MALDI-TOF MS typizace rodu Aeromonas Andrea Teshim 1,4

Transkript

1 MALDI-TOF MS typizace rodu Aeromonas Andrea Teshim 1,4 Spoluautoři: RNDr. Ludmila Tvrzová, Ph.D. 1 RNDr. Ivo Sedláček, CSc. 4 Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D. 2 RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. 2 Ing. Matej Lexa, Ph.D. 3 (1) Ústav experimentální biologie,, Přírodovědecká fakulta MU, Brno, ČR (2) Oddělení funkční genomiky a proteomiky,, Přírodovědecká fakulta MU, Brno, ČR (3) Oddělení informačních technologií,, Fakulta informatiky MU, Brno, ČR (4) Česká sbírka mikroorganismů,, Přírodovědecká fakulta MU, Brno, ČR

2 Hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight MS Analytická technika Rychlá chemotaxonomie založená na detekci biomarkerů Výhoda MALDI MS : Rozlišení chemotaxonomicky a fenotypicky neodlišitelných druhů (Př. B. anthracis, B. cereus, druhy rodu Listeria) Rod Aeromonas: shoda v sekvencích 16S rrna: 97,8 100 % Převzato: Martinez-Murcia 1999

3 Rod Aeromonas Aeromonas hydrophila druhy (A. hydrophila, A. caviae, A. salmonicida, A. sobria) druhů (Stackebrandt, Donohue a kol. 2005) Nová čeleď Aeromonadaceae mnoho společných biochemických znaků (Abbott 2003) heterogenita a genetická proměnlivost v rámci rodu (bv. A. media, ssp. A. salmonicida) Metody genotypizační: DNA-DNA hybridizace; analýza 16S rrna MLST: 16S rdna, reca, chia, gyrb MALDI-MS chemotaxonomie: unikátní markery Významná je autentizace a identifikace kmenů

4 Častý izolát klinického a veterinárního materiálu, podmíněný patogen Maso, mléko, sýry, ryby, zelenina, plody moře, vodní prostředí» klinika: sekreční faktory: cytotoxiny, enterotoxiny, lipázy aerolyzin, proteázy, siderofory povrchové faktory: fimbrie, membr.proteiny, S vrstva, pouzdro, LPS A. caviae mírné průjmy, Lac+, nehemolitická A. hydrophila - dyzenterie A. jandaei, A. trota, A. schubertii, A. veronii (bv. veronii a bv.sobria) Infekce ran, septikémie, gastroenteritidy, endokarditidy, meningitidy, pneumonie, osteomyelitidy, konjunktivitidy Ecthyma Gangrenosum Celulitis Rezistence k ampicilinu, penicilinu (inducibilní β-laktamázy), chlor, desinf.l., biofilm, 4 C» Diagnostika: selektiv. půda s Amp, TCŽS, alkal.pepton.voda, KA - mukózní kolonie, ox+, kat+, lac (mimo A.caviae), Glu+, Gas+, stringβ hemol. 4/20 Myonecrosis

5 MALDI MS analýza Destička MALDI Spot na MALDI desce Vzorky:~ buňky: celobuněčné preparáty- prostředí, klinika, potraviny kokrystalizace matrice se vzorkem N 2 laser 337nm excitace UV, absorbce E laseru hluboké vakuum 10-6 Pa Ionizace molekul uvolnění protonovaných molekul [M+H] + analytu Schéma metody

6 Cíle Ověřit diferenciační schopnost MALDI-MS pro bakterie rodu Aeromonas na typových kulturách a izolátech z prostředí Snaha získat : reprodukovatelná spektra - odlišnosti mezi kmeny --> autentizace, identifikace a.i A. media 3653T signál = hodnota m/z m /z

7 Metodika Kultivace 45ti kmenů Aeromonas (CCM) Optimalizace přípravy a analýzy vzorku suspenze voda : ACN matrice: sdhb (20 mg/ml v 20%ACN, 1%TFA) MALDI-TOF analýza Oddělení funkční genomiky a proteomiky Bohunice, Reflex IV (Bruker) Úprava a zpracování spekter (= zobrazení ionizovatelnýchčástic bakteriálního proteomu v přítomnosti matrice) Klastrová analýza Výsledný dendrogram

8 Optimalizace metody Test typu a okyselení matrice (sdhb v 20% ACN s 1% TFA) Medium, hustota suspenze vzorku (2 µl buněk µl voda : ACN 1:1) Test reprodukovatelnosti Vliv délky zamražení, kultiv. teplota a.i O bjem a hustota vzorku 7156 T _300 ul_1 ul 7156 T _500 ul_2 ul a.i P. putida CCM 7156 T sdhb FA SA CHCA m/z Test vlivu matrice A.encheleia prodloužená kultivace (8 dní) A.encheleia standardní kultivace T _1000 ul_2 ul T _1000 ul_1 ul m/z Test optimální hustoty suspenze Testy reprodukovatelnosti

9 a.i Srovnání srovnání uvnitř rodu A. caviae A. trota A.allosaccharophila A. schuberttii A. eucrenophila A. sobria A.encheleia A.encheleia A.popoffii A.popoffii A.popoffii m/z

10 a.i Srovnání mezi kmeny A. popoffii CCM A. hydrophila CCM A. popoffii CCM A. popoffii 400 CCM 660 vz.i A. popoffii CCM 660 vz.ii m/z

11 Srovnání mezi rody a.i A. hydrophila ssp.hydrophila CCM 7146 T Pseudomonas aeruginosa CCM 1960 T 500 Stenotrophomonas 0 m/z

12 (Donohue et al., 2005)

13 Shrnutí Optimalizace metody na sbírkových kmenech pro identifikaci izolátů Zisk reprodukovatelných spekter z různých kultivací za stejných podmínek srovnatelné výstupy Vytvoření dendrogramu příbuznosti 46ti kmenů rodu Aeromonas pomocí klastrové analýzy Byl stanoven MS profil rodu Aeromonas ( Da, Da, Da, Da, Da, Da, Da, Da, Da, Da)

14 Výhody Vysoká rychlost a jednoduchá příprava vzorku Malý objem vzorku; šetření chemikáliemi Vysoce reprodukovatelný výstup Rychle vyvíjející se metodika tvorby databází Možnost srovnání s informacemi sekvenování genomu, proteinů Možnost kombinace s dalšími metodami (off-line separace ELFO, HPLC)

15 Využití MALDI-MS v mikrobiologii Klinická diagnostika Bacillus (Warscheid a Fenselau 2004), Campylobacter (Mandrell a kol. 2005), Clostridium, Corynebacterium, Escherichia (Holland a kol. 1996). Haemophilus rychlý screening izolátů nemocničních kmenů (Haag a kol. 1998). Dále Helicobacter (Nilsson 1999, Demirev a kol. 2001), Legionella (Keys a kol. 2004), Mycobacterium (Pignone a kol. 2006). Salmonella (Leuschner a kol. 2003), Streptococcus (Kumar a kol. 2004, Keys a kol. 2004), Staphylococcus (Edwards-Jones a kol. 2000, Walker a kol. 2002) U rodu Staphylococcus byly dokonce rozlišeny methicilin-citlivé a methicilin-rezistentní kmeny (Walker a kol. 2002) Při využití referenčních spekter je možno identifikovat neznámý vzorek (Lynn a kol 1999) Taxonomie mikroorganismů, enviromentální studie, potravinářství Analýza specifických bakteriálních proteinů: rekombinantní proteiny, faktory virulence, enzymy, metabolity, proteiny sporových stěn (Hathout a kol. 1999, Ryzhov a kol. 2000) a S-vrstvy, významné je studium bakteriocinů (Hindre a kol. 2003), peptidové mapování Sekvenování bakteriálních nukleových kyselin (Marvin a kol. 2003, Lay 2001)

16 Poděkování RNDr. Ludmila Tvrzová, PhD. vedoucí práce RNDr. Ivo Sedláček, CSc. - odborná pomoc při práci Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D. - analýza vzorků, hodnocení spekter tvorba výstupních dat RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. konzultant Ing. Matej Lexa, Ph.D. statistické zpracování výsledků