Met e o t d o y d m ol o ek e ul u ár á n r í n í g e g n e e n t e i t ky v m ikro r b o i b ol o og o i g i Pavel Dřevínek

Transkript

1 Metody molekulární genetiky v mikrobiologii Pavel Dřevínek

2 Plán semináře: rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií výhody a nevýhody molekulárního přístupu jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření - detekce jednoho určitého agens - detekce jakéhokoli agens - kvantifikace agens PCR diagnostika hledá se konkrétní patogen hledá se patogen, předem není stanoveno jaký

3 Plán semináře: rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií výhody a nevýhody molekulárního přístupu jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření - detekce jednoho určitého agens - detekce jakéhokoli agens - kvantifikace agens jak funguje identifikace přes MALDI TOF molekulární epidemiologie - genotypizace příklady ze života

4 Klasická mikrobiologie: přímý průkaz - kultivace, mikroskopie, antigeny nepřímý průkaz - protilátky zjišťování citlivosti na antibiotika Molekulární mikrobiologie: přímý průkaz - DNA či RNA; proteiny žádný nepřímý průkaz detekce jednotlivých genů rezistence, popis genomu

5 Kultivace vs. molekulární genetika Princip detekce a identifikace Klasika celý organismus, metabolicky aktivní MG DNA či RNA Výhody MG: vyšší rychlost provedení záchyt organismů, které nelze kultivovat, jejichž kultivace je náročná záchyt bez ohledu na způsob růstu (biofilm) záchyt při podávané ATB léčbě Nevýhody MG: často chybí informace o tom, zda jsou bakterie živé není k dispozici živý izolát, např. pro určení ATB citlivosti

6 Kultivace vs. molekulární genetika Klasika MG ATB citlivost komplexní jednotlivé geny rezistence Nevýhody MG: chybí komplexní obraz, MIC meca: MRSA vana: VRE karbapenemázy - KPC - NDM-1 - IMP - VIM

7 VanA-type glycopeptide resistance. Van operon přenášený na transpozonu

8 Kultivace vs. molekulární genetika Sensitivita Klasika MG srovnatelná či vyšší u mol. gen. vyšetření Výhody MG: záchyt malého počtu agens (infekce dříve diagnostikována) Nevýhody MG: riziko falešné pozitivity (kontaminace)

9 Kultivace vs. molekulární genetika Klasika MG Kvantifikace orientační absolutní Výhody MG: určení infekční nálože sledování dynamiky infekce

10 Souhrn výhod molek. genetiky Výhody Rychlost vyšetření Vysoká specificita Často vyšší senzitivita Úskalí Ale nebývá non-stop provoz laboratoří Stačí PCR nález ke změně ATB léčby? Nelze detekovat ty mikroby, které nejsou součástí diagnostické soupravy Riziko falešné pozitivity Kvantifikace Záchyt při podávané ATB te Nejedná se o záchyt DNA z rozpadlých buněk? Záchyt pomalu rostoucích mikrobů Chybí izolát Nelze stanovit citlivost ke všem ATB

12 Detekce zaměřena na nukleotidovou sekvenci primer ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA TGCCGTAAGCCGTTGACACGTGAACCTGTATATGT Jak vypadá výsledek PCR primer Jak vypadá výsledek sekvenace

13 Jaké jsou možné cílové oblasti DNA pro PCR? varianta A primery mikrob 1 mikrob 2 mikrob 3 ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA TATACA ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA TATACA ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA TATACA

14 Jaké jsou možné cílové oblasti DNA pro PCR? varianta B primery mikrob 1 mikrob 2 mikrob 3 ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA TATACA ACGGCATTCGATTACTGTACACTTGCCCATATACA TATACA ACGGCATTCGTCCACAGTGCACTTGGACATATACA TATACA

15 Jaké jsou možné cílové oblasti DNA pro PCR? varianta C primery mikrob 1 mikrob 2 mikrob 3 ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA TATACA ACTGCATT ACGGCATTCGATTACTGTACACTTGCCCATATACA AATACA ACGGCAAA ACGGCATTCGTCCACAGTGCACTTGGACATATACA GATACA

16 Jaké jsou možné cílové oblasti DNA pro PCR? varianta D primery mikrob 1 ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA TATACA mikrob 2 mikrob 3

17 A B C D mikrob 1 mikrob 2 mikrob 3

19 PCR diagnostika hledá se konkrétní patogen Patogen specifické PCR

20 Důvod použití patogen specifického PCR pomalý (žádný) růst složitá identifikace vysoká citlivost biohazard Příklad Mycobacterium tuberculosis Bordetella pertussis Pneumocystis jiroveci Původci bakter. meningitid Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Clostridium difficile Staphyloccocus aureus (MRSA) respirační viry (influenza)

21 Nemá náhodou pacient černý kašel? (potřeba detekovat bordetelu, ostatní mikroorganismy mě nezajímají)

22 A B C D bordetela chlamydia mycoplasma cílová sekvence pro primery musí být unikátní pro bordetelu PCR DETEKCE + IDENTIFIKACE bordetely

24 PCR diagnostika hledá se patogen, předem není stanoveno jaký Broad range PCR Broad range PCR neboli panbakteriální PCR

25 Důvod použití broad range PCR rychlá detekce vysoká citlivost pomalý (žádný) růst Příklad sepse endokarditidy

26 Horečka. Jedná se o infekční proces? Co je jeho příčinou? (potřeba detekovat kteroukoliv bakterii, protože kterákoli bakterie může způsobit sepsi)

27 A B C D S. aureus S. epidermidis E. faecalis cílová sekvence pro primery je přítomna u všech bakterií

28 A B C D S. aureus S. epidermidis E. faecalis PCR (16S rdna ) + sekvenace DETEKCE IDENTIFIKACE

29 Výsledek sekvenace PCR produktu: S. aureus C T G A

30 Výsledek sekvenace PCR produktu: C T G A

31 Výsledek broad range 16S PCR vzorky z kardiovaskulární chirurgie: ID materiál 16S / 18S sekvenace kultivace 1 trikuspidální chlopeň Staphylococcus aureus negativní 2 aortální chlopeň Bartonella quintana negativní 3 aortální chlopeň Enterococcus faecalis negativní 4 trikuspidální chlopeň Staphylococcus aureus negativní 5 mitrální chlopeň Streptococcus anginosus negativní 6 mitrální chlopeň Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 7 trikuspidální chlopeň negativní negativní 8 trikuspidální chlopeň Staphylococcus aureus negativní 9 aortální chlopeň Bartonella quintana negativní 10 mitrální chlopeň Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis 11 aortální chlopeň Enterococcus faecium negativní 12 trikupidální chlopeň Enterococcus faecium negativní 13 mitrální chlopeň Candida glabrata Candida glabrata 14 aortální chlopeň Enterococcus faecalis negativní 15 mitrální chlopeň Staphylococcus aureus negativní 16 chlopeň Bartonella quintana negativní

32 Pacientka 65 let OA: před 11 měsíci reimplantace TEP kyčle NO: bolest v místě kyčle trvající 4 dny Fyzikální vyšetření: fluktuující ložisko 5x5 cm laboratoř: CRP 195 klindamycin + levofloxacin po výsledku kultivace ampicilin/sulbaktam + levofloxacin datum materiál 16S sekvenace kultivace punkce ložiska - hnis nezasláno k vyšetření E. coli tkáň během operační revize kloubu negativní S. epidermidis po pomnožení punktát během operační revize E. coli negativní 11 dní po operaci dimise; CRP 69

34 Důvod kvantifikace cestou MG exaktní Příklad herpesviry u imunosuprimovaných HIV HCV

35 Kolik má pacient po transplantaci kostní dřeně kopií viru EBV?

36 přístroje real time PCR (kvantitativní PCR) primer sonda ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA TGCCGTAAGCCGTTGACACGTGAACCTGTATATGT primer

37 přístroje real time PCR (kvantitativní PCR)

38 ředicí řada (standardy o definované kvantitě)

39 EBV detekce pomocí PCR Log of viral qu uantity in GE Log virové nálo ože na g.e. 1.E E E E E E E E E-01 ND LPD Days Dny after po HSCT DNA DNA from z plné whole krve blood

41 Nový fenomén v klinické mikrobiologii: Hmotnostní spektrometrie Identifikace přes proteiny

42 MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight - identifikace narostlé bakteriální kultury - rychlost identifikace v minutách - zrychlení diagnostiky o desítky hodin - široká škála mikroorganismů (2150 rodů) - přesnost, reprodukovatelnost nálezu - v ČR 35 přístrojů

43

45 Epidemiologie infekcí: Odhalení epidemie Odhalení přenosného (epidemického) kmene?

46 Taxonomie Rod Druh Kmen

47 Druh Kmen strain strain strain strain strain

48 Identifikace kmene sekvence je jedinečná pro daný kmen kmen 1 kmen 2 kmen 3 A B C D genotypizace

49 Princip genotypizace Analýza bakteriálních genů (genomu) Odhad příbuznosti mezi izoláty téhož druhu Geneticky Klinicky + = Epidemický blízké izoláty blízké izoláty kmen

50 Metody genotypizace Gel (image)-based - Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) - PCR metody - Random amplified polymorphic DNA analysis (RAPD) - rep-pcr (repetitive elements: ERIC, REP, BOX) - Amplified fragment length polymorphism analysis (AFLP) - Ribotypizace

51 Metody genotypizace Sequence-based - Multilocus sequence typing (MLST)

53 Centrum cystické fibrózy (300 pacientů) zavedena PCR diagnostika bakterií Burkholderia cepacia - 30 % pacientů s pozitivním nálezem kultivační diagnostika odhalila cca 15 % pozitivních pacientů - vyčleněna samostatná ambulance jen pro cepaciové pacienty infikovaných pacientů do pořádání letních táborů pro nemocné CF 30%

54 RAPD

55 MLST ID atpd gltb gyrb reca lepa phac trpb ST

56 infikovaných pacientů Kmen ST-32 30% 96%

57 Princip izolačního režimu v centrech CF: Žádný pacient s CF by se neměl setkat s druhým pacientem s CF. Zvláště rizikové je setkání dvou pacientů s odlišným mikrobiologickým nálezem. 1. pacienti bez infekce (nekolonizovaní) 2. pacienti s infekcí Pseudomonas aeruginosa 3. pacienti s infekcí Burkholderia cepacia

58 Globální rozšíření ST32

59 Vysvětlení jevu?

62 Další příklady ze života

63 Epidemie P. aeruginosa Hematoonkologie (Itálie), oddělení otevřeno v březnu 2006 červen 2007: 2 zemřelí v jednom týdnu - kmen PA, shodný ATBgram uzavření jednotky epidemiologické šetření - retrospektivní studie - prospektivní studie - identifikace asymptomatických případů - HCW - audit hygienických pravidel - kontrola prostředí

64 Retrospektivní analýza březen červen pts 10 případů hetegenní profil 3 izoláty stejný profil

65 Prostředí: 29 vzorků (desinfekce, odpady, umyvadla, sprchy ) P. mendocina P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa P. stutzeri

66 pacienti dávkovač mýdla odpady umyvadla

67 Epidemie E. coli E. coli O104:H4 ~ (EHEC, EAEC), STEC květen 2011 Německo 3,842 případů - 2,987 GI 18 úmrtí HUS 35 úmrtí

68 STEC O104:H4 příčina: klíčky/výhonky? (nikoli maso x EHEC 0157:H7) časem zaznamenán i interhumánní přenos sekvenovaný genom: původ v EAEC, ovšem zde navíc gen stx horizontální transfer - kombinace faktorů virulence EHEC (profág) a EAEC (plazmid) specifické PCR

69 EAEC + profág s genem pro Shiga toxin = STEC O104:H4

70 Závěrem V klinické praxi mají molekulární metody své místo v předem definovaných situacích - toho, co se špatně kultivuje - tam, kde se jedná o rychlost: infekce u kritických stavů - tam, kde zůstává podezření na infekční etiologii, ale bez pozitivního nálezu