PROTEOMICKÝ EXPERIMENT

Transkript

1 2018

2 KLASICKÁ STRATEGIE PROTEOMICKÝ EXPERIMENT Štěpení všech bílkovin (trypsin) Separace směsi BÍLKOVIN Elektroforéza, chromatografie a jejich kombinace Separace směsi PEPTIDŮ Štěpení vybraných bílkovin + čištění peptidů Měření přesné hmotnosti peptidů ( a jejich fragmentů) Získání hmotnostních spekter SHOT-GUN STRATEGIE Porovnání hmotností sady peptidů (jejich fragmentů) s údaji o všech dostupných ORFs v databázích Identifikace bílkovin (+ kvantifikace)

3 KLASICKÁ STRATEGIE 2-DE-MS (proteiny) SHOT-GUN STRATEGIE 2D-LC-MS IEF-LC-MS (peptidy)

4 SEPARAČNÍ METODY chromatografie elektroforézy 2-DE příprava vzorků izoelektrická fokusace ekvilibrace SDS-PAGE detekce bílkovin a DIGE zpracování dat a vyhodnocení digesce vzorku a extrakce peptidů limty a záludnosti 2-DE

5 Elektroforéza Specifická mobilita u = z 6phr z - náboj h viskozita r Stokesův poloměr částice Elektroforéza v roztoku Elektroforéza v gelu Izoelektrická fokusace

6 1807 F.F. Reuss 1930 Arne Tiselius volná a papírová elektroforéza (1948 Nobelova cena) 1955 O. Smithies škrobový gel 1959 Raymond and Weintraub - polyakrylamidový gel 1961 Svensson and Vesterberg IEF a amfolyty 1970 U.K. Laemli SDS PAGE 1975 Patrick O Farrell 2-DE

7 POLYAKRYLAMIDOVÉ GELY 1959 Raymond and Weintraub- první AA gel Složení a příprava gelu: akrylamid (monomerní) bis-akrylamid (zesíťování polymeru) APS (peroxodisíran amonný,katalyzátor, produkuje volné radikály), TEMED (tetramethylethylenediamine, stabilizuje volné radikály) pufr a SDS Celková koncentrace akrylamidu a bis-akrylamidu určuje KONCENTRACI (T) gelu v procentech (2-20 %) Poměr bis-akrylamidu a akrylamidu POROZITU (C) gelu. APS v zásaditém prostředí může reagovat s Trisem, koncentrace co nejnižší ve prospěch TEMEDu.

8 POLYAKRYLAMIDOVÉ GELY IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE dělení na základě izoelektrického bodu v gradientu ph DENATURUJÍCÍ SDS-ELEKTROFORÉZA dělení na základě MW proteinu NATIVNÍ ELEKTROFORÉZA dělení na základě velikosti (průměru částice) a náboje

9 SDS ELEKTROFORÉZA SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) Bílkoviny se rozdělují na základě jejich MW Záporně nabité SDS tvoří komplexy s bílkovinami a stíní náboje proteinu (1,4g SDS :1g proteinu) Komplex má jednotkový náboj na hmotnostní jednotku. Všechny komplexy jsou záporně nabité a migrují k anodě PUFR: Tris-Cl/Tris-glycin 0.1 % SDS ph 8.8 Redukce disulfidických můstků (Dithiothreitol, Dithioerythrol, TCEP, beta-mercaptoethanol)

10

11 POLYAKRYLAMIDOVÉ GELY 1959 Raymond and Weintraub- první AA gel Složení a příprava gelu: akrylamid (monomerní) bis-akrylamid (zesíťování polymeru) APS (peroxodisíran amonný,katalyzátor, produkuje volné radikály), TEMED (tetramethylethylenediamine, stabilizuje volné radikály) pufr a SDS Celková koncentrace akrylamidu a bis-akrylamidu určuje KONCENTRACI (T) gelu v procentech (2-20 %) Poměr bis-akrylamidu a akrylamidu POROZITU (C) gelu. APS v zásaditém prostředí může reagovat s Trisem, koncentrace co nejnižší ve prospěch TEMEDu.

12 POLYAKRYLAMIDOVÉ GELY IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE dělení na základě izoelektrického bodu v gradientu ph DENATURUJÍCÍ SDS-ELEKTROFORÉZA dělení na základě MW proteinu NATIVNÍ ELEKTROFORÉZA dělení na základě velikosti (průměru částice) a náboje

13 SDS ELEKTROFORÉZA SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) Bílkoviny se rozdělují na základě jejich MW Záporně nabité SDS tvoří komplexy s bílkovinami a stíní náboje proteinu (1,4g SDS :1g proteinu) Komplex má jednotkový náboj na hmotnostní jednotku. Všechny komplexy jsou záporně nabité a migrují k anodě PUFR: Tris-Cl/Tris-glycin 0.1 % SDS ph 8.8 Redukce disulfidických můstků (Dithiothreitol, Dithioerythrol, TCEP, beta-mercaptoethanol)

14

15 Dvojrozměrná elektroforéza, 2-DE

16 150 kda DVOJROZMĚRNÁ ELEKTROFORÉZA (2-DE) Rozděluje proteiny nejdříve podle jejich náboje a následně kolmo na směr původní migrace dle jejich MW ph 4 ph 7 Jaterní homogenát, 2 mg, barvení koloidní Coomassie Blue 10 kda 1025 spotů

17 TEORETICKÁ DISOCIAČNÍ KŘIVKA DVOU BÍLKOVIN Net charge +3 NH 3 + NH 3 + pi Bílkovina v elektrickém poli v gradientu ph migruje do bodu, kde je její celkový náboj rovnen nule. pi ph ph pufru se vzorkem COO - -4 COO - + pi ph 3 ph 11 pi -

18 1975

19 1957 1/11/1955

20 Typický 2-DE experiment ph gradient solubilizace IEF redukce/alkylace SDS elektroforéza Vizualizace Štěpení trypsinem a identifikace pomocí MS Vyříznutí vybraných skvrn Diferenční obrazová analýza

21 2-DE příprava vzorků izoelektrická fokusace ekvilibrace SDS-PAGE detekce bílkovin a DIGE zpracování dat a vyhodnocení digesce vzorku a extrakce peptidů limty a záludnosti 2-DE

22 LYZAČNÍ PUFR PRO IEF: solubilizace Močovina, thiomočovina chaotropní činidlo, zvýšení rozpustnosti, denaturace bílkovin solubilizace Detergent (CHAPS) čistý zwitteriontový detergent zvýšení rozpustnosti snížení agregace bílkovin redukce S-S- Redukční činidlo (DTT) redukce disulfidický můstků (ionizují se nad ph 8, migrují pryč ze stripu na alkalickém konci) DTT, DTE versus TCEP (Tris[2-carboxyethyl] phosphine, tributylphosphine běh elektroforézy a ph gradient Nosičové amfolyty -- (carrier ampholytes, IPG buffers) jsou náhražkou pufrů, je to směs ionizovatelných látek vytvářejí potřebný ph gardient Pigment (BFB) pro snazší manipulaci Typický lyzační/rehydratační pufr 7 M Močovina Každá sůl škodí vaší separaci! Vše nabité pryč! PŘÍPRAVA VZORKŮ 2 M Thiomočovina 2-4 % CHAPS 0.2 % DTT (TCEP, tributylfosfin) % Nosičové amfolyty (IPG pufr) % BFB

23 Protein Redukce disulfidických vazeb Thiol-disulfidová výměna DTT s proteinem Protein Protein Protein

24 TEORETICKÁ DISOCIAČNÍ KŘIVKA DVOU BÍLKOVIN Net charge +3 NH 3 + NH 3 + pi Bílkovina v elektrickém poli v gradientu ph migruje do bodu, kde je její celkový náboj rovnen nule. pi ph ph pufru se vzorkem COO - -4 COO - + pi ph 3 ph 11 pi -

25 ZAKOTVENÉ PH GRADIENTY (IMMOBILIZED ph GRADIENTS IPG) Derivovaný akrylamid s disociovatelnými karboxy- a aminoskupinami

26 IPG STRIPY (IPG STRIPS) 3 mm široké, 0.5 mm silné, dehydrované - trvanlivost, reproducibilita, plastova podložka, stabilita, nemigrují, neinterferují s nimi redukční činidla.

27 ZOOMING Celkem 1754

28 REHYDRATACE IPG STRIPŮ A NANÁŠKA VZORKU PRO: Rehydratace a nanáška spojeny v jeden krok Proteiny rovnoměrně rozložené, neprecipitují v místě nanášky PROTI: Vzorek je dlouhodobě při pokojové teplotě

29 PODMÍNKY IZOELEKTRICKÉ FOKUSACE Optimalizace podmínek pro každý vzorek, typ stripu a nanášky. Teplota: kolem 20 o C ( PREVENCE KARBAMYLACE! versus krystalizace močoviny za nízkých teplot) Aktivní chlazení!!! Dochází k přehřívání na tzv. HOT SPOTS Nízký proud! Vysoké napětí Kyselina izokyanatá N konec nebo epsilon aminoskupina lyzinu Prevence oxidace a vysychání stripu : parafinový olej

30 TYPICKÝ IEF BĚH V BIO-RAD Protean IEF Cell 18 cm strip ph 3-10 Rehydratační nanáška 1mg 50 microa / strip Celkem Vh + hold t [h]

31 INSTRUMENTACE IEF

32 SEPARAČNÍ METODY chromatografie elektroforézy 2-DE příprava vzorků izoelektrická fokusace ekvilibrace SDS-PAGE detekce bílkovin a DIGE zpracování dat a vyhodnocení digesce vzorku a extrakce peptidů limty a záludnosti 2-DE

33 EKVILIBRACE STRIPŮ PŘED DRUHÝM ROZMĚREM Cíle ekvilibrace: Převést bílkoviny do pufrů vhodných pro redukci, alkylaci a SDS separaci Maximalizovat přenos bílkovin ze stripu Redukovat disulfidické můstky Alkylovat cysteiny

34 Protein Redukce disulfidických vazeb Thiol-disulfidová výměna DTT s proteinem Protein Protein Protein

35 Alkylace iodacetamidem Protein Protein Karbamidometyl

36 EKVILIBRACE STRIPŮ PŘED DRUHÝM ROZMĚREM Cíle ekvilibrace: Převést bílkoviny do pufrů vhodných pro redukci, alkylaci a SDS separaci: Maximalizovat přenos bílkovin ze stripu (SDS, močovina, Tris) Znovu redukovat reoxidované disulfidické můstky (DTT) Alkylovat cysteiny (iodacetamid)

37

38 SEPARAČNÍ METODY chromatografie elektroforézy 2-DE příprava vzorků izoelektrická fokusace ekvilibrace SDS-PAGE speciální metody detekce bílkovin a DIGE zpracování dat a vyhodnocení digesce vzorku a extrakce peptidů limty a záludnosti 2-DE

39

40 DETEKCE a VIZUALIZACE BÍLKOVIN V GELECH Citlivost Možnost kvantifikace Linearita signálu Dynamický rozsah Kompatibilita s MS Cena Kolorimetrické viditelné barvení CBB Stříbro Fluorescenční barvení A DIGE Sypro Deep Purple Flamingo Krypton DIGE

41 DETEKCE BÍLKOVIN VIDITELNÝMI PIGMENTY COOMASSIE BLUE G250/ R250! Různá účinnost na různé proteiny! Barví: Lys, Arg, His, Tyr (Trp, Leu) COOMASSIE BRILIANT BLUE R 250 G 250

42 DETEKCE BÍLKOVIN VIDITELNÝMI PIGMENTY COOMASSIE BLUE G250/ R250! Různá účinnost na různé proteiny! Barví: Lys, Arg, His, Tyr (Trp, Leu) COOMASSIE BRILIANT BLUE R 250 G 250 KLASICKÁ CBB (CBB-R250) Citlivost ng Alkohol-kyselina Odbarvování proteinů Špatná kvantifikace Nízká cena KOLOIDNÍ CBB (CBB-G250) Citlivost ng Alkohol - kyselina síran amonný Steady state (bez ztráty při odbarvení) Dobrá kvantifikace

43 Jaterní homogenát, preparativní nanáška 2 mg, barvení koloidní Coomassie Blue 1025 spotů ph 4 ph 7

44 DETEKCE BÍLKOVIN VIDITELNÝMI PIGMENTY DETEKCE STŘÍBŘENÍM Redukce dusičnanu stříbrného na kovové stříbro, Citlivost 0.5 ng! nízká cena Vícekrokový postup (až 20) Citlivý na přesnost Nízký dynamický rozsah Negativní barvení Komplikace s MS (glutaraldehyd a nízká extrakce peptidů) Problematická reproducibilita barví : Lys, Arg, His, Tyr, Trp

45 FLUORESCENČNÍ DETEKCE (4 8 ng/band) (4 8 ng/band) (1 2 ng/band; comparable to silver staining) (4 8 ng/band) Pigmenty se váží na detergentový (SDS) obal proteinu (kromě Sypro Ruby, ta se váže na bazické AA a Tyr, Trp) SYPRO RUBY (Molecular Probes) FLAMINGO (BIO-RAD) (DEEP) LAVA PURPLE (GE-Amersham) KRYPTON (Pierce) Sypro Ruby Dobrá kvantifikace Kompatibilní s dalším barvením Minimum kroků Dynamický rozsah Fluorescenční scanner CCD kamera Sběr spotů je komplikovaný Vysoká cena Flamingo

46 DIGE - Differential gel electrophoresis

47 2D-DIGE : 2D DIFFERENČNÍ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA (Cy2, Cy3, Cy5 Difference gel electrophoresis) Cyaninové fluorofory Maleimid - Cys (-SH) Succinimid - N-term a Lys (e)

48 EXPERIMENTÁLNÍ USPOŘÁDÁNÍ PRO DIGE Minimální versus maximální značení Rozdíly v migraci, off-set

49

50 Citlivost Cy ng Cy ng Cy ng Pro: vysoká citlivost, redukce počtu gelů a technických artefaktů Proti: cena, složitější statistika, nezbytnost 2-3 laserového scanneru, malá proteinová nanáška možný problém s identifikací

51 SEPARAČNÍ METODY chromatografie elektroforézy 2-DE příprava vzorků izoelektrická fokusace ekvilibrace SDS-PAGE speciální metody detekce bílkovin a DIGE zpracování dat a vyhodnocení digesce vzorku a extrakce peptidů limty a záludnosti 2-DE

52

53 Softwarové vyhodnocení 2D gelů Komerční: PDQuest Phoretix Progenesis Decodon ProFinder Bio Numerics a další Volně dostupné: GelScape Open2Dprot Služby: Ludesi

54 Detekce spotů Matching a odečtení pozadí Normalizace a kvantifikace 6 x 4,5 x

55 Jaterní homogenát, preparativní nanáška 2 mg, barvení koloidní Coomassie Blue 1025 spotů ph 4 ph 7

56 nemocní zdraví Neznámý diferenciálně exprimovaný protein XY (20 kda) Identifikace s využitím hmotnostní spektrometrie

57 Identifikace diferenciálně exprimovaného proteinu nemocní zdraví Neznámý diferenciálně exprimovaný protein XY (20 kda) Extrahovat intaktní protein z gelu je obtížné/nemožné Celý protein je nevhodný pro MS analýzu Naštěpení specifickou endoproteázou přímo v gelu

58 SPECIFICKÉ ŠTĚPENÍ BÍLKOVIN Cíl fragmentace: Definovaně fragmentovat protein, aby jednotlivé peptidy byly dostatečně malé na optimální MS analýzu, ale zároveň poskytly dostatečnou sekvenční informaci Optimum 6-20 AA, cca Da Proteáza Místo štěpení Poznámka Trypsin za Lys, Arg nenásleduje Pro Glu-C (Proteáza V8) za Glu a Asp nenásleduje Pro Chymotrypsin za Phe,Trp,Tyr, Leu, Ileu, Val, Met nenásleduje Pro Lys-C za Lys nenásleduje Pro Arg-C za Arg nenásleduje Pro Asp-N před Asp, Cys Chemická digesce CNBr Met organika, hydrofobní P.

59 TRYPSIN MW 23 kda z kravského nebo prasečího pankreatu štěpí v mírně bazickém ph 50 kda protein cca 30 peptidů Použití v roztoku, na blotu, v gelu Trypsin štěpí za Lys a Arg pokud nenásleduje Pro nemocní zdraví SSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREG YERLLKMQNQRGGRALFQD IKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHAL GSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKL IKKMGDHLTNLHRLGGPEAG LGEYLFERLT LKHD

60 Štěpení trypsinem H 2 N R 1 C H OH C O N H R 2 C C H O N H H R 3 C COOH H H 2 N R 1 C H C O + H 2 N R 3 C COOH H N H R 2 C C H O 18 OH trypsin

61 PŘÍPRAVA VZORKŮ Z GELU PRO IDENTIFIKACI POMOCÍ MS Výběr a vyříznutí spotu/proteinu (spotpicking) Dehydratace gelu (redukce, alkylace) ACN, vakuum KERATIN!!! Rehydratace v pufru s Trypsinem Acetonitril (ACN, MeCN) Digesce 37 o C Extrakce PEPTIDŮ (ACN) nesráží proteiny/peptidy neabsorbuje v UV má nízkou viskozitu kompatibilní s RP-LC Čištění a koncentrace MS analýza a identifkace

62 Identifikace diferenciálně exprimovaného proteinu nemocní zdraví In gel naštěpení trypsinem (za Arg, Lys) SSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLK MQNQRGGRALFQD IKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHAL GSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKL IKKMGDHLTNLHRLGGPEAG LGEYLFERLT LKHD Extrakce směsi peptidů z gelu

63 In-gel štěpení trypsinem (za R a K) LLK GGR SSQIR L IKK LT LK EGYER MQNQR TPDAMK ELAEEKR ALFQD IK AAMALEKK KPAEDEWGK MGDHLTNLHR DDVALEGVSHFFR LNQALLDLHALGSAR LGGPEAG LGEYLFER TDPHLCDFLETHFLDEEVK QNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDR

64 ČIŠTĚNÍ A KONCENTRACE PEPTIDŮ PO DIGESCI ZipTips Chromatografie v reverzní fázi (Reverse Phase) Hydrofobní vazba peptidu na alifatické uhlovodíkové řetězce (C18 nebo C4) Objem vzorku po extrakci obvykle > 40 mikrolitrů Po koncentraci a odsolení na ZipTips jen 1 10 mikrolitrů

65 Identifikace bílkovin pomocí hmotnostní spektrometrie

66 Identifikace bílkovin pomocí hmotnostní spektrometrie (MS) Stanovení velmi přesné hmotnosti peptidů nebo jejich fragmentů. Pohyb nabité částice ve vakuu, elektromagnetickém poli je funkcí její hmotnosti (m) a náboje (z). Hmotnostní spektrometr částice ionizuje (pseudomolekulární ionty) a separuje podle jejich m/z. Hmotnostní spektrum ukazuje závislost četnosti jednotlivých iontů na m/z. Přesné hmotnosti peptidů, nebo jejich fragmentů jsou porovnávány s vypočtenými hmotnostmi všech (teoretických) peptidů nebo fragmentů, které jsou přítomny v proteinových a genových databázích.

67 Hmotnostní spektrometr Normální tlak Vakuum Vložení vzorku Ionizační technika Hmotnostní analyzátor Detektor Počítač P. Mann a P. Novák, AVČR

68 Ionizační techniky MS MALDI- Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (z pevné fáze) ESI Electrospray Ionization (z roztoku) P. Mann a P. Novák, AVČR

69 Hmotnostní spektrometr typu TIME OF FLIGHT (TOF) Linear TOF Ion source Flight path Detector time-of-flight m/z Reflectron TOF Detector m1 =m 2 E 1 <E 2 Ion source Flight path 1 2 P. Mann a P. Novák, AVČR Reflectron

70 Identifikace bílkovin pomocí hmotnostní spektrometrie (MS) Peptidové mapování (Peptidový fingerprinting) na základě změření přesných hmotností peptidů vzniklých štěpením specifickou endoproteázou Fragmentace peptidů/sekvenování (MS/MS) na základě změření přesných hmotností fragmentů peptidu. Peptid nejsnáze fragmentuje v peptidické vazbě. Je tak získána (částečná) aminokyselinová sekvence v daném peptidu.

71 Identifikace diferenciálně exprimovaného proteinu nemocní zdraví In gel naštěpení trypsinem (za Arg, Lys) SSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREG YERLLKMQNQRGGRALFQD IKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHAL GSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKL IKKMGDHLTNLHRLGGPEAG LGEYLFERLT LKHD Extrakce směsi peptidů z gelu

72 Peptidové mapování (Peptidový fingerprinting) LLK I GGR SSQIR L IKK LT LK EGYER MQNQR TPDAMK ELAEEKR ALFQD IK AAMALEKK KPAEDEWGK MGDHLTNLHR DDVALEGVSHFFR LNQALLDLHALGSAR LGGPEAG LGEYLFER TDPHLCDFLETHFLDEEVK QNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDR m/z

73 Peptidové mapování (Peptidový fingerprinting) MALDI-TOF MS Přesné Accurate hmotnosti mass of the peptidů peptides Porovnání Databases databázemi search Ferritin (L-subunit) SSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREG YERLLKMQNQRGGRALFQD IKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHAL GSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKL IKKMGDHLTNLHRLGGPEAG LGEYLFER LTLKHD

74 Identification of protein in databases from MS data GENES, ORFs In silico translation Gene/Protein identification PROTEINS In silico digestion with trypsin (-R/-K) PEPTIDES theoretical MWs of peptides MS data Masses/MWs of peptides

75 Peptidové PEPTIDOVÉ mapování MAPOVÁNÍ (Peptidový (PEPTIDE MASS fingerprinting) FINGRPRINT) MALDI-TOF MS Přesné Accurate hmotnosti mass of the peptidů peptides Porovnání Databases databázemi search L-Ferritin (L-subunit) SSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREG YERLLKMQNQRGGRALFQD IKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHAL GSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKL IKKMGDHLTNLHRLGGPEAG LGEYLFER LTLKHD

76

77 I m/z

78

79

80 Protein View: GRP75_MOUSE Stress-70 protein, mitochondrial OS=Mus musculus GN=Hspa9 PE=1 SV=3

81 Co když máme ve vzorku směs proteinů?

82 Identifikace bílkovin pomocí hmotnostní spektrometrie Peptidové mapování (Peptidový fingerprinting) na základě změření přesných hmotností peptidů vzniklých štěpením specifickou endoproteázou Fragmentace peptidů/sekvenování (MS/MS) na základě změření přesných hmotností fragmentů peptidu. Peptid nejsnáze fragmentuje v peptidické vazbě. Je tak získána (částečná) aminokyselinová sekvence v daném peptidu.

83 Fragmentace peptidu (mikrosekvenování, MS/MS) S-P-A-F-D-S-I-M-A-E-T-L-K MH + = P. Mann a P. Novák, AVČR

84 Fragmentace peptidu (mikrosekvenování, MS/MS) MALDI TOF-TOF MW peptidu Kolizní cela LGGPEAGLGEYLFER LGGPEAGLGEYLFE R LGGPEAGLGEYLF ER LGGPEAGLGEYL FER LGGPEAGLGEY LFER LGGPEAGLGE YLFER m/z jeho fragmentů Identifikace peptidu LGGPEAGLGEYLFER a proteinu L-FERRITIN

85 Identification of protein in databases from MS data GENES, ORFs PROTEINS In silico translation Gene/Protein identification In silico digestion with trypsin (-R/-K) PEPTIDES theoretical MWs of peptides FRAGMENTS MS data MWs of peptides and their fragments theoretical MWs of peptide fragments

86 MS peptidový fingerprint m/z 1865

87 Kdy použít PMF a kdy musím fragmentovat peptid? Jediný protein ( z 2-DE) Směs peptidů z jednoho proteinu (5-50 peptidů) MS (PMF) Směs proteinů Směs peptidů z mnoha proteinu ( peptidů) MS/MS (fragmentace) FRAKCIONACE!

88 proteiny proteiny 2-DE LC-MS shotgun peptidy peptidy

89 Identifikace proteinů v shot-gun experimentech Až stovky tisíc různých peptidů kontinuálně eluovaných z (RP) LC On-line MS přímé spojení LC kolony s ESI-MS. V reálném čase ( minut) jsou eluované peptidy ionizovány. Změřeno MS, izolován prekurzor a provedena fragmentace. Cyklus přepnutí MS-MS/MS až několikrát za sekundu. Off-line MS např. LC-MALDI. Frakce eluujících peptidů jsou sbírány a MS probíhá až po sběru. Typicky sběr mikrofrakcí (nl) na MALDI destičku s následným měřením MS a MS/MS.

90 RP-LC

91 RP-LC ESI

92 RP-LC ESI

93 RP-LC ESI

94 RP-LC ESI

95 RP-LC MS ESI

96 RP-LC MS ESI

97 RP-LC MS MS/MS ESI

98 RP-LC MS ESI

99 RP-LC MS ESI

100 RP-LC MS MS/MS ESI

101 Protein identification in shot-gun experiments Unique (proteotypic) peptides X peptides present in different proteins Protein 1 Protein 2 Protein 3

102 Present in more proteins Unique