Ivo Sedláček Brno

Transkript

1 Ivo Sedláček Brno

2 Mikroorganizmy - rezervoár mikrobiálních genetických zdrojů - všudypřítomné ve většině prostředí -zajištění stability a funkce přírodních ekosystémů - producenti látek -farmaceutický, potravinářský, chemický průmysl, zemědělství X někteří patogenní účinek - biodegradační schopnosti (likvidace toxických odpadů) Prokaryota mohou, a také to dělají, téměř cokoliv.. Prokaryota mohou, a také to dělají, téměř cokoliv.. Prokaryotní organizmy jednobuněčné, není jaderná membrána organely nezávislé na CPM systému pevná stěna, peptidoglykan (murein) ribozómyrozptýleny vcytoplazmě, sedimentační koeficient 70S výživa vmolekulární formě

3 Doména Archaea -organizmy ve vodách, na souši (anaerobní, hyperslané, hydrotermálně či geotermálně vyhřívané prostředí); trávicí trakt = extremofilové Znakem je: -přítomnost éterové vazby mezi glycerolem a vyššími mastnými kyselinami u lipidů vplazmatické membráně (u bakterií je esterová) - postrádají murein (peptidoglykan obsahující kyselinu muramovou) vbuněčné stěně

4 - tři fenotypová oddělení (G-; G+; 0) -dávalo představu o diverzitě bakterií - nebralo vúvahu chemotaxonomii, molekulární taxonomii, fylogenetické vztahy Bakterie = nejpočetnější biotická složka (saprofyt, komenzál, patogen) G- bakterie sbuněčnou stěnou -stěna složena z vnější LPS membrány a vnitřní tenké PG vrstvy + kyselina MRM -barví se G-, přítomnost exopolysacharidovévrstvy okolo vnější membrány = G+ -buňky kulaté, oválné, tvaru tyček, šroubovic či vláken; spochvou nebo opouzdřené -fototrofní nebo nefototrofní, a to jak litotrofní, tak i heterotrofní G+ bakterie sbuněčnou stěnou - chybí vnější membrána a PG vrstva je tlustá -stěna -kyselina teichoová, neutrální polysacharidy, mykolové kyseliny, barví se G+ -buňky kulaté, tyčkovité, vláknité, mohou se větvit; někteří endospóry; heterotrofní

5 Znak Bacteria Archaea Buněčná stěna obsahuje kyselinu muramovou + - Éterová vazba mezi glycerolem a karboxykyselinami - + MK navázány na glycerol esterovou vazbou + - První aminokyselinou při proteosyntéze je: Metionin - + N-Formylmetionin + - Některé trnageny obsahují introny - + Blízká příbuznost mezi doménami Archaea a Eucarya (NE mezi Archaea a Bacteria, určité molekulární znaky mají archaea shodné s doménou Eucarya)

6 charakterizovat mikroorganizmy zařadit je do jednotek,tzv.taxonů Taxonomie - teoretické studium klasifikace (vlastnosti, principy, postupy,pravidla) Systematika -studium diverzity a vzájemné příbuznosti (klasifikace, ekologie,genetika,...) Taxonomieje dynamický subjekt, který se může měnit dle dostupných údajů zetříoddělených,alesoučasně i navzájem provázanýchoblastí: klasifikace nomenklatury identifikace

7 Taxonomie = synonymum systematiky (klasifikace, nomenklatura, identifikace); statická? Klasifikace - zařazování do skupin (taxonů) na základě podobnosti a příbuznosti -znalost význačných charakteristik (experimentální, pozorovací techniky) Klasifikace prokaryot je veličina vytvořená pro mikrobiology a ne pro jednotky, které jsou klasifikovány!!! -založena na komplexu dostupných údajů Numerická taxonomie -vyvíjí se jako část náročných analýz (80. léta) - cílem bylo navržení stabilní sestavy metodik pro klasifikaci -sdružování do fenotypových skupin -totožné staxony (forma matic)

8 Nomenklatura = označení jednotek definovaných pomocí klasifikace Je řízena mezinárodním nomenklatorickým kódem (ICNB) Nezávislá na: botanické nomenklatuře (!řasy, houby) zoologické nomenklatuře (!prvoci) Jméno je založeno na: Validní publikaci Int. J. Syst. Evol. Microbiol. Legitimitě pravidla z International Codeof Nomenclature of Bacteria Prioritě publikace dřívější pojmenování je platné Efektivitě publikace -zveřejnění tištěných materiálů dostupných vědecké komunitě za účelem poskytnutí stálého záznamu

9 Jméno a validní publikace -představuje binární kombinaci rodového jména a druhového označení (vyjádření vlastností, místa, aj.; poddruhové jméno) -musí vyhovovat pravidlům z ICNB (mezinárodně akceptována, bakteriální nomenklatura se jim musí podrobovat) priorita popisu, typová kultura, podrobný popis - stabilní, jednoznačná, nezbytná ApprovedListsof BacterialNames InternationalJournalof Systematicand EvolutionaryMicrobiology (IJSEM) -originální článek -ValidationList -nomenklatura následujeklasifikaci -využití fenotypových, genetických a fylogenetických charakteristik vedlo ke změnám vklasifikaci i vnomenklatuře Validní jméno

10 -proces porovnávání neznámého se známým -praktickou aplikací klasifikace a nomenklatury Bakteriální identifikace je prováděna pomocí mikrotestů Identifikační schémata X klasifikační schémata Pro klasifikaci má každá zjištěná charakteristika stejnou váhu X pro identifikaci mohou být některé znaky zvýhodněny oproti druhým Automatizované systémy -citlivost katb, hemokultury (změna ph, uvolnění chromogenu či fluorogenu, detekce metabolitů) Imunodiagnostické metody antigen x protilátka Chromatografické metody rozdílná rozpustnost látek Bakteriální identifikace a typizační postupy jsou taxonomickými klasifikacemi!

11 Historické hledisko - morfologická kritéria (mikroskopická, makroskopická) Praktická klasifikace (morfologické, biochemické a fyziologické údaje, sérologie) = fenotypizace Fylogenetická klasifikace -fenotypové vlastnosti doplněné o výsledky metod molekulární biologie a o chemotaxonomické údaje Oficiální klasifikace???

12 Fyz.+bioch.vlastnosti komerční soupravy konvenční testy kultivacenaka/24h úspěšnost typizace absencestandardní metody Sérologické techniky využívají chemického složení stěny bakteriálních buněk chovat se jako antigen, tj. vyvolat produkci protilátek (aglutinace, precipitace, komplement fixační reakce nebo munofluorescence)

13 -poprvé aplikováno před > 40 lety -jednou z hlavních technik (% G+C, RNA/DNA hybridizace, denaturace a renaturace DNA) Genotypové informace -odvozeny od nukleových kyselin Genotypové metody -přímo zaměřeny na studium polymorfizmu DNA nebo RNA molekul -obráží přirozené příbuzenské vztahy kódované DNA -cíleny buď na celkovou DNA nebo jen na určitý úsek DNA (případně plazmidové DNA)

14 Studium celkové DNA: Mol %G+C; RFLP analýza; PFGE; velikost genomu; DNA reasociace Studium části DNA: Ribotypizace, AFLP, PCR /ERIC-PCR, rep-pcr, trna-pcr/; DNA sondy; DNA sekvencování Fingerprinting plazmidové DNA: Analýza polymorfizmu plazmidové DNA; RFLP/AFLP analýza pl. DNA Klíčovou metodou systematiky prokaryot je srovnání rrna DNA-rRNA hybridy v 16S rrna katalogizace v kompletní sekvencování

15 -stanovení fylogenetického postavení (97%) - částečné sekvence -pro identifikaci organizmů / zařazení do ustanovených skupin -genomospecies -poddruh -variety, přípona var (-typ): biovar, fagovar, patovar, serovar, aj. -rod Taxonomie prokaryot - domény Bacteria a Archaea Sekvencování vysoce konzervativních oblastí genomu -revoluce vtaxonomii

16 Rozvoj molekulárně biologických technik - molekulární typizace univerzálně aplikovatelné (klonální potomstvo jedné buňky = geneticky identické) Typizační techniky -děleny do tří skupin: 1.) založené na lipopolysacharidech a mastných kyselinách: SDS-PAGE lipopolysacharidů FAME -pro G-tyčky 2.) založená na analýze složení proteinů buněčné stěny a vnější membrány: SDS-PAGE, subtypizaceg- bakterií multilokus enzymová elektroforéza

17 3.) založené na nukleových kyselinách: DNA sekvencování -přímé stanovení sekvencí nukleotidů vdna restrikční analýza chromozomální DNA - srovnání počtu a velikostí fragmentů po působení RE (univerzálně aplikovatelná, citlivá, snadná metoda) ribotypizace restrikční analýza plazmidů -extrakce, separace (není univerzální x rychlá) pulzní gelová elektroforéza - velké fragmenty DNA, analýza fragmentů bez nutnosti hybridizačních metod polymerázová řetězová reakce amplifikační metoda, znásobení specifických sekvencí DNA nebo RNA, detekce (opakování cyklu denaturace, připojení primerů, prodloužení, znovu denaturace a tyto kroky se mnohonásobně opakují) PCR nahrazuje biologickou amplifikaci (enzymatická duplikace NK in vitro)

18 -významná úloha v klinických mikrobiologických laboratořích - detekovat a charakterizovat organizmus odpovědný za onemocnění -využití tam, kde způsobující agens je málo aktivní (nebylo izolováno) -aplikace adaptovány nejen pro výzkum, ale i k diagnostickým účelům Sonda nukleové kyseliny Enzym Enzym Přidání značené sondy DNA Enzym Zahřátí Cílová DNA Denaturovaná (jednořetězcová) DNA Enzym Sonda DNA hybridizovaná scílovou DNA Sondy NK = segmenty DNA nebo RNA, které byly označeny (komerčně připravované )

19 DNA sondy - značeny radioaktivním fosforem; nyní -jiné látky (enzymy, chemiluminescentní molekuly, látky afinitní povahy) -po hybridizaci jsou imunologicky detekovány Výhody použití sond: - zkracuje se čas nezbytný kidentifikaci náročného mikroorganizmu -laboratoř může zvýšit počet patogenů, které detekuje a identifikuje -umožňuje průkaz agens, které kultivační techniky neumožňovaly -rozlišení biochemicky podobných patogenních a nepatogenních kmenů

20 -založena na stanovitelnýchchemických znacích (metody analytické chemie) -orientuje se primárně na analýzu chemického složení buněčné stěny nebo jen její části vpevné fázi (vlastní masa buněk) přítomnost/nepřítomnost stabilních chemických znaků; poměrné zastoupení profil v tekuté fázi (metabolity, supernatantstráveného kultivačního média) peptidoglykan chemické složení kyseliny teichoové význam u G+ bakterií polární lipidy -fosfolipidy, glykolipidy, fosfoglykolipidy mastné kyseliny cca 100 má význam (nasycené, nenasycené, větvené, hydroxykyseliny); MIDI Sherlock System mykolové kyseliny vbuněčné stěně, vázané na peptidoglykan chinony, steroly, karotenoidní pigmenty polyaminy významné především u termofilních bakterií lipopolysacharidy, cytochromy, bakteriochlorofyly

21 Použitelnost klasifikačních metod

22 Polyfázová taxonomie - taxonomie založená na kombinaci údajů získaných rozmanitými technikami - obsahuje všechny dostupné genotypové, fenotypové a fylogenetické informace - použití jen jedné metody je nedostatečné a je vyžadován mnohostranný přístup tzv. polyphasicapproach

23 Druh -seskupení jednotek (fenotypová podobnost x odlišnost od jinýchseskupení) Fylogenetickádefinicedruhu: skupina příbuzných kmenů (typovýkmen) 70% avyšší DNA-DNAhomologie 16SrDNA jevyšší než 97% shodné fenotypové znaky některé odlišné znaky od jiných skupin

24 Aeromonas spp. = vhodný příklad polyfázového přístupu -popis Bacillus hydrophilus již v roce celosvětově rozšířený rod -patogen x komenzál x saprofyt -velký taxonomický rozvoj Čeleď Aeromonadaceae (1986/1989) dle analýzy 5S rrna Až do r pouze 8 druhů aeromonád (5 patogenních) -pohyblivé -nepohyblivé -psychrofilní

25 -ubikvitérní, OFF, OXI, tyčinkovitý až kokovitýtvar -autochtonní ve vodním prostředí; < letní měsíce -patogenní pro zvířata (široké spektrum); MOT = oportunně patogenní -numerická taxonomie: < 50 fenotypových vlastností -fenon: 80 85% podobnost = bakteriální druh Phenospecies Genomospecies (HGs) DNA-DNA hybridizace - A. salmonicida (jednotná skupina; studenokrevní, prostředí) -MOT+, mezofilní (extrémně heterogenní; klinický materiál)

26 Fenotypová kritéria (90 léta) Aplikace DNA reasociace (HG skupiny) A. hydrophila komplex (Ahy, Abe, Asa, Apo) A. caviae komplex (Aca, Ame, Aeu) A. sobria komplex (Aso, Ave, Asc, Aja, Aal) Aeromonas spp. Mezofilní aeromonády biochemicky značně aktivní Fylogenetická klasifikace cca posledních 10 let

27 < 1991 A. hydrophila A. caviae A. sobria A. schubertii A. veronii A. salmonicida (5 poddruhů?) A. media A. eucrenophila

28 < 1991 A. hydrophila A. caviae A. sobria A. schubertii A. veronii = A. veronii bv. Veronii, A. veronii bv. Sobria A. salmonicida (5 poddruhů?) A. media A. eucrenophila < 1998 A. enteropelogenes (1991) A. ichthiosmia (1991) = A. veronii bv. Sobria (1993) A. allosaccharophila (1992) A. jandaei (1992) A. trota (1992) A. encheleia (1995) A. bestiarum (1996) A. popoffii (1997)

29 < 1991 A. hydrophila ssp. hydrophila, ssp. dhakensis (2002), ssp. ranae (2003) A. caviae A. sobria A. schubertii A. veronii = A. veronii bv. Veronii, A. veronii bv. Sobria A. salmonicida (5 poddruhů?) A. media A. eucrenophila < 1998 A. enteropelogenes (1991) A. ichthiosmia (1991) = A. veronii bv. Sobria (1993) A. allosaccharophila (1992) A. jandaei (1992) A. trota (1992) = A. enteropelogenes (2002) A. encheleia (1995) A. bestiarum (1996) A. popoffii (1997) < XII/2008 A. culicicola (2002) = A. veronii bv. Sobria (2006) A. molluscorum (2004) A. simiae (2004) A. sharmana (2006) =??? A. bivalvium (2007) A. aquariorum (2008) A. tecta (2008)

30 Chybná jména aeromonád: validní jméno neplatnésynonymum < 1995 A. veronii bv. Sobria A. ichthiosmia < 2000 / / > 2000 A. enteropelogenes A. trota A. veronii bv. Sobria A. culicicola (A. veronii bv. Sobria A. allosaccharophila)? A. sharmana K je validních 19 druhů aeromonád

31 Biotypizace aeromonád: - rodová diferenciace (OFF, OXI, Pte, NaC, TWE+GEL,...) - druhová identifikace (MOT, GLG, VPT, ESL, IND, ARG, ARA, SUC, SAL, MAN, ) Komerční soupravy mikrotestů většinou nevhodné (testy, taxony)! Reprodukovatelnost reakcí!!! A. hydrophila komplex: GLG(+), VPT(+), ESL(+) A. caviae komplex: GLG(-), VPT-, ESL(+) A. sobria komplex: GLGd, VPTd, ESL- Chybí jednoznačně rozlišující testy

32 Fenotypová klasifikace: Biotyp, sérologie, FAME, SDS-PAGE Genotypová klasifikace: HG skupiny, Ribotypizace, EricPCR, Multiplex PCR, Fylogenetické analýzy: 16S rdna, gyrb, gyra, rpod, dnaj -nejednotné výsledky pro druhovou diferenciaci -klinický materiál x prostředí

33 Aeromonas spp. = nevzácný původce gastroenteritid??? -komunitní infekce, nozokomiální infekce 70% a více v létě i na podzim oportunně patogenní A. hydrophila ssp. hydrophila: infekce ran, GI trakt A. caviae: GI trakt A. veronii bv. Sobria: spojena s GI traktem a bakteremií < 85% izolátů = HG1, HG5, HG8 Mezofilní kmeny skupiny A. hydrophila, A. caviae, A. sobria

34 Intestinální infekce: Extraintestinálníinfekce: Veterinární zdroj: A. hydrophila (2. nejčastější) A. veronii bv. Sobria (dominantní) A. caviae (děti, starší lidé) A. enteropelogenes A. hydrophila A. veronii bv. Veronii A. veronii bv. Sobria A. jandaei A. schubertii A. enteropelogenes A. bestiarum A. sobria A. salmonicida (poddruhy) Expozice vodnímu prostředí, konzumace mořských živočichů: četnost 0,5-8%

35 Člověk -akutní gastroenteritida -septikemie (JV Asie > svět, imunodeficientní osoby) -infekce ran, oka (chirurgické zákroky, celulitida, myonekrózy) -peritonitida (není vzácná), meningitida -infekce RT, infekce kostí a kloubů (vzácné) Živočichové studenokrevní: osteomyelitis, pneumonie, septikemie, stomatitida, kožní léze a vředy; chovy na farmách teplokrevní: septikemie, pneumonie, peritonitida, různé lokalizované infekce Zvýšený zájem o aeromonády

36 Druhy aeromonád se liší v patogenitě x různá diverzita humánních kmenů a izolátů z prostředí Průkaz patogenů -průkaz LPS; profilů mastných kyselin -immunobloting buněčných proteinů -PCR techniky -sondy NK - dostupná technika = taxonomický nástroj Zlepšení taxonomie = podpoření procesu identifikace objasnění role aeromonád

37 -potencionální indikátor patogenity Faktory svázané s buněčným povrchem -proteiny vnější membrány (Ahy S-vrstva) -lipopolysacharidovýendotoxin (Ahy studenokrevní) Extracelulární faktory virulence -toxiny: hemolyziny (aerolyzin, Aeromonas spp.) cytotoxin enterotoxin (A. hydrophila) -enzymy: chitináza, lipáza, fosfatáza, elastáza, fibrinolyzin, proteázy (poškození tkání), ribonukleáza, fosfolipáza (rozpouští CP-membránu hemolýza) Aeromonas spp. = psychrotrofní mezofilové > patogenní potenciál!

38 Taxonomické hledisko x epidemiologické zhodnocení Fenotypové metody Biotypizace nepostihuje dostatečně rozmanitost mezi kmeny Fagotypizace specializované laboratoře (shodný lysotyp) Sérotypizace somatické i flagelární antigeny SDS-PAGE Složení buněčných MK chromatografická analýza FAME (podobnost) Genotypové metody Analýza plazmidů malý epidem. význam (20-70% má plazmid) PFGE REA, RFLP (ribotypizace ) Selektivní amplifikace restrikčních fragmentů (AFLP) detekuje DNA polymorfizmus; AFLP skupiny = DNA HGs Sekvencování 16S rrna genů geny kódující RNA malých podjednotek ribozómů (16S rdna) mají relativně konzervativní nukleotidové sekvence a přesně odráží bakteriální fylogenezi (použito v reklasifikaci aeromonád) Ribotypizace univerzální nástroj pro epidemiologická šetření -restrikční profil rrna genů je v souladu s údaji DNA reasociace

39 Typizace bakteriálních izolátů ribotypizace selektivní hybridizace a následná detekce restrikčních fragmentů genomové DNA nesoucích geny pro rrna buněčná kultura izolace DNA štěpení restrikčním enzymem gelová elektroforéza přenos na membránu hybridizace a detekce fragmentů obsahujících geny pro rrna Aeromonas: EcoRI, HindIII, PvuII 700< ribotypizací

40 RiboPrinterMIS - EcoRInebo PvuII -sonda rrnb operon E.coli -procesribotypizace8hodin;standardnostxcena

41 Pigmentující aeromonády: biotyp, ribotyp, FAME A. hydrophila ssp. dhakensis: biotyp, ribotyp, FAME (A. encheleia: biotyp, ribotyp, SDS-PAGE, ERIC-PCR) A. popoffii: biotyp, ribotyp, RiboPrinter, SDS-PAGE, MALDI A. hydrophila komplex: biotyp, ribotyp, m-pcr Aquitalea sp.: biotyp, ribotyp, 16S rrna (sekvencování)

42 Biotypizace: A. hydrophilakomplex A. sobria komplex (A. veronii bv. Sobria) A. caviaekomplex A. caviaekomplex > A. hydrophilakomplex > A. veronii bv. Sobria Ribotypizace: EcoRI, (HindIII), PvuII FAME A. hydrophilakomplex multiplex-pcr (ISAP, 2005)

43 Dendrogramhybridizačních profilů (PvuII) komplexu A. hydrophilaz humánního klinického materiálu podobnost, % A. hydrophila komplex. A. hydrophila komplex. A. hydrophila komplex. A. hydrophila komplex. A. hydrophila komplex. A. hydrophila komplex. A. hydrophila komplex. A. popoffii. A. hydrophila komplex. A. hydrophila komplex A. hydrophila ssp. ranae. A. bestiarum. A. hydrophila komplex. A. hydrophila komplex. A. hydrophila komplex A. hydrophila ssp. hydrophila. A. hydrophila komplex A. hydrophila ssp. dhakensis A. hydrophila ssp. hydrophila. A. hydrophila komplex. A. bestiarum. A. hydrophila komplex. A. hydrophila komplex. A. hydrophila komplex. A. hydrophila komplex. A. hydrophila komplex. A. hydrophila komplex. A. hydrophila komplex. A. hydrophila komplex. A. hydrophila komplex. A. hydrophila komplex λ marker EcoRI/ HindIII P1030 P1076 P1088 P1017 P1092 P1100 P1054 CCM 4708 T P1173 P1163 CCM 7147 T CCM 4707 T P1000 P1015 P1066 CCM 7232 T P1007 CCM 7146 T CCM 4528 P1094 P1050 P1002 P1070 P1011 P1020 P1084 P1003 P1096 P1074 P1026 P ,227 5,148 4,973 4,269 3,530 2,027 1,904 1,587 1, (bp)

44 21,227 5,148 4,973 4,269 3,530 2,027 1,904 1,587 1, (bp) Dendrogramhybridizačních profilů (PvuII) kmenů Aeromonas veronii bv. Sobriaz humánního klinického materiálu podobnost, % A. enteropelogenes (= " A. trota") A. enteropelogenes A. jandaei A. veronii biov. Sobria (= " A. culicicola ") A. veronii bv. Sobria A. veronii bv. Sobria A. veronii bv. Sobria A. veronii bv. Sobria A. veronii bv. Sobria A. veronii bv. Sobria A. veronii biov. Veronii A. veronii bv. Sobria A. veronii biov. Veronii A. veronii bv. Sobria A. veronii bv. Sobria A. veronii bv. Sobria A. veronii bv. Sobria A. veronii bv. Sobria A. veronii bv. Sobria A. veronii bv. Sobria A. veronii bv. Sobria A. veronii bv. Sobria A. veronii biov. Sobria CCM 4368 CCM 7243 T CCM 4355 T CCM 7323 P1021 P1031 P1036 P1093 P1159 P1058 CCM 4359 T P1161 CCM 4360 P1090 P1012 P1082 P1027 P1044 P1013 P1069 P1004 P1157 CCM 1254 A. veronii bv. Sobria A. allosaccharophila A. sobria komplex A. allosaccharophila (referenční-gyrb) A. veronii biov. Sobria A. veronii bv. Sobria A. sobria A. schubertii λ marker EcoRI/ HindIII P1091 CCM 4363 T P1051 CCM 4531 CCM 1242 P1072 CCM 2807 T CCM 4356 T

45 Průkaz Aeromonashydrophila subsp. dhakensis - humánní klinický materiál Ribotypizace(EcoRI) a FAME; NE biotyp -průkaz izolátů jako původců akutního průjmu (importovaná nákaza) -CCM 7329

46 Dendrogram hybridizačních profilů (EcoRI) a shluková analýza FAME dvou izolátů Aeromonas hydrophila subsp. dhakensis z akutních průjmů podobnost, % A. hydrophilassp. hydrophila CCM A. hydrophilassp. hydrophila CCM 7232 T. A. hydrophilassp. ranae CCM 7147 T. A. hydrophilassp. dhakensis P 1097 = CCM A. hydrophilassp. dhakensis. A. hydrophilassp. dhakensis P 1165 CCM 7146 T. A. bestiarum CCM 4707 T λ marker EcoRI/ HindIII 21,227 5,148 4,973 4,269 3,530 2,027 1,904 1, (bp) C 13:0 a C 17:1 ω8c

47 Pigmentující izolátyz různých typů vod Biotypizace: fenon A. media, A. caviae, Aeromonas sp. Ribotypizace(EcoRI, HindIII, PvuII); FAME?atypické izoláty? gyrbsekvencování A. media (MOT) A. allosaccharophila (PIG) (Folia Microbiol, 2008)

48 Dendrogramhybridizačních profilů (HindIII) pigmentujících izolátů aeromonádz vod podobnost, % A. salmonicida A. salmonicidasubsp. pectinolytica A. salmonicidasubsp. salmonicida A. salmonicidasubsp. salmonicida A. media A. media A. media A. media A. media A. media A. media A. media A. media A.allosaccharophila λ marker EcoRI/ HindIII P192 CCM 7020 T CCM 1307 CCM 1318 CCM 3654 CCM 3653 T P189 P186 P185 P183 P188 P184 P190 P187 hydrophila group A. media cluster 21,227 5,148 4,973 4,269 3,530 2,027 1,904 1,587 1,375 (bp)

49 SUC-negativní izoláty (A. popoffii, A. jandaei, A. schubertii, A. hydrophila ssp. ranae, A. enteropelogenes, A. encheleia, A. eucrenophila) ESLbiotypizace ribotypizace(3 RE, RP) SDS-PAGE MALDI sekvencování(16s rdna, gyrb) DNA-DNA hybridizace ESL+ biotypizace(fenon) ribotypizace(3 RE) SDS-PAGE sekvencování(gyrb) doplňující popis A. popoffii (ISAP, 2005) (Let Appl Microb, 2008)

50 Dendrogramy hybridizačních profilů SUC-negativních izolátů aeromonád z vod A. trota CCM 4368 A. jandaei CCM 4355 Aeromonas sp. SUC- P 668 Aeromonas sp. SUC-Ino+ P 664 Aeromonas sp. SUC-Ino+ P 657 Aeromonas sp. SUC-Ino+ P 671 Aeromonas sp. SUC-Ino+ P 669 Aeromonas Aeromonas Aeromonas sp. SUCsp. SUCsp. SUC- P 661 P 667 P 660?nový taxon? Aeromonas sp. SUC- P 666 Aeromonas sp. SUC- P 655 Aeromonas sp. SUC- P 658 A. popoffii CCM 4708 A. eucrenophila CCM 4354 A. hydrophila ssp. ranae CCM 7147 A. schubertii CCM EcoRI Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas sp. SUCsp. SUCsp. SUCsp. SUC-Ino+ sp. SUC-Ino+ P 660 P 661 P 667 P 671 P 664 HindIII Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas sp. SUC-Ino+ sp. SUC-Ino+ sp. SUCsp. SUCsp. SUCsp. SUC- P 669 P 657 P 668 P 655 P 658 P 666

51 21,22 7 5,148 4,973 4,269 3,530 2,027 1,904 1,587 1, (bp) Dendrogramhybridizačních profilů (PvuII) SUC-negativních izolátů aeromonádz vod podobnost, % A. hydrophilassp. hydrophila A. hydrophilassp. hydrophila A. hydrophilassp. dhakensis Aeromonas sp. Aeromonas sp. Aeromonas sp. A. bestiarum A. popoffii atyp. A. popoffii A. popoffii (ref.-gyrb) A. popoffii A. popoffii A. popoffii A. popoffii A. popoffii A. popoffii A. popoffii (ref.-16s rdna) A. popoffii A. popoffii (referenční) A. popoffii A. popoffii A. popoffii (ref.-gyrb) A. popoffii A. popoffii A. popoffii A. popoffii A. hydrophilassp. ranae A. popoffii A. popoffii A. popoffii A. popoffii A. popoffii (ref.-16s rdna) A. popoffii (referenční) A. popoffii A. popoffii A. popoffii A. popoffii A. popoffii A. popoffii A. popoffii A. popoffii A. popoffii atyp. A. sobria A. enteropelogenes A. sobria komplex A. veronii biov. Sobria A. veronii biov. Veronii A. jandaei A. allosaccharophila A. schubertii λ marker EcoRI/ Hin diii CCM 2280 CCM 7232 T CCM 7146 T P2338 P2340 P2335 CCM 4707 T P667 P1640 P2189 P1663 P1905 P1754 P1770 P1662 P1761 P666 P1461 CCM 7330 (= P661) P660 CCM 4708 T CCM 7332 (= P671) P669 P664 P2975 P657 CCM 7147 T CCM 4961 (=P1638) P1807 P2976 P655 P658 CCM 7331 (= P668) P1136 P1762 P1641 P2175 P C P2246 P2250 P2249 P1639 CCM 2807 T P924 P1703 CCM 1254 CCM 4359 T CCM 4355 T CCM 4363 T CCM 4356 T - nutnost geograficky rozmanitých izolátů - časové hledisko (rozšíření spektra izolátů) Potvrzení izolátů jako A. popoffii: -sekvencování -DNA reasociace

52 Dendrogram (RiboPrinter) SUC-negativních izolátů aeromonád z vod podobnost, % Kb A. popoffii P1761 A. popoffii P1762 A. popoffii P1638 A. popoffii P2249 A. popoffii P1807 A. popoffii P1461 A. popoffii P657 A. popoffii P664 A. popoffii P669 A. popoffii P1639 A. popoffii P660 A. popoffii CCM 7330 A. popoffii P666 A. popoffii P1662 A. popoffii P1640 A. popoffii P2189 A. popoffii P1905 A. popoffii P1770 A. popoffii P658 A. popoffii P2175 A. popoffii CCM 4708 T A. popoffii CCM 4708 A. popoffii P2250 A. sobria komplex P1703

53 Dendrogram (MALDI) SUC-negativních izolátů aeromonád z vod A. popoffii CCM 7330 a.i m /z -ionizace molekul -separace iontů -detekce

54 Dendrogramprofilů celobuněčnýchproteinů SUC-negativních izolátů aeromonádz vod Podobnost, % A. popoffii P1639 A. popoffii P1640 A. popoffii P2250 A. popoffii P2245 A. popoffii P2246 A. popoffii P2249 A. popoffii P2175 A. popoffii P1905 A. popoffii P2189 A. popoffii P1807 A. popoffii P1762 A. popoffii P658 A. popoffii P668 A. popoffii P655 A. popoffii P1761 A. popoffii P1461 A. popoffii P1638 A. popoffii P1136 A. popoffii P1641 A. popoffii P1754 A. popoffii P1770 A. popoffii P669 A. popoffii P657 A. popoffii P671 A. popoffii CCM 4708 T A. popoffii P664 A. popoffii P667 A. popoffii P661 A. popoffii P660 A. popoffii P666 A. encheleia P1669 A. encheleia P1767 A. encheleia P1769 A. encheleia P1700 A. encheleia CCM 4582 T Marker molekulové hmotnosti Shluky shodné s ribotypizací Potvrzení vnitrodruhové variability A. popoffii Jednoznačné odlišení A. encheleia (kda)

55 Dendrogram hybridizačních profilů SUC-negativních izolátů A. encheleia/a. eucrenophila z vod podobnost, % A. eucrenophila A. eucrenophila atyp. A. eucrenophila atyp. A. eucrenophila atyp. A. encheleia atyp. A. eucrenophila A. encheleia A. encheleia atyp. A. encheleia (referenční-gyrb) A. encheleia A. encheleia (referenční-gyra) A. encheleia A. encheleia (referenční-gyra) A. encheleia A. encheleia λ marker EcoRI/ HindIII CCM 4354 T P2530 P1802 P1819 P1700 P2371 CCM 4582 T P2970 P2953 CCM 7406 (= P1669) CCM 7407 (= P1767) P1769 CCM 7408 (=P1688) P2986 P ,227 5,148 4,973 4,269 3,530 2,027 1,904 1,587 1, (bp)

56 -Izolátyz prostředí jsou variabilnější než z klinického materiálu -Jedna metoda, nebo neověřený screening, jsou nevyhovující -I spolehlivá metoda nemusí vést ke správnému výsledku: Ribotypizace Identifikace A sobria komplex; jedinečný ribotyp Nová aeromonáda? Aquitalea sp. CCM 7557 (IUMS, 2008)

57 Dendrogram hybridizačních profilů (PvuII) kmenů komplexu Aeromonas veronii bv. Sobria z vod Similarity (%) A. schubertii A. schubertii A. jandaei A. sobria A. sobria A. veroniibiov. Sobria (" A. ichthiosmia") A. veronii biov. Sobria A. veronii biov. Veronii A. veronii biov. Veronii A. sobria A. veronii biov. Sobria A. allosaccharophila A. allosaccharophila A. sobria A. enteropelogenes A. enteropelogenes(" Atrota. ") Aquitalea sp. CCM 4356 T CCM 4357 CCM 4355 T P1760 P2315 CCM 7244 CCM 1254 CCM 4359 T CCM 4360 CCM 2807 T CCM 1242 CCM 4363 T CCM 4531 CCM 4529 CCM 7243 T CCM 4368 P1297 Lambda DNA EcoRI / HindIII Marker 21,227 5,148 4,973 4,269 3,530 2,027 1,904 1,587 1, (bp) Aquitalea sp. CCM 7557 (=P1297) potvrzena sekvencováním16s rdna

58 Polyfázová taxonomie, fylogenetická příbuznost DNA Celková DNA: % obsah G+C restriční profil (RFLP, PFGE) velikost genomu DNA reasociace Úseky DNA: PCR metody ((rep-pcr, RAPD, AFLP) ribotypizace DNA sondy DNA sekvencování RNA RNA sekvencování analýza nízkomolekulárních RNA plazmidová DNA Chemotaxonomické znaky mastné kyseliny (FAME) mykolové kyseliny polární lipidy chinony Proteiny elektroforetický profil celobuněčných peoteinů enzymový profil (MLEE) Fenotyp morfologie biochemie a fyziologie (API, Biolog) sérologie (upraveno podle Vandama a kol., 1996)

59 - vzájemná syntéza získávání nových poznatků - a jejich uplatňování v praxi ( musíme vědět a znát, co chceme hledat ) CÍL -přesnější stanovení mikrobiálního agens -zrychlení celého identifikačního procesu Popis nového taxonu MUSÍ postihovat vnitrodruhovou diverzitu -nekompletní popis: Candidatus -popis dle jednoho kmene: species proponenda

60 Děkuji za pozornost.