme BSA? větší znáhodnění genetického pozadí snížení vlivu fenotypově špatně hodnocených jedinců snížení počtu potřebných analýz možnost testování většího množství jedinců

72 Padlí hrachu (Erysiphe pisi) Rekombinační vzdálenost er-1 cm ( x rekombinantů/100) Recesivní er-1 gen

73 Vazba markeru se znakem nepřímý marker Marker A X GEN (např. rezistence) DNA 5 cm (vzdálenost) Spolehlivost při selekci : 95% Spolehlivost při selekci: 99,5% Marker A X GEN X Marker B 5 cm (vzdálenost) 5 cm Výsledek selekce s použitím nepřímého markeru Rezistentní Náchylná Rezistentní Rezistentní Rezistentní Rezistentní

74 W62L G107R N169K Intron 3

75 75% spolehlivost fenotypového hodnocení versus 100% DNA testování příklad rezistence (eif4e) hrachu k PSbMV viru

76 Len setý (Linum usitatisimum L.) Původně přadná rostlina ale i 35% oleje v semeni a-linolenová kyselina (C18:3) 60% linolová kyselina (C18:2) 14% olejová kyselina (C18:1) 20%

77 Nízkolinolenový len - mutace FAD3A,B genů (recesivního znaku) FAD 3A exon 5 Windemere 250 GACGACCGTCGATCGAGATTACGGGGTCATCAACAA Jantar 250 GACGACCGTCGATCGAGATTACGGGGTCATCAACAA Venica-wt 250 GACGACCGTCGATCGAGATTACGGGGTCATCAACAA Normandy-wt 250 GACGACCGTCGATCGAGATTACGGGGTCATCAACAA Lola 250 GACGACCGTCGATTGAGATTACGGGGTCATCAACAA 981/ GACGACCGTCGATTGAGATTACGGGGTCATCAACAA 962/ GACGACCGTCGATTGAGATTACGGGGTCATCAACAA * Stop codon 1. palmitic acid (C16:0) 2. stearic acid (C18:0) 3. oleic acid (C18:1) 20% 4. linolic acid (C18:2) 14% 5. linolenic acid (C18:3) % FAD 3B exon 1 Amon 174 TGGGTGAAGAACCCCTGGAGGTCGCTCAGCTACGTCCTGAGAGACCTCCTTGTCAT Windemere 174 TGGGTGAAGAACCCCTGGAGGTCGCTCAGCTACGTCCTGAGAGACCTCCTTGTCAT Jantar 174 TGGGTGAAGAACCCCTGGAGGTCGCTCAGCTACGTCCTGAGAGACCTCCTTGTCAT Venica-wt 174 TGGGTGAAGAACCCCTGGAGGTCGCTCAGCTACGTCCTGAGAGACCTCCTTGTCAT Normandy-wt 174 TGGGTGAAGAACCCCTGGAGGTCGCTCAGCTACGTCCTGAGAGACCTCCTTGTCAT Lola 174 TGGGTGAAGAACCCCTGAAGGTCGCTCAGCTACGTCCTGAGAGACCTCCTTGTCAT 984/ TGGGTGAAGAACCCCTGAAGGTCGCTCAGCTACGTCCTGAGAGACCTCCTTGTCAT * Stop codon

78 Genově specifický (ideální) marker Detected eif4e allele W62L AA73-74DD S78 G107R N169K Intron 3 size (bp) SBM-1 W AA S G N 1,201 SBM-1 W AA S G N 1,201 SBM-1 W AA S G N 1,201 SBM-1 W AA S G N 1,201 sbm-1 W PD _ G N 1,201 sbm-1 W PD _ G N 1,201 sbm-1 W PD _ G N 1,257 sbm-1 W PD _ G N 1,257 sbm-1 L DD S R K 1,151 sbm-1 L DD S R K 1,151 sbm-1 L DD S R K 1,151 sbm-1 L DD S R K 1,151 Gen Marker varianta A Marker varianta B DNA Selekční spolehlivost 100 % R R R R R R

79 Vazba markeru se znakem nepřímý marker Marker A X Gen (např. rezistence) DNA 5 cm (vzdálenost) Spolehlivost při selekci 1 r A = 95% Marker A X Gen X Marker B 5 cm (vzdálenost) 5 cm Spolehlivost při selekci 1 2r A r B = 99,5%

80 Výsledek selekce s použitím nepřímého markeru Rezistentní Náchylná Rezistentní Rezistentní Rezistentní Rezistentní Výsledek selekce s použitím přímého markeru genu rezistence Rezistentní Rezistentní Rezistentní Rezistentní Rezistentní Rezistentní

81 Kodominantní marker odlišení i heterozygota P1 P2 F1 F2 R odolný AA aa Aa aa AA Aa aa AA aa AA S R S R S S R S R S S náchylný Dominantní marker nutnost 2 analýz P1 P2 F1 F2 AA aa Aa Aa aa aa Aa AA Aa

82 Markery pro fylogenetické studie

83 Požadavky: 1.) univerzálnost aplikovatelnost napříč druhy, rody i čeleděmi 2.) dostatečný polymorfismus 3.) liniovost možnost sledování linie (maternální dědičnost) DNA barcoding Chloroplastové sekvence (matk, rbcla, trnsg) Jaderně kódované (Internal transcribed spacer rdna ITS)

84 Chloroplastová DNA kb kruhová DNA kopií na buňku Následně: vysoká stabilita DNA robustnost PCR detekce možnost detekce i z herbářových materiálů

85 matk

86 Fylogram odvozený na základě analýzy cpdna (matk, trnsg)

87