Analýza genů MYOD rodiny, IGF2 a myostatinu v produkci kvalitního vepřového masa

Transkript

1 MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Analýza genů MYOD rodiny, IGF2 a myostatinu v produkci kvalitního vepřového masa Dizertační práce Brno 2007 Ing. Jan Verner

2 1 Doktorand: Ing. Jan Verner Školitel: prof. Ing. Jiří Kuciel, CSc. ( ) doc. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D. ( ) Studijní program: 4103 V - Zootechnika Studijní obor: 1515 V Molekulární biologie a genetika živočichů Předložená dizertační práce byla vypracována v letech na Ústavu genetiky zvířat, později přejmenovaném na Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat, Agronomické fakulty Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně za podpory projektů GA ČR 523/03/H076 a FRVŠ 239/2005.

3 2 Upřímné díky patří těmto osobám: prof. Ing. Jiřímu Kucielovi, CSc. doc. RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D. prof. Ing. Josefu Dvořákovi, CSc....kolektivu ÚMFGZ, se všemi svými báječnými a nezapomenutelnými lidičkami, kteří v pravý moment dokázali vytvořit tu správnou atmosféru, vykouzlit úsměv na tvářích jiných a zásobovat někdy truchlivé, neoblomné a v napjatém stavu nervy udržující vědecké bádání notnou dávkou humoru a zdravého sebevědomí......šárce za morální podporu, neutuchající smysl pro humor a věčnou inspiraci...

4 3 Před tím, co za mnou jde, prchám. Za tím, co prchá, jdu sám. Quod sequitur, fugio, quod fugit, ipse siquor. Ovidius

5 4 OBSAH 1 Úvod 9 2 Cíle práce 11 3 Literární přehled Maso Definice Embryonální vývoj svalstva Chemické a biochemické složení masa Produkce masa Plemena prasat České bílé ušlechtilé - mateřská pozice Česká landrase Duroc Genom prasete QTL lokusy kvantitativních znaků Mapování QTL Postup při mapování QTL Přehled QTL na chromozomech se studovanými geny SSC SSC SSC SSC Přehled studovaných genů Gen MYOD Gen MYOG Gen MYF Gen MYF Gen IGF Imprinting genu IGF Polymorfismus genu IGF Gen GDF Metody molekulární genetiky 34

6 Polymerázová řetězcová reakce (PCR) Základní komponenty amplifikačního procesu Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) PCR RFLP PCR v reálném čase (real-time PCR) Alelická diskriminace Elektroforéza Gelová elektroforéza 38 4 Materiál a metodika Zvířata Jatečné ukazatele Ukazatele kvality masa Izolace DNA PCR Podmínky cyklování Použité primery Složení reakčních směsí RFLP Elektroforéza Optimalizace metody alelické diskriminace Asociační analýza Statistický model 48 5 Výsledky PCR produkty a jejich štěpení Alelická diskriminace Frekvence alel a genotypů Sledované znaky jatečné hodnoty u plemene ČBU Sledované znaky jatečné hodnoty u plemene ČL Sledované znaky kvality masa u plemene ČBU Sledované znaky kvality masa u plemene ČL Ukazatelé jatečné hodnoty a kvality masa podle pohlaví 63 6 Diskuze Frekvence genotypů a alel 64

7 6 6.2 Asociační analýza Alelická diskriminace 71 7 Závěr 73 8 Shrnutí 74 9 Summary Seznam použitých zkratek Seznam literatury Životopis Publikované výsledky Příloha 95

8 7 SEZNAM TABULEK Tab. 1 Přehled mapování QTL Tab. 2 Podmínky PCR Tab. 3 Použité primery Tab. 4 Původní koncentrace použitých reagencií Tab. 5 Reakční směsi PCR pro jednotlivé geny I Tab. 6 Reakční směsi PCR pro jednotlivé geny II Tab. 7 Reakční směsi RFLP pro jednotlivé geny Tab. 8 Použité restrikční endonukleasy Tab. 9 Přehled navržených primerů pro Real-Time PCR Tab. 10 Reakční směs Real-Time PCR pro gen IGF2 Tab. 11 Podmínky Real-Time PCR Tab. 12 Frekvence alel v genech MYOD1, MYOG a MYF5 Tab. 13 Frekvence alel v genech MYF6, IGF2 a GDF8 Tab. 14 Absolutní (n) a relativní (R) frekvence genotypů MYOD1, MYOG a MYF5 Tab. 15 Absolutní (n) a relativní (R) frekvence genotypů MYF6, IGF2 a GDF8 Tab. 16 ČBU: LSM znaků jatečné hodnoty pro genotypy MYOD1 a MYOG Tab. 17 ČBU: LSM znaků jatečné hodnoty pro genotypy MYF5 a MYF6 Tab. 18 ČBU: LSM znaků jatečné hodnoty pro genotypy IGF2 a GDF8 Tab. 19 ČL: LSM znaků jatečné hodnoty pro genotypy MYOD1 a MYOG Tab. 20 ČL: LSM pro znaky jatečné hodnoty pro genotypy MYF6 Tab. 21 ČL: LSM pro znaky jatečné hodnoty pro genotypy IGF2 a GDF8 Tab. 22 ČBU: LSM znaků kvality masa pro genotypy MYOD1 a MYOG Tab. 23 ČBU: ČBU: LSM znaků kvality masa pro genotypy MYF5 a MYF6 Tab. 24 ČBU: LSM znaků kvality masa pro genotypy IGF2 a GDF8 Tab. 25 ČL: LSM znaků kvality masa pro genotypy MYOD1 a MYOG Tab. 26 ČL: LSM znaků kvality masa pro genotypy MYF6 a IGF2 Tab. 27 Průměrné hodnoty jednotlivých plemen podle pohlaví

9 8 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1 Utváření svalového vlákna Obr. 2 Karyotyp prasete Obr. 3 Graf produkce vepřového masa v tunách Obr. 4 Ukázka QTL mapy 5. chromozomu Obr. 5 Diagram prasečího chromozomu 2 (SSC2) Obr. 6 Diagram prasečího chromozomu 9 (SSC9) Obr. 7 Diagram prasečího chromozomu 5 (SSC5) Obr. 8 Princip metylace Obr. 9 Diagram prasečího chromozomu 15 (SSC15) Obr. 10 Duálně značené oligonukleotidové sondy Obr. 11 Izolovaná DNA Obr. 12 Část sekvence intronu 3 s vyznačenými primery, sondami a mutací Obr. 13 MYOD1 PCR produkty délky 998 bp Obr. 14 Štěpení MYOD1 enzymem DdeI Obr. 15 MYOG PCR produkty délky 353 bp Obr. 16 Štěpení MYOG enzymem MspI Obr. 17 MYF5 PCR produkty délky 1200 bp Obr. 18 Štěpení MYF5 enzymem HpaII Obr. 19 MYF6 PCR produkty délky 379 bp Obr. 20 Štěpení MYF6 enzymem BseRI Obr. 21 IGF2 PCR produkty délky 1600 bp Obr. 22 Štěpení IGF2 enzymem NciI Obr. 23 GDF8 PCR produkty délky 1027 bp Obr. 24 Štěpení GDF8 enzymem DraI Obr. 25 Alelická diskriminace

10 9 1 ÚVOD V produkci kvalitního vepřového masa převládají hybridizační programy, jejichž cílem je produkce jatečných prasat s optimalizovanými užitkovými znaky z hlediska jejich odchovu a výkrmu, zpeněžování a následně i technologického zpracování v masném průmyslu. Základním prvkem při uplatňování hybridizačních programů je rozdělení populace prasat na mateřská a otcovská plemena se specifickou úlohou ve šlechtění. Během posledních dvou desetiletí byly ve šlechtění úspěšně uplatněny sofistikované metody predikce plemenné hodnoty zvířat na základě fenotypové hodnoty, odhalující pouze aditivní část genotypu, tedy geny přenášející se na potomstvo. Pokud je pro užitkové vlastnosti znám koeficient dědivosti, je genetický základ jedinců spolehlivou reflexí genů. Avšak užitkovost zvířat není ovlivňována pouze geny s aditivním účinkem, ale také interakcí mezi nimi. Jedním ze základních předpokladů efektivní výroby jatečných prasat je používání výkonného genofondu. Molekulární genetika (technologie DNA) je schopna odhalit a identifikovat tzv. genetické markery, které mohou zlepšit odhad genetického potenciálu zvířat, protože jsou spojeny s oblastmi genů na chromozomech, které způsobují genetickou proměnlivost. Tyto markery slouží ke zlepšení odhadu genetické hodnoty zvířat a zvýšení selekčního zisku, což ve svém výsledku jednoznačně vede ke zvýšení ekonomického zisku. Účinné šlechtitelské programy jsou charakterizovány selekcí jedinců v raném věku, což vede ke zkrácení generačního intervalu a k rychlejšímu genetickému zlepšení plemen a linií za rok (Jakubec et al., 2002). Šlechtění v chovu prasat je zaměřeno na ekonomickou produkci kvalitního masa s vysokou nutriční hodnotou. Kvalita masa je geneticky determinována polygeny a jednotlivé ukazatele s výjimkou obsahu intramuskulárního tuku se vyznačují nízkými hodnotami koeficientů dědivosti. Kromě polygenů ovlivňují značnou část variability jednotlivých ukazatelů kvality masa také geny s velkým účinkem (Kuciel a Lahučký, 1996). Mnoho široce používaných komerčních plemen, jako jsou například landrace nebo large white, bylo intenzívně šlechtěno pro libové maso a rychlý růst, což dobře umožňuje studium genů kontrolujících tučnost a intenzitu růstu (Berg, 2006).

11 10 Porovnání souvislostí mezi genovými markery a jejich přímou asociací s produkcí vepřového masa přináší šlechtitelům a všem ostatním chovatelům, majících zájem na zvyšování užitkovosti prasat, hodnotný poznatek, jak dosáhnout cílených změn, zaměřených na požadavky spotřebitelů. Celá tato problematika se opírá o kvalitní genetickou základnu v chovu prasat, která je předpokladem dosažení optimálních výsledků šlechtitelské práce.

12 11 2 CÍLE PRÁCE Mezi vytyčené cíle této práce patřilo prostudování nejnovější literatury zabývající se tématem studia kandidátních genů v masné užitkovosti prasat a internetových databází (ArkDb, EMBL a jiné), nashromáždění vzorků DNA prasat plemen české bílé ušlechtilé, česká landrase a duroc ze stanice kontroly výkrmnosti a jatečné hodnoty a počítačové zpracování databáze těchto vzorků. U těchto plemen bylo cílem určit polymorfní varianty u genů tzv. MYOD rodiny, IGF2 a GDF8 a vyhodnotit jejich potenciální vliv na znaky jatečné hodnoty a kvality masa. U genu IGF2 bylo nadstandardním cílem popsat metodiku detekce polymorfismu, založenou na PCR v reálném čase. Práce tak měla vyhodnotit komplexnější soubor genů pro masnou užitkovost prasat.

13 12 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED Produkce masa úzce souvisí s růstem zvířat, který je považovaný za dynamický proces probíhající během celého života. Růst je složitým znakem masné užitkovosti, je propojen se všemi životními pochody a lze ho sledovat u jednotlivých zvířat i celých populací. Zvyšování živé hmotnosti zvířat je souhrnným vyjádřením přírůstku jednotlivých tělesných tkání, z nichž má při hodnocení masné užitkovosti největší význam hmotnost svaloviny a tuku. Intenzita růstu těchto tělesných tkání je nejvýznamněji ovlivňována věkem zvířete, plemenem, užitkovým typem a technologií chovu (Steinhauser et al., 2000). Co do značné míry ovlivňuje zejména cenu produktu a konzumaci, je jatečná hodnota a kvalita masa. Jedná se o produkci libového masa, které je v optimálním poměru k tuku a kostem. Při všech formách výkrmu je tedy požadován co největší stupeň osvalení, kvantitativně daný poměrem maso : tuk. Jatečná výtěžnost je v principu závislá na osvalení a jatečné zralosti zvířat. Za proměnlivost této vlastnosti jsou zodpovědné jednak genetické faktory a jednak faktory vnějšího prostředí. Komerční hodnota jatečného trupu závisí v podstatné míře na jeho velikosti, struktuře a složení (Jakubec et al., 2002). S produkcí masa úzce souvisí diferenciace zejména u příčně pruhované svaloviny, která je podle výsledků analýz u prasat ukončena ve věku kolem 87 dní. Determinace svalových vláken se ukončuje již před narozením. Růst svalů probíhá převážně hypertrofií vláken, tj. jejich zvětšováním, přičemž selata mají, na rozdíl od ostatních druhů, před narozením svalová vlákna nejjemnější a na konci růstu zase nejsilnější. Tvorba masa u hospodářských zvířat je dána počtem a velikostí svalových vláken tvořících se během embryonálního vývoje. Podle současných studií je patrné, že zvířata s větším počtem svalových vláken produkují více masa lepší kvality. Je zajímavé, že počet svalových vláken přítomných u prasete při narození určuje maximální růstovou kapacitu libové svaloviny (Handel a Stickland, 1984, 1988). Počet svalových vláken (myofibril) je determinován především genetickými faktory a do jisté míry také těmi faktory prostředí, které jsou schopny ovlivnit prenatální myogenezi (Rehfeldt et al., 2000). Toto je kontrolováno geny tzv. MYOD rodiny svalově specifických regulačních faktorů, kam patří MYOD1 (MYF-3), MYOG (MYF-4, myogenin), MYF5 a MYF6 (MRF-4), geny IGF rodiny, kterou tvoří inzulínu podobné růstové faktory (IGF2), a genem myostatinu (GDF8, MSTN). První svalově specifický regulační faktor (MYOD1) byl objeven v roce 1987

14 13 Robertem Davisem a publikován byl v časopisu Cell (Davis et al., 1987). Byl to vůbec první objevený faktor, který vykazoval aktivitu pro buněčnou determinaci. Geny MYOD rodiny kódují vysoce konzervované bhlh proteiny (basic helix-loophelix), které kontrolují a regulují proces embryologického vývoje svaloviny (Olson et al., 1990). Doména bhlh (viz obr. vpravo) je základním charakteristickým znakem myogenních faktorů a dalších regulačních proteinů (Braun et al., 1990). Přestože se funkční aktivity myogenních faktorů často překrývají, jejich odlišná exprese během embryogeneze naznačuje, že každý protein má svou specifickou úlohu v kontrole svalového vývoje (Naidu et al., 1995). Gen MYOD1 indukuje diferenciaci fibroblastů na myoblasty, zatímco fúze myoblastů v myofibrily se děje pod kontrolou genu MYOG (Hasty et al., 1993), což je jediný myogenní faktor exprimovaný ve všech svalových buněčných liniích (Wright et al., 1989; Edmondson and Olson, 1989). MYF5 kontroluje kontinuální mitotické dělení zárodečných buněk a MYF6 se podílí na konečné diferenciaci svalových buněk v myofibrily. Exprese MYOD1 a MYF5 se snižuje se začátkem exprese myogeninu. Buňky se přestávají dělit a začínají se fúzovat v myofibrily (Te Pas et al., 1996). MYOD1 je potřebný pro aktivaci myogeninu (Wang a Jaenisch, 1997). Obr. 1 Utváření svalového vlákna

15 MASO Definice Jako maso jsou často definovány všechny části těl živočichů v čerstvém nebo upraveném stavu, které se hodí k lidské výživě. V podstatě se jedná o příčně pruhovanou svalovinu z těl teplokrevných jatečných zvířat, včetně vazivové součásti svalů, povrchového a intramuskulárního tuku, cév, mízních uzlin, nervů, kostí a někdy i opařené kůže. Jatečně opracovaným tělem se rozumí celé tělo nebo části těl zvířat získané jejich poražením a připravené k veterinárnímu vyšetření na jatkách (Steinhauser et al., 2000) Embryonální vývoj svalstva Svalová tkáň vzniká ze středního zárodečného listu - mezodermu. Diferenciace mezodermu probíhá v raném embryonálním stádiu společně s vývojem tělní stěny a tělních dutin. Mezodermové buňky myotomu, rozděleného zárodečného listu, si ponechávají původní epitelové uspořádání, zůstávají na místě a diferencují se na základy kosterních svalů. Myotomy se zvětšují a jejich buňky se přeměňují na vřetenovité myoblasty. Vývoj svalstva, myogeneze, je složitý, fázovitý proces ontogenetického vývoje, kdy se diferencuje svalovina. Většina embryonálních svalových buněk podléhá diferenciaci, některé z nich však zůstávají nediferencované a perzistují jako nediferencované myoblasty až do dospělosti. Z těchto myoblastů vznikají buňky, které se přímo podílejí na tvorbě svalových vláken. Tyto buňky označují jako satelitní. Diferencované myoblasty se řadí za sebe do sloupců a vytvářejí tak útvary zvané myotuby. Ty se postupem vývoje prodlužují a řadí v podélném směru vedle sebe. Další diferenciace myotubů ve svalové vlákno se již satelitní buňky neúčastní a zůstávají nediferencované. Dalším stádiem myogeneze kosterního svalu je myofibrilogeneze, pro kterou je charakteristická tvorba myofibril, další diferenciace myoblastů a vznik příčně pruhovaného svalového vlákna. Výsledkem myofibrilogeneze je tedy definitivní přeměna myotubu ve svalové vlákno neboli myofibrilu. Mezi příčně pruhovanou svalovinu se řadí kromě kosterního svalstva i srdeční sval, který je zvláštním typem příčně pruhované svalové tkáně (Steinhauser et al., 2000).

16 15 Svalové vlákno Základní morfologickou a funkční jednotkou příčně pruhovaného svalu je svalové vlákno, myofibrila. Vyniká schopností se smršťovat a svou stavbou podmiňuje příčné pruhování kosterních svalů. Typy svalových vláken Červená vlákna Jsou tenčí než vlákna světlá, mají méně myofibril a více myoglobinu, který určuje barvu vlákna. Obsahují podstatně větší množství mitochondrií než světlá vlákna. Převahu červených vláken mají např. dýchací svaly. Světlá (bílá) vlákna Jsou tlustší, chudá na myoglobin a mitochondrie. Obsahují více myofibril a jsou schopna rychlé kontrakce, ale brzo se unaví. Přechodná, intermediární vlákna Představují přechod mezi světlými a červenými vlákny Chemické a biochemické složení masa Typický savčí sval je složen z vody, bílkovin, tuků, glycidů, rozpustných nebílkovinných látek a vitamínů. Bílkoviny jsou sarkoplazmatické (myoglobin, hemoglobin), myofibrilární (aktin, myosin) a stromatické (elastin, kolagen). Tuk, zejména intramuskulární, je důležitý pro chuť a křehkost masa. Minerální látky tvoří asi 1 % hmotnosti masa. Co se týče procentuálního zastoupení chemických prvků, je v mase nejvíce obsažen kyslík (65 %), uhlík (18 %) a vodík (10 %). Dále potom dusík, vápník, fosfor, draslík, síra, sodík, chlor a hořčík. Zbytek tvoří stopové prvky (Steinhauser et al., 2000).

17 Produkce masa Vepřové maso se podílí téměř 40 procenty na celkovém objemu vyrobeného masa a je od roku 1965 světově nejvíce produkovaným druhem masa (Steinhauser et al., 2000). V roce 2005 dosáhla celková produkce masa v České republice objemu tun v jatečné hmotnosti (bez drůbežího masa). V tomto množství bylo tun vepřového, tun hovězího, 562 tun telecího, 218 tun skopového vč. kozího a 82 tun koňského masa. V porovnání s rokem 2004 se výroba masa celkem snížila o 11,1 %. Z celkového množství byla nejvyšší produkce vepřového masa (52,4 %), následovalo drůbeží s 34,8 %. Hovězí a telecí se na výrobě podílelo 12,7 %. Za nižší porážkou stojí zřejmě nižší stavy chovů. Podle údajů ze statistiky živočišné výroby se počty skotu snížily ke konci loňského roku meziročně o 1,2 procenta. Stavy prasat klesly k 1. prosinci 2005 meziročně o 6,7 procenta. Stavy drůbeže se k 31. prosinci 2005 propadly meziročně o 10,3 procenta, z toho stavy slepic o 12,7 procenta (vetweb.cz, csu.cz). K 1. dubnu 2005 bylo v České republice chováno tis. prasat. Pokles početních stavů prasat souvisí s likvidací nerentabilních chovů. V roce 2005 se počet chovatelů prasat snížil meziročně o 10,0 %. Obr. 2 Graf produkce vepřového masa v tunách zdroj: Český statistický úřad

18 Plemena prasat České bílé ušlechtilé (ČBU) - mateřská pozice Bílá ušlechtilá prasata mají výborné reprodukční vlastnosti, vynikají růstovou intenzitou při velmi dobré konverzi živin a velmi dobrou masnou užitkovostí. Zachovávají si v převážné míře kombinovaný sádelno-masný užitkový typ odpovídající mateřským plemenům a liniím. Mají dobrou kvalitu masa. Vyznačují se větším až velkým tělesným rámcem, lehčí hlavou se vzpřímeným uchem, jemnější ale pevnou kostrou, pevnou konstitucí s vysokým stupněm odolnosti vůči stresu. Barva kůže a štětin je růžová, respektive bílá. Šlechtitelský standard: 11 živě narozených selat 1000 g průměrný denní přírůstek % libové svaloviny České bílé ušlechtilé - otcovská pozice Plemeno je otcovskou linií bílého ušlechtilého. V charakteristice plemenného typu se příliš neliší od mateřské linie. Rozdíl spočívá v užitkovém typu, kde je požadováno suché vyjádření výrazně masného užitkového typu s mediální rýhou na hřbetě a kýtě. Kostra je pevná, o něco mohutnější než u mateřské linie. Využívá se v čisté formě popř. při produkci speciálních otcovských linií pro C pozici Česká landrase (ČL) Toto původně dánské plemeno vzniklo z jutského a ostrovního prasete křížením s plemenem large white. Výchozí produkt byl nejednotný. Proto se začala uplatňovat velmi přísná selekce a kontrola užitkovosti v rámci uzavřené populace, a tak došlo ke stabilizaci znaků uvnitř plemene.

19 18 Prasata se vyznačují výbornými reprodukčními vlastnostmi, vysokou růstovou intenzitou při velmi dobré konverzi živin a velmi dobrou masovou užitkovostí. Pro toto plemeno je charakteristický větší tělesný rámec, jemnější avšak pevná kostra a lehká hlava. Uši jsou klopené a přiměřeně dlouhé. Konstituce může být jemnější avšak pevná s odolností proti stresům. Barva kůže a štětin je bílá. Plemeno se používá převážně v mateřské pozici. Šlechtitelský standard: 11 živě nar. selat 1000 g průměrný denní přírůstek 32,89 MJ ME % libové svaloviny Duroc Původem je toto plemeno ze severovýchodního území USA. Vzniklo z původních červených prasat křížením s červenými guinejskými, španělskými a portugalskými prasaty. Plemeno řadíme do masného typu, má lepší reprodukční užitkovost než plemeno Belgická landrase, dobrou růstovou schopnost i tvorbu masa. Může se vykrmovat do vyšších porážkových hmotností. Vyniká výbornou kvalitou masa. Má velký tělesný rámec. Růstová intenzita je velmi dobrá při dobré konverzi živin. Kvalita masa je dobrá. Duroc je v ČR šlechtěn jako otcovské plemeno pro použití v C pozici v čisté formě, častěji však k produkci speciálních otcovských linií. Šlechtitelský standard: 9 živě nar. selat 900 g průměrný denní přírůstek 34,16 MJ ME % libové svaloviny Zdroj: Českomoravská společnost chovatelů, s.r.o.

20 Genom prasete Genom je veškerá genetická informace uložená v DNA (u některých virů v RNA) konkrétního organismu, a to v chromozomech a mitochondriích. Zahrnuje všechny geny a nekódující sekvence ( Velikost genomu je obecně dána počtem párů bází. Prvním přečteným genomem vůbec byl genom bakterie Haemophilus influenzae. Přečtené genomy zahrnují databázi genů od průměrného jedince daného druhu, protože k analýze jsou použity vždy vzorky z mnoha jedinců. Přečtení genomu prasete bylo oznámeno pekingským Ústavem genomiky čínské akademie věd a kodaňským Výborem pro šlechtění a chov prasat v červnu 2005 v rámci společného projektu, jenž byl spuštěn v roce 2001 pod názvem "Čínsko-dánský projekt prasečího genomu". Celkem bylo doposud přečteno asi 2,1 miliard písmen genetického kódu. Stále chybějí především opakující se úseky, které se čtou velice obtížně. Jejich luštění je nejen pracné a zdlouhavé, ale i drahé. Ke čtení byla použita DNA prasat z plemen hampshire, yorkshire, landrace, duroc a čínského plemene ErHuaiLan. Zjištěné prasečí sekvence byly porovnány s lidským a myším genomem ( Wernersson et al., 2005). Od roku 2003 se sekvenováním zabývá také sdružení SGSC (Swine Genome Sequencing Consortium; Obecný karyotyp domestikovaného prasete (viz obr. vpravo) je 2n = 38, tedy 18 párů autozomálních chromozomů a 1 pár pohlavních chromozomů. Některá divoká prasata mají chromozomů 36, což je způsobeno fúzí centromer chromozomů 15 a 17 nebo 16 a 17 (tzv. Robertsonova translokace) (Chowdhary, 1998).

21 QTL - lokusy kvantitativních znaků Genetické modely používané při šlechtění zvířat vycházejí z předpokladu, že znaky pro růst nebo jatečnou hodnotu jsou kontrolovány velkým počtem genů, které nejsou ve vazbě a každý pouze s malým efektem na daný znak. Oblast na chromozomu s geny ve vazbě, které ovlivňují kvantitativní znak, se označuje jako QTL neboli lokusy kvantitativních znaků. Lze je také označit jako soubor genů nebo alel genů, podmiňující fenotyp, často biochemické nebo fyziologické povahy. De Koning et al. (1999) označil QTL jako molekulárně-genetický marker ležící mimo hlavní oblast strukturního genu pro určitou užitkovou vlastnost, se kterou má prokazatelnou asociaci. Odpovídají-li tyto lokusy za ekonomicky důležité užitkové vlastnosti zvířat, označují se jako ETL - ekonomicky významné lokusy (Georges a Massey, 1991). Kandidátní gen Je-li v oblasti QTL zjištěn gen ovlivňující výraznou měrou určitou vlastnost a jehož produkt se projeví ve výsledném fenotypu, podílí se na fenotypové variabilitě, označuje se tento gen jako kandidátní. Takový gen má potenciálně velký účinek na užitkový znak. Kandidátní gen může být identifikován na základě databáze pro modelová zvířata, kde již byl studován výskyt podobného fenotypu. Je-li kandidátní gen identifikován, je možné najít informace o jeho funkci. Může být zkoumán sekvenováním a je-li nalezena mutace, provede se asociační analýza (Berg, 2006). Při výběru kandidátního genu se vychází ze známé fyziologické a biochemické funkce genu a z předpokladu, že když je znám účinek genu jednoho savčího druhu, lze s využitím komparativního mapování usuzovat na podobný účinek u jiného druhu (Knoll, 1998). Jak uvádí Soller a Andersson (1998), počet všech možných kandidátních genů pro danou užitkovou vlastnost je řádově 100 a víc. Pouze malá část těchto genů však bude asociovaná s kvantitativním efektem v konkrétní populaci. Genetický marker Jako genetický marker se označuje úsek DNA s neznámou kódující funkcí, který má známou fyzickou lokalizaci na chromozomu, vykazuje mendelistickou kodominatní

22 21 dědičnost a je snadno a jednoznačně detekovatelný. Je to vysoce polymorfní znak ( Mezi výhody molekulárně-genetických markerů patří to, že jsou velmi početné a relativně snadno identifikovatelné, jsou vysoce informativní a mohou být zjištěny z nepatrného množství tkáně v libovolném věku jedince (včetně embryí nebo post mortem). DNA může být dlouhodobě uchovávána, a lze se tak k analýze opakovaně vracet i po několika letech. Markery lze rozdělit do tří hlavních skupin: 1) kódující exprimované geny (mohou být kandidátními geny pro QTL) - mají obecně malý výskyt polymorfismu a jsou málo využitelné pro studie diverzity rodin a populací; zejména se využívají při komparativním mapování 2) vysoce variabilní sekvence DNA - do této skupiny patří mikro- a minisatelity; mikrosatelity (STR) jsou krátké sekvence nukleotidů (obvykle 2-5), které se několikrát v tandemu za sebou opakují, naproti tomu minisatelity (VNTR) tvoří podstatně delší sekvence (9-80), které se tandemově opakují; vlivem vysokého stupně polymorfismu (díky velkému počtu alel) jsou využívány zejména při ověřování parentity 3) jednonukleotidové polymorfismy (SNP) - jedná se o bodové mutace (záměna jednoho nukleotidu), které se mohou vyskytovat uvnitř kódujících úseků DNA, ale častěji v nekódujících intronech nebo intergenových oblastech; v genomu se vyskytují přibližně každých 500 až 1000 párů bází; SNP obsažené uvnitř kódujících sekvencí nemusí nezbytně vést ke změnám sekvence aminokyselin produkovaného proteinu, a to díky jejich nadměrně velkému počtu (Knoll a Vykoukalová, 2002; en.wikipedia.org) Polymorfismus Polymorfismus (z řeckého: poly "mnoho" a morph "forma, tvar") může být definován jako výskyt dvou a více forem či variant znaku v takové četnosti, že ta vzácnější varianta nemůže být způsobena samotnou náhodnou mutací". E.B. Ford, 1940 O polymorfismu můžeme mluvit tehdy, je-li četnost výskytu méně početnější alely v populaci alespoň 1 % (Kwok, 2003).

23 Mapování QTL Mapování QTL v sobě zahrnuje hledání asociací mezi alelami markerů a danou užitkovostí, a proto vyžaduje populace zvířat s dostatečně velkou genetickou variabilitou ve sledovaných znacích. Vazbové mapování bylo u prasat poprvé popsáno v roce 1964, a to pro lokusy krevních skupin. Počet markerů popsaných pro tvorbu map u prasete se od té doby rychle zvyšoval od 28 v roce 1984 až na přibližně 2660 (Geldermann et al., 2003). Hlavními projekty, které se na tom významně podílely, byly americký USDA-MARC (US Department of Agriculture, Meat Animal Research Centre) (Rohrer et al., 1994, 1996), evropský PiGMaP (Pig Gene Mapping Project) (Archibald et al., 1995), sdružení Nordic Pig Gene Mapping (Marklund et al., 1996) a japonský program NIAI (Mikawa et al., 1999). USDA-MARC.2 (Rohrer et al. 1996; zahrnuje kompletní genomovou mapu prasete v celkové délce přibližně 23 Morganů. Celkem bylo zjišťováno 46 znaků pro růst, tučnost, zmasilost, kvalitu masa, odolnost vůči stresu a tělesný rámec. Celkový scan genomu pro detekci QTL byl proveden pro znaky růstu, tučnosti, kvality masa, velikost těla a imunity pomocí záznamů o fenotypu zvířat z Uppsaly, konkrétně z F 2 generace kříženců divokého prasete a large white (Andersson et al., 1994). QTL pro tučnost byly detekovány na chromozomech 1, 2, 3, 4, 6, 7 a X s největším efektem na chromozomu 6, kde vysvětlují až 13,7 % fenotypové variance (Geldermann et al., 2003). QTL pro jatečnou hodnotu byly detekovány na chromozomech 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 12, 14, 15 a X. Největší vliv byl přitom zjištěn na chromozomu 4, kde se tyto QTL podílí 12 % na celkové fenotypové variabilitě a na chromozomu 6, kde tyto QTL ovlivňují celkovou fenotypovou variabilitu z 16 %. Vlastní kvalita masa je potom ovlivňována QTL detekovanými na chromozomech 2, 3, 6, 13, 16, 18 a X s největším efektem na šestém chromozomu (Geldermann et al., 2003). QTL ovlivňující svalový růst, uložení tuku a velikost srdce byl poprvé identifikován u kříženců mezi evropskými divokými prasaty a plemenem large white (LW) a mezi plemeny LW a pietrain (Van Laere et al., 2003). Nezer et al. (1999) identifikovali a analyzovali u kříženců LW x P QTL v oblasti genu IGF2 a zjistili vysoce signifikantní vliv na podíl libového masa (procento libové šunky a kotlety) a obsah tuku (výška hřbetního tuku, procento hřbetního tuku). Naopak nezjistili žádnou souvislost s růstem či hmotností při narození.

24 23 Milan et al. (2002) analyzovali soubor 488 kříženců F 2 generace plemen meishan (M) a LW a zjistili významný vliv QTL na tučnost a zmasilost na chromozomech 1, 2, 4, 5, 7 a X. U plemene LW byl zjištěn vliv na vyšší podíl libového masa a nižší obsah tuku (vyjma SSC7). Harlizius et al. (2000) detekovali na chromozomu X QTL pro tučnost a zjistili jejich vliv na výšku hřbetního tuku a obsah intramuskulárního tuku u celkového souboru 1293 kříženců plemen meishan (sádelný typ) a Holandské bílé prase (masný typ). Stejný vliv QTL na výšku hřbetního tuku na chromozomu X popisují také Rohrer a Keele (1998a). V oblasti 2. chromozomu našli Andersson-Eklund et al. (1998) u kříženců divokého prasete a LW QTL ovlivňující podíl hlavních masitých částí. U divokých prasat má tento QTL značný vliv na délku těla a kvalitu masa (kratší tělo, menší zmasilost). Jeon et al. (1999) v oblasti genu IGF2 identifikovali u stejných kříženců paternálně se exprimující QTL významně ovlivňující podíl libového masa v šunce, velikost srdce a výšku hřbetního tuku. Rohrer a Keele (1998b) se zabývali detekcí a analýzou QTL na chromozomech 1, 7 a X u 540 kříženců plemen meishan a bílé prase a zjistili významný vliv těchto QTL na hmotnost kotlety, délku těla, živou hmotnost a hmotnost jatečně opracovaného těla. Sato et al. (2003) detekovali na 2. a 9. chromozomu QTL pro intramuskulární tuk, ale v jiné oblasti, než se nachází MYOD1 a MYOG. De Koning et al. (1999) prováděli QTL analýzu u kříženců plemen meishan, Holandský LW a Holandská landrase a našli QTL ovlivňující výšku hřbetního tuku (SSC1, SSC2, SSC6, SSC7) a obsah intramuskulárního tuku (SSC2, SSC4, SSC6). QTL ovlivňující složení jatečného těla, kvalitu masa, tučnost a náchylnost ke stresu byly zmapovány na 6. chromozomu u kříženců Hohenheimské populace prasat pietrain x divoké prase a meishan x pietrain. Většina těchto QTL leží v oblasti halotanového lokusu pro gen RYR1 ( Postup při mapovaní QTL: 1) Pomocí mikrosatelitů se označí malý úsek DNA a testuje se, zda je z této oblasti ovlivňován nějaký užitkový znak. 2) Při pozitivním testu se v tomto úseku hledá gen s potenciálně velkým účinkem na tento znak.

25 24 3) Nalezený gen je potom kandidátní a potvrzením jeho významného vlivu na užitkový znak se označí jako gen kvantitativního znaku (Knoll, 1998) Přehled QTL na chromozomech se studovanými geny SSC2 Vazbová mapa druhého chromozomu byla vytvořena z třírodinné F 2 generace plemen meishan, pietrain a divokého prasete. Byly identifikovány QTL pro znaky jatečné hodnoty, denní přírůstek a hmotnost srdce. Genotypováno bylo celkem 10 markerů (Lee et al., 2003). Zmapovány byly QTL pro výšku hřbetního tuku (De Koning et al., 1999, 2001; Jeon et al., 1999; Nezer et al., 1999; Rattink et al., 2000; Rohrer, 2000; Bidanel et al., 2001), obsah libového masa (Andersson-Eklund et al., 1998; Jeon et al., 1999; Nezer et al., 1999), denní přírůstek (Rohrer, 2000; Bidanel et al., 2001; Malek et al., 2001a), počet struků (Hirooka et al., 2001), hmotnost srdce (Jeon et al., 1999), kvalitu masa (Malek et al., 2001b) a počet obratlů (Wada et al., 2000). Významné efekty byly nalezeny pro množství svaloviny a hmotnost srdce. QTL pro množství svaloviny byly lokalizovány v proximální oblasti chromozomu, která koresponduje s IGF2. Tyto QTL potvrzují výsledky Jeon et al., (1999) a Nezer et al., (1999), kteří zmapovali imprintované QTL efekty pro stejné znaky ve stejné oblasti chromozomu. Do oblasti blízko kandidátního genu MYOD1 byly zmapovány QTL pro protučnělost (Rohrer, 2000). De Koning et al. (1999, 2001) detekovali QTL pro výšku hřbetního tuku a obsah intramuskulárního tuku v proximální oblasti SSC SSC5 Vazbové mapy pátého chromozomu byly vytvořeny pomocí 10 markerů u třech F 2 rodin kříženců plemen meishan, pietrain a divokého prasete (Lee et al., 2003). Doposud na tomto chromozomu identifikovali QTL Knott et al. (1998), Rohrer a Keele (1998a) a Bidanel et al. (2001) pro výšku hřbetního tuku, Malek et al. (2001b) a Désautés et al. (2002) pro náchylnost ke stresu, Wilkie et al. (1999) pro délku dělohy a Cassady et al. (2001) pro počet mrtvě narozených selat. U rodiny meishan x pietrain byly nalezeny QTL pro tučnost, znaky jatečné hodnoty a vodivost, u rodiny divoké prase x pietrain pro počet struků a u rodiny divoké prase x meishan pro hmotnost jater, množství tuku v pleci a vodivost.

26 SSC9 Vazbová mapa devátého chromozomu vznikla použitím 16 markerů u třech F 2 rodin kříženců plemen meishan, pietrain a divokého prasete (Čepica et al., 2003). Byly zmapovány QTL pro stupeň ovulace (Rohrer et al., 1999; Cassady et al., 2001), délku březosti (Wilkie et al., 1999), hmotnost těla a intenzitu růstu (Paszek et al., 1999; Wada et al., 2000; Malek et al., 2001a; Quintanilla et al., 2002) a pro tučnost (Rohrer a Keele, 1998a; Rohrer, 2000). Pouze méně významné QTL byly identifikovány u rodin divoké prase x pietrain pro znaky růstu a tučnosti a pro hmotnost jater, růst a poměr tuk : svalovina u rodiny divoké prase x meishan SSC15 Patnáctý chromozom byl zmapován pomocí 6 markerů u třech F 2 rodin kříženců plemen meishan, pietrain a divokého prasete (Kuryl et al., 2003). Byly popsány QTL pro reprodukční znaky (Rathje et al., 1997; Rohrer et al., 1999; Wilkie et al., 1999), tělesnou hmotnost ve věku 2 týdnů (Paszek et al., 1999) a pro kvalitu masa (Malek et al., 2001b). SSC15 byl genotypován pro 5 mikrosatelitů a jeden marker pro krevní skupiny. V oblasti výskytu genu myostatinu nebyly nalezeny žádné QTL pro zmasilost. Tab. 1 Přehled mapování QTL QTL populace Kříženci Počet zvířat F2 generace Počet genotypovaných markerů Roslin LW x meishan Wageningen LW x meishan INRA LW x meishan Uppsala divoké prase x LW Hohenheim divoké prase x pietrain meishan x pietrain celkem 2945 zdroj: Roslin Institute (2002)

27 26 Obr. 4 Ukázka QTL mapy 5. chromozomu Přehled studovaných genů Gen MYOD1 (MYF-3) chromozom prasat: 2p polymorfismus: PCR-RFLP; DdeI (Knoll et al., 1997) mutace: intron 1 délka PCR produktu: 998 bp EMBL: U12574 Gen MYF5 chromozom prasat: 5q2.5 polymorfismus: PCR-RFLP; HpaII (Stratil, Čepica, 1999) mutace: exon 2 délka PCR produktu: 1200 bp EMBL: Y17154 Gen MYOG (MYF-4; myogenin) chromozom prasat: 9q polymorfismus: PCR-RFLP; MspI (Te Pas et al., 1996) mutace: oblast 3 konce délka PCR produktu: 353 bp EMBL: X89209 Gen MYF6 (MRF-4; herkulin) chromozom prasat: 5 polymorfismus: PCR-RFLP; BseRI (Vykoukalová et al., 2003) mutace: intron 1 délka PCR produktu: 379 bp EMBL: AY227664

28 27 Gen IGF2 (somatomedin A) chromozom prasat: 2p1.7 polymorfismus: PCR-RFLP; NciI (BcnI; Knoll et al., 2000) mutace: intron 7 délka PCR produktu: 1600 bp EMBL: X56094 Gen GDF8 (MSTN; myostatin) chromozom prasat: 15q polymorfismus: PCR-RFLP; DraI (Stratil, Kopečný, 1999) mutace: promotor a část exonu 1 délka PCR produktu: 1027 bp EMBL: AF Gen MYOD1 Myoblasty determinující protein 1 byl prvním identifikovaným genem ze skupiny svalově specifických regulačních faktorů. Jeho exprese indukuje diferenciaci fibroblastů na myoblasty. Byl izolován pomocí subtrakční hybridizace cdna. Produktem tohoto genu je myogenní bhlh protein, který jako transkripční faktor aktivuje svalově specifické geny. Je složen z 318 aminokyselin spojených do svalově specifických zesilovačů transkripce, tzv. enhancerů (Braun et al., 1989). Porcinní gen MYOD1 byl poprvé izolován a osekvenován v roce 1995 (Chang et al., 1995). Podle této sekvence navrhli Knoll et al. (1997) fragment dlouhý 998 bp, v jehož intronu 1 detekovali polymorfismus pomocí restrikční endonukleasy DdeI. Cieślak et al. (2000) předpokládali, že DdeI polymorfní štěpné místo v intronu 1 není přímo asociováno s vývojem svaloviny u prasat. Struktura genu MYOD1 může mít svými funkčními rozdíly vliv na některé znaky masné produkce a může sloužit jako marker asociovaný s funkčním polymorfismem nacházejícím se v jiné oblasti tohoto genu (Te Pas a Visscher, 1994). Gen MYOD1 byl lokalizován na chromozomu 2 (Soumillion et al., 1997b) v oblasti 2p (Čepica et al., 1999).

29 28 Obr. 5 Diagram prasečího chromozomu 2 (SSC2) Gen MYOG INRA Pod kontrolou genu MYOG probíhá fúze myoblastů v myofibrily (Hasty et al., 1993). Předpokládá se, že by mohl být ve vztahu k proměnlivosti počtu tvořených svalových vláken, vedoucí k proměnlivosti v množství svalů a tudíž i k hmotnosti libového masa (Soumillion et al., 1997a). Polymorfismus tohoto genu byl poprvé zjištěn v roce 1993, a to pomocí restrikční endonukleasy MspI (Ernst et al., 1993). Te Pas et al. (1996) detekovali MspI polymorfismus na 3 konci genu a v roce 1999 zjistili u prasat plemene yorkshire asociaci MspI polymorfismu s hmotností při narození, rychlostí růstu, hmotností libového masa ve 200 dnech a s výškou hřbetního tuku. Soumillion et al. (1997a) testovali MspI polymorfismus celkem u sedmi plemen (meishan, pietrain, duroc, hampshire, great yorkshire, holandská landrase a divoké prase). Čepica et al. (2003) nenašli žádný vliv myogeninu na růst ani zmasilost, zatímco Te Pas et al. (1999a) vysvětlili 4 % fenotypové variance pro hmotnost při narození, intenzitu růstu a hmotnost jatečného těla a 5,8 % pro hmotnost libového masa. Byl lokalizován na chromozomu 9 v oblasti 9q (Ernst et al., 1998).

30 29 Obr. 6 Diagram prasečího chromozomu 9 (SSC9) INRA Gen MYF5 Tento gen byl jako první svalově specifický regulační faktor exprimovaný in vivo v myoblastech. Exprese MYF5 je spojená s determinací buněčné linie myoblastů a jeho aktivace je započata v buňkách produkovaných tkání nejdelšího zádového svalu. Pod kontrolou genu MYF5 prochází zárodečné svalové buňky kontinuálním mitotickým dělením. Konečná diferenciace svalových buněk závisí na funkci myogenních regulačních faktorů, jako jsou právě MYF5 a myogenin (Davis et al., 1987; Braun et al., 1989; Wright et al., 1989). Te Pas et al. (1999b), který se zabýval polymorfismem tohoto genu, detekoval 3 mikrosatelity (2 v oblasti promotoru, 1 v intronu 3) a 2 polymorfismy (PvuII, HinfI) v uzavřené kódující sekvenci. Urbanski et al. (2006) identifikovali v tomto genu 3 nové mutace v oblasti promotoru, a to A65C, C580T a C613T. Byl lokalizován na pátém chromozomu (Soumillion et al., 1997b) v oblasti 5q2.5 (Čepica et al., 1999). Část promotoru tohoto genu leží v exonové části genu MYF6 (Yoon et al., 1997).

31 Gen MYF6 MYF6 je exprimován především postnatálně a jeho role spočívá v udržování myofibril v diferencovaném stavu (Olson, 1990). Podílí se na regulaci fúze satelitních buněk s myofibrilami a na regeneraci svalů (Zhou a Bornemann, 2001). Z tohoto důvodu je považován za kandidátní gen pro kvalitu masa. Skládá se ze tří exonů a dvou intronů a jeho kompletní sekvence byla poprvé popsána v roce 1990 (Miner a Wold, 1990). Ernst et al. (1994) detekovali pomocí RFLP MspI polymorfismus na základě hybridizace s krysí cdna. Fragment prasečího MYF6 genu, zahrnující exon 1, exon 2 a intron 1 byl naamplifikován pomocí primerů navržených podle lidské sekvence spolu s myší mrna a genomovou DNA. Gen byl zmapován pomocí radiačního hybridního panelu, přičemž v intronu 1 byly zjištěny celkem tři jednonukleotidové polymorfismy (Vykoukalová et al., 2003). Wyszynska-Koko et al. (2006) analyzovali v tomto genu celkem dva polymorfismy, a to v oblasti promotoru a exonu 1. Naznačili, že zjištěné mutace nejsou kauzální, ale mohou být ve vazbě s jinými mutacemi ovlivňujícími myogenezi. Gen MYF6 byl lokalizován na pátém chromozomu v oblasti 5q2.5 v blízkosti genu MYF5 (Vykoukalová et al., 2003). Obr. 7 Diagram prasečího chromozomu 5 (SSC5) INRA

32 Gen IGF2 IGF2 (inzulínu podobný růstový faktor 2) je členem IGF rodiny, kam dále patří IGF- 1, IGF-1R, IGF2R, IGF-vázající proteiny (IGFBPs) a IGFBP proteasy (Allan et al., 2001). Je považován za kandidátní gen pro masnou užitkovost a plodnost. Mnohé výsledky výzkumu naznačují také možnou asociaci s ukazateli jatečného těla (obsahem libového masa) a s konverzí krmiva. Jedná se o růst stimulující peptidy, které jsou strukturními homology inzulínu, mající i obdobnou biologickou funkci (Gerrard et al., 1998). Jeho role spočívá v regulaci proliferace a diferenciace myoblastů (Florini et al., 1986, 1991; Magri et al., 1994) a je důležitý pro regulaci postnatální myogeneze (Van Laere et al., 2003). Skládá se z deseti exonů a devíti intronů, stejně jako u lidí a myší. Byl lokalizován na chromozomu 2 v oblasti 2p1.7 (Jeon et al., 1999; Nezer et al., 1999) Imprinting genu IGF2 Imprinting neboli vtiskování je jev způsobený metylací. Jedná se o změnu v expresi genu, uskutečněnou během přechodu genu přes spermii nebo vajíčko a má za následek, že samčí a samičí alely mají různé vlastnosti v rané fázi embrya (Rosypal, 2000). Metylací se rozumí přidání CH 3 skupiny na C5 cytosinu za vzniku 5-metylcytosinu. Celý proces je katalyzován enzymem DNA metyltransferázou, která působí na tzv. CpG ostrůvky (sekvence 5 -CpG- 3 ) v promotoru genu, které se vyskytují zejména u vyšších eukaryotů. Metylace zabrání navázání transkripčních faktorů k promotoru a tím pádem i samotné expresi genu. Metylované sekvence jsou tedy inaktivní (Gold a Pedersen, 1994). Genomický imprinting je epigenetický fenomén, ke kterému dochází tehdy, vyskytují-li se obě alely, paternální i maternální, a jedna z nich se bude exprimovat, zatímco druhá zůstane inaktivní. Imprinting genu IGF2 poprvé popsali De Chiara et al. (1991) u myší, u kterých zjistili nedostatečný růst způsobený paternální alelou nesoucí mutaci, zatímco myši s mutací od matky vykazovaly normální růst. Výsledný fenotyp tak závisel na gametě nesoucí mutovanou alelu. Podle Wutze et al. (1997) se může metylačním imprintingem zachovat alelická exprese na různých chromozomech. Alelická metylace v genu IGF2 se zvyšuje v embryogenezi a postupně se během vývoje mění (Feil et al., 1994). Podle výsledků Li et al. (1993) je normální hladina metylace DNA vyžadována pro kontrolu diferenciální exprese paternálních i maternálních alel imprintovaných genů.

33 32 IGF2 je exprimován pouze z paternální alely. Alela, která se dědí po matce se neexprimuje. Dá se to vysvětlit tak, že gen IGF2 podléhá v oocytech metylaci a ve spermatocytech nikoli, takže v zygotě se obě alely chovají různě (Rosypal, 2000). Podle Vyskota (1999) je imprinting zdánlivě kontraproduktivní, neboť umlčuje jednu kopii genu tím, že odnímá výhodu diploidie, tzv. rezervní alely. U savců hraje klíčovou roli ve vývinu, a pokud je chybný, vede k nádorovým onemocněním a genetickým chorobám. Většina savčích imprintovaných genů působí tak, že otcové mají záměr umlčovat geny brzdící růst, což vede ke zvýšení rychlosti růstu embrya a k silnějšímu potomstvu. To může být v rozporu se zájmem matky, která umlčuje své růst podporující geny k udržení vývinu embrya pod svou kontrolou. Obr. 8 Princip metylace Polymorfismus genu IGF2 Nezer et al. (1999) identifikovali u kříženců plemen LW a pietrain v exonu 2 jednonukleotidový polymorfismus způsobený tranzicí G A v pozici 241 v základní sekvenci odpovídající exonu 2 lidského IGF2. Podle analýzy cdna z kosterní svaloviny a jater 10 týdenních plodů heterozygotních v této mutaci se ukázalo, že IGF2 se stejně jako u

34 33 lidí a myší v těchto tkáních exprimuje z paternální alely a tedy podléhá maternálnímu imprintingu. Knoll et al. (2000) nalezli v oblasti intronu 2 NciI polymorfismus na základě substituce G C v pozici 162. Horák et al. (2001) zjistili asociaci mezi tímto polymorfismem a počtem narozených selat u plemene Přeštické černostrakaté. Van Laere et al. (2003) detekovali v intronu 3 v pozici 3072 kauzální mutaci G A (tzv. Q alela nesoucí mutaci a wild-type q alela), která ovlivňuje svalový růst, uložení tuku a velikost srdce. K této mutaci dochází ve vývojově zachovalém CpG ostrůvku, který je hypermetylován v kosterní svalovině. Bylo dokázáno, že prasata dědící tuto mutaci paternálně, mají zvýšenou expresi mrna genu IGF2 v postnatálně vyvíjené svalovině. Tento polymorfismus naznačuje, že se jedná o příčinný nukleotid kvantitativního znaku, tzv. QTN. U tohoto genu se standardně testuje mutace v intronu 7. V intronu 3 byla zjištěna příčinná mutace ovlivňující svalový růst, uložení tuku a velikost srdce u prasete. Tento polymorfismus ale nelze stanovovat běžnou PCR-RFLP technologií, nýbrž metodami postavenými na principu polymerázové řetězové reakce v reálném čase Gen GDF8 Gen myostatinu (GDF8) je členem TGF-β superrodiny a je nezbytný pro svalový růst a vývoj. Působí jako negativní regulátor množství kosterní svaloviny (McPherron et al., 1997) tím, že blokuje funkci myogeninu, a zamezuje tak tvorbě dalších svalových myofibril v embryonálním stadiu. Poprvé to bylo pozorováno u myší, u kterých při disfunkci genu docházelo k velkému nárůstu svaloviny (Sonstegard et al., 1998). Gen byl poprvé zmíněn v roce 1997, kdy jej McPherron et al. (1997) identifikovali ve svalové tkáni u myší. Zjistili, že během úvodní fáze embryogeneze je jeho exprese omezena pouze na myotomy vyvíjejících se somitů. V závěrečné fázi embryogeneze a u dospělých jedinců je potom exprimován v mnoha různých svalových tkáních celého těla. McPherron a Lee (1997) popsali u plemene skotu belgické modré mutaci v exonu 3, způsobenou 11 nukleotidovou delecí, která má za následek tzv. dvojité osvalení. Stratil a Kopečný (1999) zjistili v oblasti promotoru substituci T A. U této mutace zjistili Li et al. (2002) asociaci s hmotností při narození u yorkshirských prasat. Yang et al.

35 34 (2002) došli k závěru, že tato mutace může být molekulárním markerem QTL pro procento libového masa. Jiang et al. (2002) identifikovali u různých komerčních a čínských plemen celkem tři jednonukleotidové polymorfismy lokalizované v oblastech promotoru (zde potvrdili mutaci T A), intronu 1 a exonu 3. Tyto polymorfismy vesměs převažovaly u plemen čínských. Gen myostatinu byl lokalizován na chromozomu 15 v oblasti 15q (Sonstegard et al., 1998; Pinton et al., 2000). Obr. 9 Diagram prasečího chromozomu 15 (SSC15) INRA 3.6 Metody molekulární genetiky Polymerázová řetězová reakce (PCR) Byla vyvinuta firmou Cetus Corporation v Emeryville v Kalifornii. Poprvé byla popsána v roce 1985 (Saiki et al., 1985) a je považována za základní metodu molekulární biologie, která slouží k získávání dostatečného množství specifické DNA pro další analýzy. Podstatou reakce je enzymatická amplifikace neboli pomnožení DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané sekvence DNA v cyklicky se opakující reakci o třech

36 35 teplotních fázích. Dvouvláknová DNA je nejprve denaturována na dvě jednovláknové templátové (matricové) molekuly DNA - fáze denaturace. Nukleotidová sekvence cílové molekuly nemusí být známá, ale musí být známé alespoň sekvence krátkých úseků na obou koncích cílové amplifikované DNA. Oligonukleotidové sondy (primery), které hybridizují na obou stranách cílové DNA - fáze annealingu neboli připojení, řídí syntézu nových vláken - fáze elongace. Jejich syntéza je katalyzována termostabilní Taq DNA polymerázou. V každém cyklu se množství DNA zdvojnásobí a tím se zdvojnásobí množství templátu pro cyklus následující. Dochází tedy k exponenciální amplifikaci, tj. z každé molekuly původního templátu bude vytvořeno 2 n kopií, kde n je počet cyklů. Účinnost amplifikace je odhadována mezi %, ale může být snížena přítomností většího množství templátu Základní komponenty amplifikačního procesu DNA templát (matrice): slouží jako vzor pro syntézu nových řetězců DNA Primery (oligonukleotidy): obvykle složeny z nukleotidů, svou sekvencí odpovídají DNA templátu a vymezují úsek, který má být amplifikován DNA polymeráza (Taq polymeráza): syntetizuje novou DNA ve směru 5 3 podle sekvence nukleotidů v templátu od místa primeru navázaného na templát až po jeho konec dntp (datp, dctp, dgtp, dttp): stavební kameny pro syntézu nové DNA Mg 2+ ionty: tvoří rozpustný komplex s dntp a vytvářejí substrát, který rozpoznává DNA polymeráza ph pufr (TAE, TBE): zajišťuje optimální podmínky pro aktivitu DNA polymerázy dh 2 O: ultračistá voda, deionizovaná Teplotní cyklér: zařízení zajišťující optimální podmínky pro automatické provádění PCR reakce

37 Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) Alely se identifikují na základě přítomnosti nebo absence specifického restrikčního místa. Genomická DNA se štěpí příslušnou restrikční endonukleasou, následuje její separace agarózovou gelovou elektroforézou a poté je přenesena (blotována) na pevnou membránu. Po hybridizaci se značenou sondou se zjistí polymorfismus ve velikosti vzniklých restrikčních fragmentů DNA. Pokud je jako sonda použita komplementární DNA (cdna), je možné identifikovat polymorfismus uvnitř markerů typu I. Vzhledem k relativní pracnosti metody se dává přednost její modifikaci spojené s PCR PCR - RFLP Fragment DNA se štěpí panelem restrikčních endonukleas. Identifikace a analýza produktů štěpení se provádí elektroforetickým dělením. Počet i délka fragmentů je pro daného jedince specifická. Je známo velké množství bakteriálních restrikčních endonukleas, které se liší od sebe tím, že rozpoznávají různé krátké sekvence a že štěpí DNA na různě dlouhé fragmenty podle individuálního pořadí bází a podle rozpoznávající sekvence. Některé restrikční endonukleasy jsou citlivé na metylaci. Polymorfismus vzniká na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti rozpoznávacích a štěpných míst PCR v reálném čase (real-time PCR) Tato moderní metoda umožňuje sledování průběhu PCR v reálném čase na základě sledování intenzity fluorescenčního signálu. Použití této metody je vhodné zejména při kvantifikaci genomové DNA (např. u virů) nebo mrna (studium exprese genu), analýze bodu tání produktu (ověření identity a kvality produktu) nebo při přímém stanovení genotypu (analýzou bodu tání nebo hybridizací). Provádí se prostřednictvím detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu ve speciálním přístrojovém zařízení, které umožňuje cyklické střídání teplot, detekci fluorescence a monitorování postupu PCR v reálném čase bez nutnosti detekovat PCR produkty elektroforeticky. Vyhodnocení probíhá na počítači pomocí speciálního softwaru. Pro detekci DNA se používá řada metod: 1) SYBR Green I: pro detekci dsdna, umožňuje kvantifikaci templátu a identifikaci produktů, SYBR Green I dává fluorescenční signál pouze ve

38 37 spojení s dsdna, a proto v průběhu nárůstu PCR produktu dochází k růstu signálu 2) hybridizační sondy: používají se 2 sekvenčně specifické sondy umístěné těsně vedle sebe tak, že na svých přilehlých koncích mají fluorescenční značky, které, pokud jsou ve své blízkosti, vytváří signál detekovatelný přístrojem; signál je tím vyšší, čím větší je množství PCR produktu 3) TaqMan sondy: jedná se o dvakrát fluorescenčně značené hydrolyzační sondy nesoucí na svém 5 konci fluorescenční barvičku (tzv. reporter) a na 3 konci zhášeč (tzv. quencher). Metoda je založena na principu exonukleázové aktivity DNA polymerázy, tedy na schopnosti štěpit během replikace navázanou oligonukleotidovou sondu, blokovat funkci zhášeče a emitovat tak fluorescenční záření; používají se např. pro detekci bodových mutací 4) molekulární majáky: oligonukleotidové sondy pro detekci nukleových kyselin v homogenním roztoku 5) FRET sondy: jedenkrát značené sondy s přenosem energie fluorescenční rezonancí Alelická diskriminace Jedná se o tzv. 5 nukleázovou assay, metodu, na základě které jsou automaticky detekovány jednotlivé genotypy podle navázání dané sondy specifické pro tzv. wildtype alelu a mutantní alelu. Každá sonda je značena obvykle barvičkami FAM a VIC a je navržena podle sekvence s danou mutací. Obr. 10 Duálně značené oligonukleotidové sondy

39 Elektroforéza Elektroforéza patří v molekulární biologii k nejpoužívanějším separačním technikám při izolaci a analýze nukleových kyselin a proteinů. Jedná se o soubor separačních metod, které využívají k dělení látek jejich odlišnou pohyblivost ve stejnosměrném elektrickém poli. Na principu rozdílných elektroforetických mobilit se při ní dělí nabité molekuly (ionty). Vzhledem k tomu, že rychlost pohybu částic je závislá na velikosti náboje a velikosti molekuly, různě velké a různě nabité molekuly se budou pohybovat odlišnou rychlostí. Hlavním nositelem náboje nukleových kyselin jsou záporně nabité fosfátové skupiny. Poprvé se o elektroforéze zmiňuje rok 1892, kdy bylo publikováno, že anorganické částice v koloidním roztoku pod vlivem elektrického pole nenáhodně putují. Nedlouho poté byl tento jev popsán i u proteinů ve vodných roztocích. V roce 1948 byl Nobelovou cenou oceněn Arne Tiselius (švédský chemik), který ve 30. letech minulého století postavil aparaturu separující proteiny krevního séra na základě jejich elektroforetických mobilit (cs.wikipedia.org) Gelová elektroforéza Z praktických důvodů se elektroforéza neprovádí přímo v roztoku, ale na vhodném nosiči. Jako hlavní nosič se v současné době používá gel. Gelová elektroforéza využívá gel nejen jako nosné médium, ale také jako síto, přes které malé molekuly procházejí lépe a rychleji než velké. Díku tomu lze dělit nabité molekuly podle velikosti. Elektroforetické gely jsou nejčastěji agarózové nebo polyakrylamidové. Optimální velikost separovaných molekul je u agarózových gelů 100 až bp, u polyakrylamidových 10 až 1000 bp. Gel z agarózy (polysacharid izolovaný z mořských řas) se připravuje rozvařením práškové agarózy v elektroforetickém pufru. Tuhne za pokojové teploty Jako elektroforetické pufry se používají TAE (trisacetátový pufr) a TBE (trisborátový). TAE je nejpoužívanější elektroforetický pufr, jeho pufrační kapacita je však nízká, a proto je vhodnější pro větší fragmenty DNA.

40 39 Vizualizace gelu Provádí se pomocí ethidium bromidu (EtBr), což je interkalační barvivo tvořící vazbu s DNA nebo RNA. Po navázání na molekulu DNA se až 20krát zvyšuje schopnost fluorescence, kterou lze detekovat po osvícení ultrafialovým světlem. Ethidium bromid je velmi silný mutagen s toxickým a karcinogenním účinkem. 4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Zvířata Do analýzy bylo zahrnuto celkem 305 ks prasat plemen české bílé ušlechtilé (218 ks), česká landrase (70 ks) a duroc (17 ks). Zvířata pocházela ze stanice kontroly výkrmnosti a jatečné hodnoty v Grygově z let Zkoušky VJH byly prováděny dle ČSN Kontrola výkrmnosti a jatečné hodnoty prasat, tzn. dvojice vepřík a prasnička ustájena vždy v samostatném kotci, byla krmena krmnou směsí GENT (složení živin: NL 18 %, VSŽ 74 %, ME 12 MJ/kg, vláknina 3,3 %, Lys 1,1-1,3 %, Met + Cys 0,6 %, Ca 0,85 %, P 0,65 %; surovinová skladba: pšenice %, ječmen %, ESŠ %, rybí moučka 6 %; registrovaný premix biofaktorů určený pro testační výkrm prasat a registrovaný minerální premix) a 1x měsíčně byla vážena. Test probíhal od 30 do 100 kg živé hmotnosti prasat Jatečné ukazatele Zvířata byla poražena v rozmezí hmotnosti kg a byly u nich sledovány tyto znaky jatečné hodnoty: HMTC - hmotnost jatečně opracovaného těla za tepla celkem (kg) HMSC - hmotnost jatečně opracovaného těla za studena celkem (kg) TRUP - délka trupu (cm) T1 - výška hřbetního tuku ke středu 2. hrudního obratle (mm) T2 - výška hřbetního tuku ke středu posledního hrudního obratle (mm) T3 - výška hřbetního tuku ke středu 1. křížového obratle (mm) TPRUM - průměrná výška hřbetního tuku (mm) KRK - hmotnost krkovice (kg)

41 40 KOTL - hmotnost kotlety (kg) PLEC - hmotnost plece (kg) KYTA - hmotnost kýty (kg) HMCPR - podíl hlavních masitých částí (%) Ukazatele kvality masa Hodnoty kvalitativních znaků masa byly stanoveny ze vzorků svalu musculus longissimus lumborum et thoracis v laboratoři Ústavu technologie potravin MZLU v Brně dle metodik uváděných Ingrem et al. (1993). - ph, charakterizuje průběh autolytických a proteolytických procesů v mase; je stanoveno ze vzorku nejdelšího zádového svalu na úrovni posledního žebra, 45 minut (ph 1 ) a 24 hodin (ph 24 ) po poražení - barva, je určena obsahem myoglobinu, reziduálního hemoglobinu a oxidoredukčních enzymů cytochromů, měří se barevný jas nebo světlost (remise - odrazivost nebo absorbance světla na povrchu masa) nebo se vizuálně porovnává s barevnou stupnicí remise (REM) - v procentech, pomocí SPEKOLU 11, při vlnové délce 525 nm myoglobin (MYO) - v mg/100g svaloviny, absorbance při vlnové délce 640 nm - obsah sušiny (SUS), v procentech - obsah intramuskulárního tuku (IMT), v procentech, jedná se obecně o lipidy a doprovodné látky lipidů v libové svalovině, které lze extrahovat organickými rozpouštědly, stanovení přímou extrakcí pomocí Soxhletova nebo Twisselmannova extrakčního přístroje 4.2 Izolace DNA Prasečí genomová DNA byla izolována z krve ošetřené EDTA klasickou proteinázovou metodou a pomocí QIAamp DNA Mini Kitu (QIAGEN proteasa). Uchovávána byla při teplotě -20 ºC.

42 41 Proteinázová metoda (Nebola et al., 1994): 1) Do zkumavky typu Eppendorf bylo napipetováno 500 µl TE pufru a přidáno 65 µl krve. 2) Krátce bylo protřepáno na třepačce Vortex a poté centrifugováno 2 minuty při otáčkách. 3) Následně byl slit supernatant, bylo přidáno 500 µl TE pufru a opakovalo se 2-3x od bodu 2). 4) K takto odstředěnému vzorku bylo přidáno 96 µl lyzačního mixu (na 1 vzorek 90 µl H 2 O, 10 µl lyzačního pufru, 0,6 µl proteinázy K). 5) Vzorky byly inkubovány přes noc v termostatu při 65 ºC. Obr. 11 Izolovaná DNA 4.3 PCR Podmínky cyklování Podmínky cyklování a složení reakčních směsí jsou uvedeny v tab. 2, 5 a 6. Samotná PCR reakce v celkovém objemu 25 µl proběhla v teplotním cykléru PTC-100 TM (MJ Research Inc.). K amplifikaci DNA byly použity primery převzaté od různých autorů (tab. 3).

43 42 Tab. 2 Podmínky PCR Úvodní Lokus denaturace Denaturace Annealing Elongace Závěrečná elongace Počet cyklů MYOD1 95ºC/2min 95ºC/1min 62ºC/1min 72ºC/90s 72ºC/7min 30 MYOG 95ºC/4min 95ºC/1min 60ºC/1min 72ºC/60s 72ºC/5min 30 MYF5 95ºC/2min 94ºC/1min 58ºC/1min 72ºC/90s 72ºC/10min 33 MYF6 95ºC/2min 95ºC/20s 60ºC/30s 68ºC/60s 68ºC/7min 30 IGF2 95ºC/2min 95ºC/30s 70ºC/30s 72ºC/90s 72ºC/7min 30 GDF8 95ºC/2min 94ºC/30s 52ºC/30s 72ºC/90s 72ºC/7min Použité primery Tab. 3 Použité primery Velikost Lokus produktu (bp) MYOD1 998 MYOG 353 MYF MYF6 379 IGF GDF Primery forward: TCC GAT TGA GGG CAT TAT CAG AAC A reverse: AGG AGA GGA GTT GGC ATT GAA G forward: TCA GGA AGA ACT GAA GGC TG reverse: GTT TCC TGG GGT GTT GC forward: GAC GGG TGG CTG TGA ATG AT reverse: CTG GCA ACT GGA GAG AGA GAA G forward: TGC TGC ACC GGC TGG ATC AG reverse: GCA GGA AAT CCG CAC CCT CAA forward: AGA CTC TGT GCG GCG GGG AGC T reverse: CGA GTG CGG TCC CCA ATG GAT forward: TCT GAG GGC AAA CTG CAT TAT C reverse: ACC AGC AAC AAT CAG CAT AAA C Zdroj Knoll et al. (1997) Te Pas et al. (1996) Stratil a Čepica (1999) Vykoukalová et al. (2003) Knoll et al. (2000) Stratil a Kopečný (1999)

44 Složení reakčních směsí Tab. 4 Původní koncentrace použitých reagencií složka koncentrace firma PCR buffer without MgCl 2 10 x Fermentas LA PCR buffer 10 x Top Bio MgCl 2 25 mm Fermentas DMSO 3 % Top Bio dntp 10 mm Fermentas primery 10 pmol KRD Taq DNA Polymerase 5U/µl Fermentas LA DNA Polymerase 5U/µl Top Bio Tab. 5 Reakční směsi PCR pro jednotlivé geny I konečná složka (µl) MYOG MYF5 GDF8 koncentrace DNA dh 2 O Master Mix dh 2 O - 9,3 8,7 9,3 pufr pro Taq polymerázu 1x 2,5 2,5 2,5 Mg 2+ 1,5 mm 1,5 1,5 1,5 dntp 200 (400) µm 0,5 1,0 0,5 primery 0,2 µm 0,5/0,5 0,5/0,5 0,5/0,5 Taq polymeráza 2U (3U) 0,2 0,3 0,2 celkem

45 44 Tab. 6 Reakční směsi pro jednotlivé geny II konečná složka (µl) koncentrace MYOD1 MYF6 IGF2 DNA dh 2 O Master Mix dh 2 O - 9,6 9,6 9,4 LA pufr komplet 1x 2,5 2,5 2,5 DMSO 3,2 % 0,8 0,8 0,8 dntp 400 µm 1,0 1,0 1,0 primery 0,2 µm 0,5/0,5 0,5/0,5 0,5/0,5 LA DNA polymeráza 1U (3U) 0,1 0,1 0,3 celkem RFLP Získané PCR produkty byly štěpeny panelem restrikčních endonukleas (tab.). Reakce proběhla v celkovém objemu 16 µl za inkubace v termostatu přes noc při teplotě 37 C. Množství jednotlivých reagencií je uvedeno v tab. 7. Tab. 7 Restrikční směsi RFLP pro jednotlivé geny složka (µl) MYOD1 MYOG MYF5 MYF6 IGF2 GDF8 PCR produkt Master Mix H 2 O 4,2 4,3 4 4,3 4 4 pufr 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 restrikční enzym 0,3 0,2 0,5 0,2 0,5 0,5 celkem

46 45 Tab. 8 Použité restrikční endonukleasy gen endonukleasa rozpoznávací sekvence polymorfismus MYOD1 DdeI C TNAG GANT C Knoll et al. (1997) MYOG MspI C CGG GGC C Te Pas et al. (1996) MYF5 HpaII C CGG GGC C Stratil a Čepica (1999) MYF6 BseRI GAGGAG(N)10 10(N)GAGGAG Vykoukalová et al. (2003) IGF2 NciI CC SGG GGS CC Knoll et al. (2000) GDF8 DraI TTT AAA AAA TTT Stratil a Kopečný (1999) 4.5 Elektroforéza reagencie: - agaróza - 1 0,04 M Tris-acetát 1 mm EDTA (TAE) - ethidium bromid (EtBr) 1) prášková agaróza byla rozpuštěna v TAE pufru a byla krátce povařena 2) byl přidán EtBr 3) gel byl nalit do elektroforetické vaničky s hřebínkem a ponechán ke ztuhnutí 4) vanička se ztuhlým gelem byla vložena do elektroforetické vany s pufrem 5) do jamek v gelu byl napipetován vzorek DNA (PCR produkt, naštěpená DNA) 6) do elektroforetické vany byl zaveden stejnosměrný el. proud Kontrola DNA, PCR produktu a restrikčního štěpení Kvalita izolované DNA byla ověřena na 1 % agarózovém gelu, kontrola kvality PCR produktu a restrikčního štěpení byla provedena agarózovém gelu o koncentraci 1,2-1,4 %, respektive 1,5-2,5 %.

47 Optimalizace metody alelické diskriminace Kauzální mutaci v intronu 3 genu IGF2 nelze testovat klasickou metodou PCR- RFLP, byla proto optimalizována metodika nová, tzv. 5 nukleázová assay pro alelickou diskriminaci. K analýze byla použita DNA z krevních vzorků plemene ČBU. Podle zjištěných absorbancí byly spočítány koncentrace duálně značených alelově specifických sond FAM a VIC jako 9,11 µm, respektive 28 µm. Z těchto hodnot bylo vypočítáno množství přidané do reakce v konečné koncentraci 200 nm. Na základě sekvence genu IGF2 v databázi EMBL bylo pomocí programu Primer Express navrženo celkem 6 primerů ohraničujících amplifikované úseky o velikostech 145, 291 a 715 bp (tab. 9). Primery byly naředěny na konečnou koncentraci 900 nm. Složení reakční směsi a podmínky cyklování jsou uvedeny v tab. 10 a 11. Jednotlivé kroky vlastní PCR reakce byly obdobné jako u klasické PCR, pouze před úvodní denaturací se provedla tzv. iniciace při teplotě 50 ºC po dobu 2 minut (potřebná pro aktivaci enzymu UNG, který zabraňuje kontaminaci vlastním PCR produktem štěpením uracilu, který je v původním mastermixu obsažen namísto thyminu) a dále pro annealing a elongaci byla jednotná teplota 60 ºC po dobu 1 minuty. Reakce v celkovém objemu 25 µl proběhla na přístroji 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems). Následné vyhodnocení bylo automaticky provedeno počítačem pomocí programu SDS 1.2 Tab. 9 Přehled navržených primerů pro Real-Time PCR název primeru sekvence primeru počet nukleotidů Tm (ºC) Tm PrimEx 50nM (ºC) PCR produkt (bp) IGF2 10A GAC CGA GCC AGG GAC GA 17 53, IGF2 10B GGG TCC CCA GGC TCC C 16 54, IGF2 12A CAG TCC TTC CAC TCT CTC AAT TCC IGF2 12B CCC ACT TGT GAT CTG GAG AAA TG IGF2 13A CCT CCG GGG ACT GTT GAA G 19 54, IGF2 13B AAG GGA GGA AGC CGA GAG C 19 54,

48 47 Tab. 10 Reakční směs Real-Time PCR pro gen IGF2 složka konečná koncentrace množství na 1 vzorek (µl) DNA - 3 TaqMan 0,5 x 12,5 primer A 900 nm 2,25 primer B 900 nm 2,25 FAM 200 nm 1,95 VIC 200 nm 1,2 DMSO 3,6 % 0,9 dh 2 O - 0,95 celkem - 25 Tab. 11 Podmínky Real-Time PCR Lokus Iniciace Úvodní denaturace Denaturace Annealing / Elongace Počet cyklů IGF2 50ºC/2min 95ºC/10min 92ºC/15s 60ºC/1min 40 Sekvence jednotlivých sond byly následující: sonda FAM (značená modře): TCC CGC GCT GTG AGC CTA GG...pro alelu A sonda VIC (značená červeně): TCC CGC GCT GCG AGC CTA GG...pro alelu G Obr. 12 Část sekvence intronu 3 s vyznačenými primery, sondami a mutací

49 Asociační analýza Statistický model Pro asociační analýzu byl použit smíšený lineární model (REML) v programu SAS for Windows Použitá modelová rovnice byla následující: y ijklmnop = μ + GEN i + POHL j + PLEM k + ROK/MES l + OTEC m + ZIVHM n + e ijklmno kde: y ijklmnop μ GEN i POHL j PLEM k ROK/MES l OTEC m ZIVHM n e ijklmno = sledovaný znak = průměr = pevný efekt genotypu příslušného genu = pevný efekt vlivu pohlaví = pevný efekt vlivu plemene = pevný efekt vlivu roku/měsíce porážky = náhodný efekt vlivu otce = lineární regrese na živou hmotnost = náhodná reziduální chyba Z důvodu malého počtu jedinců plemene ČL nebyla provedena analýza zvlášť pro jednotlivá plemena a plemeno duroc nebylo navíc do analýzy vůbec zahrnuto. Geny MYF5 a GDF8 nebyly zahrnuty do statistické analýzy ze dvou důvodů: komerční plemena byla v genu MYF5 monomorfní pro alelu B a u GDF8 nebyly pro malý počet jedinců detekovány všechny genotypy.

50 49 5 VÝSLEDKY 5.1 PCR produkty a jejich štěpení MYOD1 Amplifikovaný úsek o délce 998 bp měl celkem tři restrikční místa a byl štěpen na čtyři fragmenty (477, 317, 114 and 90 bp). Alela A byla naštěpena do čtyř fragmentů o délkách 477, 317, 114 a 90 bp, zatímco alela B obsahovala polymorfní štěpné místo pro restrikční endonukleasu DdeI, a úsek 477 bp tak byl naštěpen do fragmentů o délkách 385 a 92 bp (obr. 14). Obr. 13 MYOD1 PCR produkty délky 998 bp 1200 bp 500 bp Obr. 14 Štěpení MYOD1 enzymem DdeI naštěpené PCR produkty 10 - puc Mix Marker 8 o délkách 1116, 883, 692, 501/489, 404, 331, 242, 190, 147 a 111/110 bp MYOG Byl získán úsek očekávané délky 353 bp. Alela A obsahovala polymorfní štěpné místo pro restrikční endonukleasu MspI a byla naštěpena do dvou fragmentů o délkách 219 a 134 bp, zatímco alela B zůstala neštěpená o délce 353 bp (obr. 16).

51 50 Obr. 15 MYOG PCR produkty délky 353 bp 404 bp 331 bp Obr. 16 Štěpení MYOG enzymem MspI puc19 DNA / MspI marker o délkách 501/489, 404, 331, 242, 190, 147, 111/110 a 67 bp 2-9 naštěpené PCR produkty MYF5 Amplifikovaný fragment délky 1200 bp byl naštěpen do 1000 a 190 bp (alela A) a 550, 450 a 190 bp (alela B) (obr. 18). Obr. 17 MYF5 PCR produkty délky 1200 bp 1500 bp 1200 bp Obr. 18 Štěpení MYF5 enzymem HpaII GeneRuler 100bp DNA Ladder o délkách 1031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 80 bp 2-7 naštěpené PCR produkty

52 51 MYF6 Fragment délky 379 bp byl charakteristický pro alelu A, zatímco alela B měla štěpné místo pro restrikční endonukleasu BseRI, která naštěpila úsek 379 bp na dva fragmenty v délkách 216 a 163 bp (obr. 20). Obr. 19 MYF6 PCR produkty délky 379 bp 400 bp Obr. 20 Štěpení MYF6 enzymem BseRI naštěpené PCR produkty 9 - GeneRuler 100 bp DNA Ladder o délkách 1031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 80 bp IGF2 PCR produkt v délce 1600 bp byl restrikčním enzymem NciI naštěpen na fragmenty 900 bp (alela A) a 800 a 100 bp (alela B) (obr. 22). Obr. 21 IGF2 PCR produkty délky 1600 bp 1500 bp

53 52 Obr. 22 Štěpení IGF2 enzymem NciI naštěpené PCR produkty 6 - GeneRuler 100 bp DNA Ladder o délkách 1031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 80 bp GDF8 Amplikon délky 1027 bp obsahoval restrikční místo pro DraI a byl štěpen na fragmenty 422 bp (alela T) a 358 bp (alela A) (obr. 24). Obr. 23 GDF8 PCR produkty délky 1027 bp 1031 bp Obr. 24 Štěpení GDF8 enzymem DraI GeneRuler 100 bp DNA Ladder o délkách 1031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 80 bp 2-6 naštěpené PCR produkty

54 Alelická diskriminace Na základě navržených primerů (10A, 10B) vymezujících specifický úsek v délce 145 bp a na základě duálně značených sond FAM (modrá) a VIC (červená) byly detekovány (diskriminovány) genotypy AA, AG a GG (viz obr. 21), charakterizující kauzální mutaci v intronu 3 genu IGF2. Obr. 23 Alelická diskriminace 5.3 Frekvence alel a genotypů Frekvence alel v genech MYOD1, MYOG a MYF5 jsou uvedeny v tab. 12, frekvence jejich genotypů jsou v tab. 14. Frekvence alel a genotypů v genech MYF6, IGF2 a GDF8 jsou uvedeny v tab. 13 a 15.

55 54 Tab. 12 Frekvence alel v genech MYOD1, MYOG a MYF5 Plemeno české bílé ušlechtilé MYOD1 MYOG MYF5 A B A B A B 0,50 0,50 0,62 0,38 0,02 0,98 česká landrase 0,64 0,36 0,73 0,27 0,01 0,99 duroc 0,59 0,41 0,72 0,28 0,00 1,00 Tab. 13 Frekvence alel v genech MYF6, IGF2 a GDF8 Plemeno české bílé ušlechtilé MYF6 IGF2 GDF8 A B A B T A 0,60 0,40 0,14 0,86 0,95 0,05 česká landrase 0,61 0,39 0,17 0,83 0,97 0,03 duroc 0,59 0,41 0,28 0,72 0,97 0,03 Tab. 14 Absolutní (n) a relativní (R) frekvence genotypů MYOD1, MYOG a MYF5 Plemeno MYOD1 / DdeI MYOG / MspI MYF5 / HpaII AA AB BB AA AB BB AA AB BB české bílé n ušlechtilé R 0,22 0,53 0,25 0,39 0,46 0,15 0,00 0,04 0,96 česká n landrase R 0,40 0,49 0,11 0,52 0,42 0,06 0,00 0,02 0,98 duroc n R 0,29 0,53 0,18 0,56 0,31 0,13 0,00 0,00 1,00 Tab. 15 Absolutní (n) a relativní (R) frekvence genotypů MYF6, IGF2 a GDF8 Plemeno MYF6 / BseRI IGF2 / NciI GDF8 / DraI AA AB BB AA AB BB TT TA AA české bílé n ušlechtilé R 0,23 0,73 0,04 0,06 0,16 0,78 0,90 0,09 0,01 česká n landrase R 0,23 0,75 0,02 0,06 0,21 0,73 0,94 0,06 0,00 duroc n R 0,25 0,69 0,06 0,19 0,19 0,62 0,93 0,07 0,00

56 55 U plemene ČBU byly u MYOD1 zjištěny frekvence genotypů AA 0,22, AB 0,53 a BB 0,25. Výskyt obou alel v souboru těchto prasat byl v poměru 1:1, čemuž odpovídá i výskyt heterozygotních jedinců. Alela A a heterozygotní jedinci převažovali u ostatních plemen. U genu MYOG převažoval u všech plemen výskyt alely A (69 %) a z genotypů byl nejméně zastoupen BB. U genu MYF5 nebyl zjištěn žádný výskyt genotypu AA, zatímco genotyp BB se vyskytoval v nejvyšší frekvenci u všech plemen, která tak byla v tomto případě monomorfní. U plemene duroc byl výskyt alely B dokonce stoprocentní. Co se týká frekvence alel u genu MYF6, převažovala u všech plemen alela A. V zastoupení genotypů markantně převažovali heterozygotní jedinci s průměrným výskytem 72,3 %. Z této studie vyplývá, že u genu IGF2 z 80 % převažovala u všech plemen alela B a také genotyp BB byl nejčetnější (71 %). U genu GDF8 se s drtivou převahou (téměř 97 %) v souboru všech plemen vyskytovala alela T. U plemen ČL a duroc nebyl zaznamenán žádný výskyt genotypu AA, u pl. ČBU tento genotyp vykazoval pouze jeden jedinec. 5.4 Sledované znaky jatečné hodnoty u plemene ČBU MYOD1 Jak ukazuje tab. 16, u plemene ČBU nebyly pro znaky jatečné hodnoty žádné významné statistické průkaznosti odhaleny. Pouze u výšky hřbetního tuku se vztah mezi genotypy AB a BB blížil průkaznosti (P 0,01). Genotyp BB vykazoval nejvyšší hodnoty pro znaky tučnosti, zatímco genotyp AA ovlivňoval nejvíce zmasilost a podíl HMČ. MYOG Co se týká znaků jatečné hodnoty u MYOG, meziplemenné rozdíly jsou patrné zejména u výšky hřbetního tuku nebo délky jatečného těla. V této práci byly zjištěny vysoce průkazné rozdíly (P 0,01) v délce jatečného těla, a to mezi genotypy AA a BB, jak je patrné z tab. 16. Genotyp AA vykazoval nejvyšší hodnoty u obou plemen, a to pro znaky zmasilosti a podíl hlavních masitých částí.

57 56 Tab. 16 ČBU: LSM znaků jatečné hodnoty pro genotypy MYOD1 a MYOG sledovaný MYOD1 / DdeI MYOG / MspI znak AA AB BB AA AB BB HMTC (kg) 80,93±0,33 80,62±0,25 80,91±0,33 80,93±0,28 80,78±0,29 80,83±0,42 HMSC (kg) 78,17±0,59 78,68±0,45 79,04±0,59 78,98±0,52 78,42±0,55 78,65±0,75 TRUP (cm) 79,62±0,29 79,84±0,21 79,93±0,28 80,42±0,22 AB 79,82±0,23 B 79,22±0,33 A T1 (mm) 28,48±0,78 28,22±0,58 29,54±0,77 28,45±0,67 28,57±0,70 28,55±1,00 T2 (mm) 16,38±0,61 16,16±0,45 17,08±0,59 16,01±0,45 15,92±0,35 16,82±0,52 T3 (mm) 11,15±0,50 11,04±0,38 11,22±0,48 10,88±0,41 11,29±0,43 * 10,10±0,60 * TPRUM (mm) 18,80±0,52 18,35±0,40 * 19,26±0,51 * 18,59±0,45 18,71±0,47 18,61±0,66 KRK (kg) 3,78±0,05 3,78±0,04 3,76±0,05 3,83±0,04 3,75±0,04 3,78±0,07 KOTL (kg) 4,75±0,06 4,65±0,05 4,73±0,06 4,74±0,05 4,68±0,05 4,65±0,08 PLEC (kg) 4,21±0,06 4,22±0,04 4,22±0,06 4,23±0,05 4,25±0,05 4,22±0,07 KYTA (kg) 8,58±0,13 8,35±0,10 8,51±0,16 8,49±0,11 8,38±0,12 8,57±0,17 HMCPR (%) 54,40±0,41 53,84±0,32 54,00±0,40 54,14±0,34 54,05±0,36 54,45±0,51 Zjištěná průkaznost: P 0,01 (A); P 0,05 (B); P 0,1 (*); HMTC, HMSC - hm. jatečně opracovaného těla za tepla a za studena, T1 - výška hřb. tuku ke středu 2.hrudního obratle, T2 - výška hřb. tuku ke středu posledního hrudního obratle, T3 - výška hřb. tuku ke středu 1. křížového obratle, TPRUM - prům. výška hřbetního tuku, HMCPR - podíl hlavních masitých částí MYF5 I přes nulový výskyt genotypu AA byla u plemene ČBU spočítána asociační analýza a byl zjištěn průkazný rozdíl (P 0,05) mezi genotypy a výškou hřbetního tuku měřenou ke středu prvního křížového obratle, kdy rozdíl téměř 2,5 mm byl daleko největší ze všech studovaných plemen. U hmotnosti kotlety a podílu hlavních masitých částí se rozdíl mezi genotypy blížil průkaznosti (P 0,1) (Tab. 17). MYF6 Jak vyplývá z tab. 17, žádné významné průkaznosti nebyly mezi genotypy MYF6 a znaky masné užitkovost zjištěny. Pouze u výšky hřbetního tuku T2 se vztah mezi genotypy AB-BB blížil průkaznosti (P 0,1). Genotyp BB vykazoval nejvyšší hodnoty u všech sledovaných znaků.

58 57 Tab. 17 ČBU: LSM znaků jatečné hodnoty pro genotypy MYF5 a MYF6 sledovaný MYF5 / HpaII MYF6 / BseRI znak AA AB BB AA AB BB HMTC (kg) - 81,77±0,75 80,74±0,21 80,98±0,35 80,75±0,25 81,78±0,80 HMSC (kg) - 79,63±1,34 78,62±0,40 78,84±0,65 78,59±0,48 80,18±1,46 TRUP (cm) - 79,83±0,63 79,83±0,18 80,00±0,28 79,98±0,20 80,25±0,64 T1 (mm) - 27,76±1,85 28,29±0,50 28,18±0,81 28,62±0,58 29,77±1,89 T2 (mm) - 18,34±1,32 16,30±0,38 16,85±0,63 16,29±0,44 * T3 (mm) - 13,27±1,07 B 11,01±0,33 B 19,07±1,43 * 11,03±0,51 10,77±0,37 12,57±1,16 TPRUM (mm) - 19,78±1,17 18,50±0,34 18,70±0,55 18,52±0,39 20,40±1,26 KRK (kg) - 3,76±0,12 3,78±0,03 3,79±0,05 3,79±0,04 3,81±0,13 KOTL (kg) - 4,43±0,14 * 4,70±0,04 * 4,70±0,07 4,70±0,05 4,87±0,15 PLEC (kg) - 4,21±0,12 4,22±0,03 4,25±0,06 4,23±0,04 4,25±0,14 KYTA (kg) - 8,40±0,30 8,46±0,08 8,50±0,14 8,44±0,10 8,56±0,33 HMCPR (%) - 52,45±0,87 * 54,08±0,28 * 53,99±0,43 54,12±0,31 54,22±0,96 Zjištěná průkaznost: P 0,05 (B); P 0,1 (*);HMTC, HMSC - hm. jatečně opracovaného těla za tepla a za studena, T1 - výška hřb. tuku ke středu 2.hrudního obratle, T2 - výška hřb. tuku ke středu posledního hrudního obratle, T3 - výška hřb. tuku ke středu 1. křížového obratle, TPRUM - prům. výška hřbetního tuku, HMCPR - podíl hlavních masitých částí IGF2 Vysoce průkazný rozdíl (P 0,01) byl zjištěn u plemene ČBU u výšky hřbetního tuku měřené ke středu druhého hrudního obratle, a to mezi genotypy AA-AB, a průkazný rozdíl (P 0,05) u výšky hřbetního tuku měřené ke středu posledního hrudního obratle, a to mezi AA-BB. U výšky hřbetního tuku byly největší hodnoty v genotypu AA (Tab. 18). GDF8 Asociace s obsahem libového masa byla pozorována u plemene ČBU. Zdánlivá průkaznost (P 0,1) mezi genotypy byla pozorována u hmotnosti kotlety, zatímco průkazný rozdíl (P 0,05) byl nalezen mezi genotypy u podílu hlavních masitých částí (Tab. 18).

59 58 Tab. 18 ČBU: LSM znaků jatečné hodnoty pro genotypy IGF2 a GDF8 sledovaný IGF2 / NciI GDF8 / DraI znak AA AB BB TT TA AA HMTC (kg) 80,52±0,60 80,74±0,41 80,82±0,24 80,91±0,27 81,07±0,59 - HMSC (kg) 78,43±1,11 78,87±0,76 78,60±0,47 78,74±0,56 78,96±1,20 - TRUP (cm) 79,72±0,50 79,90±0,32 80,09±0,19 80,00±0,20 79,80±0,44 - T1 (mm) 32,23±1,45 A T2 (mm) 18,70±1,06 B* 26,88±0,94 A 16,45±0,74 * 28,23±0,55 28,65±0,65 27,75±1,42-16,20±0,43 B 16,67±0,48 17,27±1,05 - T3 (mm) 11,74±0,89 10,48±0,62 10,90±0,37 11,24±0,38 10,03±0,76 - TPRUM (mm) 20,04±0,94 * 17,98±0,65 * 18,47±0,38 18,82±0,43 18,18±0,90 - KRK (kg) 3,75±0,10 3,79±0,07 3,81±0,04 3,81±0,04 3,90±0,08 - KOTL (kg) 4,53±0,12 4,73±0,08 4,71±0,05 4,64±0,05 * 4,83±0,11 * PLEC (kg) 4,11±0,10 4,19±0,07 4,25±0,04 4,25±0,05 4,39±0,10 - KYTA (kg) 8,34±0,25 8,40±0,17 8,50±0,10 8,43±0,12 8,80±0,26 - HMCPR (%) 53,46±0,72 54,27±0,50 54,23±0,30 54,24±0,32 B 55,63±0,67 B Zjištěná průkaznost: P 0,01 (A); P 0,05 (B); P 0,1 (*);HMTC, HMSC - hm. jatečně opracovaného těla za tepla a za studena, T1 - výška hřb. tuku ke středu 2.hrudního obratle, T2 - výška hřb. tuku ke středu posledního hrudního obratle, T3 - výška hřb. tuku ke středu 1. křížového obratle, TPRUM - prům. výška hřbetního tuku, HMCPR - podíl hlavních masitých částí Sledované znaky jatečné hodnoty u plemene ČL MYOD1 U plemene ČL byly nalezeny vysoce průkazné rozdíly (P 0,01) mezi genotypy AA a AB u hmotnosti kýty a hmotnosti jatečného těla za tepla i za studena. U hmotnosti krkovice a kotlety se vztah blížil průkaznosti mezi genotypy AB-BB, respektive AA-AB. U znaků kvality masa nebyla zjištěna žádná průkaznost (Tab. 19). MYOG Z tab. 19 je patrné, že vysoce průkazný rozdíl (P 0,01) byl zjištěn mezi genotypy AA-AB pro výšku hřbetního tuku T2 a průkazný rozdíl (P 0,05) mezi genotypy AA-AB pro průměrnou výšku hřbetního tuku. Zdánlivá průkaznost (P 0,1) byla potom zjištěna u kýty a podílu hlavních masitých částí.

60 59 Tab. 19 ČL: LSM znaků jatečné hodnoty pro genotypy MYOD1 a MYOG sledovaný MYOD1 / DdeI MYOG / MspI znak AA AB BB AA AB BB HMTC (kg) HMSC (kg) 78,88±0,49 AB 76,85±0,48 AB 81,03±0,52 A 78,97±0,50 A 81,30±0,90 B 79,34±0,87 B 80,19±0,46 80,48±0,48 79,67±0,93 78,18±0,45 78,45±0,47 77,66±0,92 TRUP (cm) 81,75±0,58 81,29±0,60 81,92±1,05 81,37±0,57 80,86±0,58 80,60±1,14 T1 (mm) 28,20±1,32 26,88±1,39 26,26±2,47 25,23±1,02 29,47±1,06 27,96±2,35 T2 (mm) 16,12±0,83 16,54±0,88 14,03±1,59 15,89±0,43 A 15,90±0,55 A 16,25±0,32 T3 (mm) 11,35±0,62 10,45±0,65 10,70±1,14 10,01±0,59 11,25±0,60 10,44±1,22 TPRUM (mm) 18,57±0,77 17,86±0,81 17,00±1,47 16,64±0,62 B KRK (kg) 3,82±0,07 3,65±0,07 * KOTL (kg) 4,58±0,08 * 4,83±0,09 * 3,92±0,12 * 19,13±0,65 B 17,53±1,42 3,81±0,06 3,80±0,06 3,73±0,14 4,56±0,16 4,74±0,08 4,65±0,08 4,49±0,18 PLEC (kg) 4,19±0,09 4,35±0,09 4,40±0,16 4,38±0,07 4,25±0,08 4,13±0,16 KYTA (kg) 8,13±0,12 A 8,68±0,13 A 8,38±0,22 8,60±0,11 * HMCPR (%) 53,97±0,51 54,53±0,50 53,59±0,93 54,75±0,37 * 8,31±0,12 * 53,52±0,45 * 8,57±0,25 54,38±0,90 Zjištěná průkaznost: P 0,01 (A); P 0,05 (B); P 0,1 (*);HMTC, HMSC - hm. jatečně opracovaného těla za tepla a za studena, T1 - výška hřb. tuku ke středu 2.hrudního obratle, T2 - výška hřb. tuku ke středu posledního hrudního obratle, T3 - výška hřb. tuku ke středu 1. křížového obratle, TPRUM - prům. výška hřbetního tuku, HMCPR - podíl hlavních masitých částí MYF5, MYF6 U plemene ČL nebyl gen MYF5 z důvodu monomorfismu zařazen do asociační analýzy. Žádné významné průkaznosti mezi genotypy MYF6 a znaky masné užitkovost nebyly zjištěny (Tab. 20). Tab. 20 ČL: LSM pro znaky jatečné hodnoty pro genotypy MYF6 sledovaný znak MYF6 / BseRI AA AB BB HMTC (kg) 79,48±0,57 80,62±0,39 79,60±1,37 HMSC (kg) 77,45±0,55 78,60±0,38 77,52±1,36 TRUP (cm) 81,04±0,74 81,09±0,50 80,49±1,77 T1 (mm) 26,68±1,45 27,76±0,93 23,30±3,87 T2 (mm) 15,65±1,03 15,57±0,66 15,49±2,66 T3 (mm) 9,83±0,80 10,99±0,55 10,50±1,84 TPRUM (mm) 17,50±0,89 18,01±0,57 16,92±2,36 KRK (kg) 3,83±0,08 3,79±0,05 3,54±0,21 KOTL (kg) 4,67±0,11 4,67±0,07 4,86±0,27 PLEC (kg) 4,40±0,10 4,26±0,07 4,13±0,24 KYTA (kg) 8,52±0,15 8,45±0,10 8,34±0,39 HMCPR (%) 55,06±0,53 53,95±0,33 53,85±1,41

61 60 IGF2 U plemene ČL byl zjištěn průkazný rozdíl (P 0,05) mezi genotypy AA-AB a výškou hřbetního tuku T3. Zdánlivá průkaznost (P 0,1) byla nalezena pro délku jatečného těla (AA-BB) a hmotnost kotlety (AB-BB). GDF8 U tohoto genu nebyly pozorovány žádné asociace se znaky kvality masa, přestože rozdíly mezi genotypy u výšek hřbetního tuku (téměř 2 mm) byly největší ze všech genů. Tab. 21 ČL: LSM pro znaky jatečné hodnoty pro genotypy IGF2 a GDF8 sledovaný IGF2 / NciI GDF8 / DraI znak AA AB BB TT TA AA HMTC (kg) 80,66±1,03 80,10±0,79 80,18±0,40 80,11±0,39 78,40±1,54 - HMSC (kg) 78,66±1,01 78,10±0,76 78,16±0,39 78,07±0,39 76,33±1,53 - TRUP (cm) 79,27±1,07 * 80,97±0,83 81,35±0,46 * 80,62±0,56 79,71±1,34 - T1 (mm) 27,76±2,55 27,81±1,95 27,35±0,95 27,05±0,96 31,95±3,37 - T2 (mm) 15,65±1,48 15,15±1,14 15,40±0,59 14,89±0,62 16,59±2,14 - T3 (mm) 13,36±1,14 B 9,36±0,88 B 10,29±0,45 10,40±0,48 10,79±1,80 - TPRUM (mm) 18,88±1,44 17,44±1,10 17,67±0,54 17,46±0,57 19,82±2,02 - KRK (kg) 3,79±0,14 3,78±0,11 3,81±0,05 3,83±0,05 3,78±0,18 - KOTL (kg) 4,84±0,17 4,86±0,13 * 4,62±0,07 * 4,68±0,06 4,97±0,22 - PLEC (kg) 4,40±0,16 4,36±0,12 4,31±0,06 4,33±0,06 3,86±0,23 - KYTA (kg) 8,79±0,25 8,67±0,19 8,44±0,09 8,48±0,08 8,42±0,32 - HMCPR (%) 54,69±0,85 54,70±0,64 54,26±0,32 54,32±0,32 54,07±1,47 - Zjištěná průkaznost: P 0,05 (B); P 0,1 (*) 5.6 Sledované znaky kvality masa u plemene ČBU MYOD1 U plemene ČBU nebyly žádné významné statistické průkaznosti u znaků kvality masa nalezeny, pouze u obsahu intramuskulárního tuku se blížil průkaznosti (P 0,1) vztah mezi genotypy AB-BB a u PH 1 a PH 24 mezi genotypy AB-BB, respektive AA-AB (Tab. 22). MYOG Rozdíl, blížící se průkaznosti (P 0,1) byl zjištěn mezi genotypy AA-BB u obsahu myoglobinu (Tab. 22).

62 61 Tab. 22 ČBU: LSM znaků kvality masa pro genotypy MYOD1 a MYOG sledovaný znak MYOD1 / DdeI PH1 5,99±0,03 5,98±0,02 * PH24 5,85±0,02 * MYOG / MspI AA AB BB AA AB BB 5,88±0,01 * 5,93±0,03 * 5,96±0,02 5,96±0,02 60,1±0,03 5,88±0,02 5,86±0,02 5,88±0,02 5,86±0,02 REM (%) 23,96±1,29 23,70±0,76 23,76±0,88 22,87±0,89 24,77±0,93 22,87±1,29 SUS (%) 26,22±0,17 25,88±0,10 25,94±0,11 25,86±0,11 25,84±0,12 26,08±0,16 MYO (mg/100g) 74,11±3,81 74,84±2,24 73,30±2,64 78,27±2,58 * 72,54±2,69 69,34±3,73 * IMT (%) 1,59±0,21 1,43±0,13 * 1,65±0,16 * 1,39±0,15 1,65±0,15 1,35±0,19 Zjištěná průkaznost: P 0,1 (*); REM - remise, SUS - obsah sušiny, MYO - obsah myoglobinu, IMT - obsah intramuskulárního tuku MYF5 Jediným znakem kvality masa, u kterého byl zjištěn nějaký vztah, bylo ph 1. Zde se rozdíl v genotypech blížil průkaznosti (P 0,1) (Tab. 23). MYF6 V tab. 23 je jasně vidět, že rozdíl mezi genotypem BB a ostatními genotypy u obsahu myoglobinu byl více než markantní, nicméně přesto zde nebyla zjištěna žádná významná průkaznost. Tab. 23 ČBU: LSM znaků kvality masa pro genotypy MYF5 a MYF6 MYF5 / HpaII MYF6 / BseRI sledovaný znak AA AB BB AA AB BB PH1-5,82±0,08 * 5,98±0,01 * 5,99±0,03 5,96±0,02 6,03±0,07 PH24-5,84±0,05 5,87±0,01 5,87±0,02 5,86±0,01 5,86±0,05 REM (%) - 26,83±1,89 23,59±0,57 23,93±1,12 23,95±0,87 23,14±2,96 SUS (%) - 26,06±0,25 25,90±0,07 25,92±0,14 25,77±0,11 26,63±0,36 MYO (mg/100g) - 77,50±6,06 73,70±1,78 76,06±3,06 76,94±2,35 52,91±8,11 IMT (%) - 1,36±0,18 1,46±0,05 1,53±0,21 1,48±0,14 1,38±0,50 Zjištěná průkaznost: P 0,1 (*); REM - remise, SUS - obsah sušiny, MYO - obsah myoglobinu, IMT - obsah intramuskulárního tuku IGF2 Rozdíl, blížící se průkaznosti (P 0,1) byl opět pozorován u ph 1, a to mezi genotypy AA-AB. Ostatní znaky kvality masa nejevily žádné významné statistické rozdíly, stejně jako u GDF8 (Tab. 24).

63 62 Tab. 24 ČBU: LSM znaků kvality masa pro genotypy IGF2 a GDF8 sledovaný znak PH1 6,04±0,05 * IGF2 / NciI GDF8 / DraI AA AB BB TT TA AA 5,93±0,03 * 5,97±0,02 5,96±0,02 5,92±0,05 - PH24 5,85±0,04 5,89±0,02 5,86±0,01 5,87±0,02 5,88±0,04 - REM (%) 25,49±2,70 23,48±1,50 23,60±0,73 24,26±1,03 20,59±2,42 - SUS (%) 25,83±0,33 25,84±0,18 25,88±0,09 25,86±0,12 25,90±0,27 - MYO (mg/100g) 77,74±7,30 74,12±4,05 75,85±1,99 77,85±2,75 75,73±6,48 - IMT (%) 1,56±0,26 1,39±0,22 1,48±0,12 1,62±0,24 1,44±0,31 - Zjištěná průkaznost: P 0,1 (*); REM - remise, SUS - obsah sušiny, MYO - obsah myoglobinu, IMT - obsah intramuskulárního tuku 5.7 Sledované znaky kvality masa u plemene ČL Vzhledem k nedostatečnému počtu zvířat v konkrétním genotypu nebylo možné provést asociační analýzu v těchto případech: gen MYOG - celkem 3 zvířata s genotypem BB gen MYF5 - celkem 1 zvíře s genotypem AB gen MYF6 - celkem 1 zvíře s genotypem BB gen IGF2 - celkem 3 zvířata s genotypem AA gen GDF8 - celkem 2 zvířata s genotypem TA MYOD1, MYOG U obou těchto genů nebyla ani u jednoho znaku kvality masa zjištěna jakákoliv významná průkaznost. Navíc u MYOG nebyl genotyp BB pro nedostatečné zastoupení vyhodnocen (Tab. 25). Tab. 25 ČL: LSM znaků kvality masa pro genotypy MYOD1 a MYOG MYOD1 / DdeI MYOG / MspI sledovaný znak AA AB BB AA AB BB PH1 5,63±0,18 5,92±0,17 5,90±0,33 5,86±0,19 5,75±0,19 - PH24 5,82±0,03 5,83±0,03 5,80±0,05 5,84±0,03 5,80±0,03 - REM (%) 21,46±1,17 23,95±1,48 20,75±2,12 21,34±1,06 21,79±1,03 - SUS (%) 25,83±0,19 25,77±0,24 25,06±0,36 25,66±0,18 26,16±0,18 - MYO (mg/100g) 79,95±4,27 77,10±5,22 73,91±7,40 74,55±4,50 80,93±4,34 - IMT (%) 1,88±0,16 1,59±0,18 2,17±0,30 1,86±0,21 1,79±0,19 - REM - remise, SUS - obsah sušiny, MYO - obsah myoglobinu, IMT - obsah intramuskulárního tuku

64 63 MYF6, IGF2 Stejný případ jako u genu MYOG. Jediná průkaznost (P 0,05) byla pozorována u genu IGF2 pro obsah intramuskulárního tuku, a to mezi genotypy AB-BB (Tab. 26). Tab. 26 ČL: LSM znaků kvality masa pro genotypy MYF6 a IGF2 sledovaný znak MYF6 / BseRI IGF2 / NciI AA AB BB AA AB BB PH1 5,98±0,25 5,75±0, ,61±0,10 5,54±0,05 PH24 5,84±0,04 5,83±0, ,81±0,04 5,83±0,02 REM (%) 20,26±1,63 22,68±1, ,38±1,94 21,93±0,83 SUS (%) 26,29±0,29 25,69±0, ,59±0,36 25,88±0,15 MYO (mg/100g) 81,55±6,26 77,51±4, ,24±7,30 78,86±3,49 IMT (%) 2,39±0,21 1,53±0, ,65±0,36 B 1,78±0,15 B Zjištěná průkaznost: P 0,05 (B) 5.8 Ukazatelé jatečné hodnoty a kvality masa podle pohlaví V následující tab. 27 jsou pro dokreslení uvedeny aritmetické průměry fenotypových hodnot u jednotlivých plemen mezi pohlavími. Tab. 27 Průměrné hodnoty jednotlivých plemen podle pohlaví sledovaný znak české bílé ušlechtilé česká landrase duroc prasničky vepříci prasničky vepříci prasničky vepříci HMTC (kg) 80,68 80,79 79,38 80,62 81,61 80,57 HMSC (kg) 78,38 78,79 77,46 78,59 79,61 78,56 TRUP (cm) 77,88 79,80 81,37 81,50 78,33 76,63 TPRUM (mm) 17,99 19,51 16,11 18,68 13,56 19,46 KRK (kg) 3,80 3,75 3,74 3,76 3,92 3,79 KOTL (kg) 4,79 4,62 4,82 4,74 4,77 4,45 PLEC (kg) 4,22 4,19 4,20 4,21 4,37 4,36 KYTA (kg) 8,54 8,29 8,49 8,23 8,96 8,55 HMCPR (%) 54,24 52,93 55,12 53,25 54,82 53,94 PH1 6,03 5,94 5,81 5,98 6,03 6,06 PH24 5,87 5,81 5,80 5,82 5,91 5,93 REM (%) 75,73 71,05 79,12 78, SUS (%) 24,01 25,41 22,05 24, MYO (mg/100g) 25,97 26,02 25,75 25, IMT (%) 1,52 1,76 1,56 1,74 - -

65 64 6 DISKUZE 6.1 Frekvence genotypů a alel MYOD1 K podobným výsledkům jako v této práci dospěli i Cieślak et al. (2000, 2002). Ve své práci měli původní označení alel jako C (A) a A (B) a v souboru prasat plemene LW zjistili relativní četnost alel A 0,54 a B 0,46 a relativní četnost genotypů AA 0,25, AB 0,58 a BB 0,17. Plemeno polská landrase měla nejvíce frekventovanou alelu A (0,80) a genotyp AA vykazoval četnost 0,63. Také Knoll et al. (1997) zjistili u plemen ČBU a ČL obdobné frekvence alel, a to A 0,41 a B 0,59, respektive A 0,64 a B 0,36. Testovali však 35 resp. 25 zvířat. Tothová (2003) se ve své dizertační práci zaměřila na analýzu souboru 740 prasat plemen bílé ušlechtilé, landrase, duroc, pietrain, yorkshire, slovenské bílé masné a české výrazně masné. V populaci prasnic pozorovala vysokou frekvenci alely A 0,73 a četnost genotypů AA 0,53, AB 0,39 a BB 0,08. U kanců byly genotypy AA 0,38, AB 0,47 a BB 0,14. Na základě výskytu daných četností zjistila pozitivní vliv alely A na hloubku zádového svalu a podíl hlavních masitých částí, zatímco alela B zase měla vliv na výšku hřbetního tuku, což bylo zjištěno také v této práci, kde se podobný vliv blížil významné průkaznosti, a naznačil tak možný dopad selekce mířené na výšku hřbetního tuku. MYOG Pozorované frekvence pro gen myogeninu jsou v souladu s výsledky většiny autorů, pouze Wyszynska-Koko et al. (2006) pozorovali u plemen Polský LW a polská landrase zcela opačný trend, a to převažující výskyt alely B (67,5 %) a tím i největší zastoupení genotypu BB. V této práci převažovali u českých plemen heterozygotní jedinci a téměř 70 % byla zastoupena alela A, což ukazuje na patrné rozdíly příbuzných plemen šlechtěných v rozdílných podmínkách geografického rázu. Soumillion et al. (1997) testovali MspI polymorfismus celkem u 7 plemen (meishan, pietrain, duroc, hampshire, great yorkshire, holandská landrase a divoké prase) a zjistili nulový výskyt alely A u plemene meishan. Te Pas et al. (1999a) zase sledovali frekvence u myogeninu u yorkshirských prasat, a to AA 0,34, AB 0,43 a BB 0,23. Tyto četnosti se téměř shodují s četnostmi zjištěnými v této práci u plemene ČBU. Na rozdíl od Putnové et al.

66 65 (2001), kteří pozorovali u plemene ČBU frekvence 0,53 AA, 0,44 AB a 0,03 BB. Cieślak et al. (2002) zjistili u plemene polská landrase frekvence genotypů AA 0,08, AB 0,58 a BB 0,33. Tyto jsou však v rozporu s četnostmi zjištěnými u plemene ČL. Podobně opačné frekvence popsali ve své studii Anton et al. (2002). Ti sledovali MspI polymorfismus u plemen maďarský LW a maďarská landrase, u nichž zjistili četnosti AA 0,03, AB 0,42 a BB 0,55, respektive AA 0,06, AB 0,36 a BB 0,58. V tomto genu zjišťovali variabilitu také Klosowska et al. (2004) a ti nezjistili žádné jedince v homozygotním genotypu AA, přičemž alela B převažovala ze 77 %. Nicméně dospěli ke shodným výsledkům v tom směru, že všeobecně u evropských komerčních plemen prasat (LW, landrace, pietrain, duroc, hampshire) se nejméně vyskytuje genotyp BB. Jediným evropským plemenem, které v genu MYOG vykazuje nejvyšší četnost homozygotů BB (77,5 %), je great yorkshire (Soumillion et al., 1997). Horák et al. (2004) popisují gen myogeninu u genetické rezervy prasat plemene přeštické černostrakaté. U souboru 102 prasnic detekovali 71 % výskyt alely B a četnost genotypů AA 0,08, AB 0,42 a BB 0,50, což vyjadřuje opačné zastoupení než u plemene ČBU a což také to může vypovídat o konzervativně ustálené četnosti a nízkém stupni variability u geneticky rezervovaných plemen. K podobným zjištěním jako v této práci dospěli také Humpolíček et al. (2005), kteří zkoumali soubor 86 prasnic plemene ČBU a pozorovali převažující výskyt alely A (58 %). Z genotypů měli potom největší zastoupení jedinci homozygotní AA a naopak nejméně jedinců, stejně jako zde, bylo v genotypu BB. MYF5 U plemen ČL a duroc byl tento gen zjištěn jako monomorfní, a to pro alelu B. Její výskyt u duroc byl dokonce stoprocentní. Na genotypové úrovni se tak monomorfismus projevil nulovým výskytem genotypu AA. Stejné zjištění popisují i Stratil a Čepica (1999), kteří analyzovali gen MYF5 u několika komerčních plemen a plemene meishan. U všech s výjimkou plemene meishan zjistili monomorfismus pro alelu B. Ale například Te Pas et al. (1999b) testovali v tomto genu HinfI polymorfismus u komerčních plemen a naopak zjistili monomorfní výskyt u plemene meishan a divoké prase. Gen MYF5 je v tomto směru velice rozmanitý, a proto by bylo vhodné další studie, jak na polymorfní, tak i monomorfní úrovni.

67 66 MYF6 U všech zkoumaných plemen byl zjištěn převažující výskyt alely A. V genotypovém zastoupení však měli velkou převahu především heterozygotní jedinci, a to s průměrným výskytem 72,3 %. Zajímavé je, že například Vykoukalová et al. (2003) ve své studii pozorovali u plemen LW a landrase téměř 80 % výskyt alely B a u plemene duroc naopak větší výskyt alely A. Ernst et al. (1994) v jedné z prvních studií genu MYF6 hledali polymorfismus u komerčních a čínských prasat a detekovali alely 6,3 a 4,9 kb, jejichž frekvence byly 0,92 respektive 0,08. Monomorfismus (v alele 6,3) pozorovali u komerčních plemen. Wyszynska-Koko et al. (2006) označili alely pro polymorfismus v oblasti promotoru jako T a C a stejně jako zde pozorovali u plemen polský LW a polská landrase největší výskyt heterozygotních jedinců. V tomto ohledu se všechny studie MYF6 do značné míry shodují, pokud se tedy jedná hlavně o komerční plemena. IGF2 S 80 % převahou byl zjištěn výskyt alely B, což se promítlo také do téměř 70 % převahy genotypové četnosti BB. Relativní četnost tohoto genotypu se jeví být vůbec nejvyšší u všech komerčních plemen. Knoll et al. (1999) pozorovali podobnou distribuci alel u stejných plemen, navíc u plemene pietrain nezjistili žádnou alelu A, zatímco Kolaříková et al. (2003) pozorovali u souboru 121 zvířat plemene ČBU nízkou frekvenci alely A (0,18) a frekvence genotypů AA 0,02, AB 0,34 a BB 0,64. Horák et al. (2001) testovali na polymorfismus genu IGF2 celkem 90 prasnic plemene přeštické černostrakaté a zjistili frekvence alel A 0,33 a B 0,67. Zde je vidět, jak jsou rozdíly mezi genotypovými frekvencemi způsobeny meziplemennými odchylkami, nicméně přesto jsou v populacích komerčních i ostatních plemen udržovány vyšší relativní četnosti genotypu BB. GDF8 S drtivou převahou se v souboru sledovaných komerčních plemen vyskytovala alela T. Z toho u dvou plemen (ČL, duroc) nebyl zaznamenán žádný výskyt genotypu AA, a je tedy pravděpodobné, že u většího souboru zvířat by mohl být výskyt alely T monomorfní vzhledem k tomu, že zde byl průměrný výskyt alely A 0,04. To potvrdili například Cieślak

68 67 et al. (2003), kteří hledali polymorfismus v oblasti promotoru, exonu 2 s přilehlými oblastmi a exonu 3 s přilehlými oblastmi. Ti zjistili monomorfismus alely T u plemen LW, polská landrase, pietrain a zlotnicka. U kříženců LW x pietrain detekovali alelu T s četností stejnou, jaká byla zjištěna i v této práci. Výskyt genotypu TT byl skoro 99 %, heterozygotní jedinci se vyskytli v 1 % a homozygoti AA nebyli zjištěni žádní. S podobným zjištěním přišli také Jiang et al. (2002), kteří v souboru 560 prasat komerčních plemen pozorovali dominantní postavení alely T, a Yang et al. (2002), kteří studovali mutaci v oblasti promotoru u 163 prasat plemen landrace, duroc, yorkshire a čínských prasat. Komerční plemena vykazovala 92 % podíl homozygotů TT a 4 % četnost výskytu alely A. Čínská plemena byla charakteristická svým monomorfismem. Dospěli tak k názoru, že uvedená zjištění ukazují na skutečnost, že by sledovaná mutace mohla být ve vztahu k expresi genu myostatinu. 6.2 Asociační analýza MYOD1 Co se týká genu MYOD1, nebyly u plemene ČBU odhaleny žádné významné statistické průkaznosti pro znaky jatečné hodnoty. U výšky hřbetního tuku se vztah mezi genotypy AB a BB blížil průkaznosti (P 0,01). Genotyp BB vykazoval celkově nejvyšší hodnoty pro znaky tučnosti, kdy průměrná výška hřbetního tuku byla o téměř 1 milimetr nad ostatními genotypy a také % obsah IMT byl největší. Na druhou stranu genotyp AA ovlivňoval nejvíce zmasilost a podíl HMČ, a to jak u ČBU, tak i u ČL, kde byly zjištěny vysoce průkazné rozdíly. Ke stejným výsledkům jako v této práci dospěli také Cieślak et al. (2002), když našli vysoce průkazný rozdíl u hmotnosti kýty a navíc také u hmotnosti kotlety a podílu hlavních masitých částí. Ale třeba Kuryl et al. (2002) pozorovali u genotypu AB nižší hmotnost kýty, než byla pozorována v této práci a také celkově menší podíl hlavních masitých částí a také menší plochu nejdelšího zádového svalu. Co se týká plemene landrace, jsou tato zjištění vesměs v kontrastu s výsledky v této práci, což je zřejmě dáno geografickým rázem tohoto plemene. Vlivem MYOD1 na strukturu a průměr svalových vláken se zabývali Klosowska et al. (2004), kteří zkoumali celkem 115 prasat kříženců plemen polský LW, polská landrase a pietrain. Nezjistili žádný významný vliv na průměr svalového vlákna ani na počet vláken na jednotku plochy.

69 68 Nové světlo do možných vlivů tohoto genu na znaky masné užitkovosti mohou přinést výsledky, ke kterým dospěli Urbanski a Kuryl (2004). Ti našli první jednonukleotidové polymorfismy uvnitř exonu 1, tedy v kódující oblasti, což může vést ke změně pořadí aminokyselin. Žádné asociace s tímto polymorfismem dosud nebyly sledovány. Ovšem nelze s určitostí předpokládat, že variabilita v kódující oblasti tohoto genu bude nějak významně korelovat se sledovanými znaky a vlastnostmi. Přesto je objev tohoto polymorfismu do budoucna slibným příspěvkem pro studium dalších možných asociací a významných efektů genu MYOD1 ve vztahu ke znakům jatečné hodnoty nebo kvality masa. Když se srovnají výsledky studií zabývající se vlivem MYOD1 na znaky masné užitkovosti u různých plemen nebo linií, lze z nich vyvodit závěry, že významné statistické průkaznosti mohou být dosti variabilní právě v závislosti na konkrétním plemeni či linii. MYOG V rámci jatečné hodnoty jsou v této studii patrné meziplemenné rozdíly u výšky hřbetního tuku nebo délky jatečného těla, u kterých byl nalezen vysoce průkazný rozdíl (ČL, resp. ČBU). Zajímavé, že toto zjištění je v kontrastu s jinými podobnými studiemi. Tak například v první asociační studii tohoto genu sledovali Ernst a Davies (1995) u souboru 83 prasat 9 plemen asociace s hmotností při narození, průměrným denním přírůstkem, délkou jatečného těla, výškou hřbetního tuku a plochou nejdelšího zádového svalu a nepozorovali žádné statisticky významné rozdíly mezi genotypy. Te Pas et al. (1996, 1999a) genotypovali soubor zahrnující celkem 267 prasat různých plemen (mj. meishan, duroc, holandská landrase, divoké prase) a hledali asociace MspI polymorfismu s hmotností při narození, průměrným denním přírůstkem a výškou hřbetního tuku. Našli statisticky významný rozdíl (P < 0,05) mezi AA a AB pro hmotnost při narození a popsali průkazné vztahy s hmotností prasat při narození, jatečnou hmotností, intenzitou růstu a obsahem libového masa ve velké populaci prasat plemen yorkshire. Žádné asociace nenašli u výšky hřbetního tuku. Podle jejich výsledků se geneticky vliv MYOD rodiny na produkci kvalitního vepřového masa projevuje už během procesu diferenciace svalových vláken. Toto zjištění by bylo dále vhodné porovnat například se studiemi zaměřenými na hodnocení intenzity růstu nebo podle hladiny exprese myogeninu ve svalové tkáni. Cieślak et al. (2000) testovali celkem 229 zvířat různých plemen (mj. polská landrase, polský LW, pietrain). Pozorovali asociace u hmotnosti kýty, kotlety, půlky

70 69 jatečného těla, plochy zádového svalu a podílu hlavních masitých částí a u všech těchto ukazatelů zjistili statisticky významné rozdíly. Zejména u plemene LW to byl vliv genotypu AA na větší hmotnost jatečné půlky, kotlety, kýty, plochy nejdelšího zádového svalu a vyšší podíl hlavních masitých částí. Co se týká výsledků v této práci, shodují se pouze s vlivem genotypu AA na větší hmotnost kotlety. Největší hmotnost kýty byla u zvířat s genotypem AB (AC, podle Cieślak et al., 2000), u kotlety AA (CC) a u HMČ AA (CC). Popsali také signifikantní účinek genotypu AB, zvyšující obsah libového masa v kotletě a snižující výšku hřbetního tuku (Cieślak et al., 2002). Anton et al. (2006) zkoumali u plemene maďarský LW vliv na hmotnost při narození, hmotnost jatečného těla, hmotnost libového masa, procentuální podíl libového masa a výšku hřbetního tuku, ale žádný průkazný rozdíl nezjistili. Statistickou významnost pozorovali mezi všemi genotypy a růstem, kdy homozygotní jedinci BB vykazovali nejvyšší intenzitu růstu v době výkrmu. Wyszynska-Koko et al. (2006) zkoumali soubor 660 zvířat plemen polský LW, polská landrase a komerční linie L990. U plemene polská landrase zjistili statistickou významnost u hmotnosti kotlety a plochy nejdelšího zádového svalu. U ostatních plemen neodhalily žádné statisticky významné rozdíly. Co se týká odlišností u jednoho typu plemene, mohou být všechny tyto rozdíly opět zapříčiněny zejména jiným geografickým rázem daného plemene, z čehož samozřejmě vyplývají také jiné selekční a šlechtitelské podmínky, jakož i rámcovitost hybridizačních programů. V našich podmínkách se vlivem myogeninu zabývali Horák et al. (2004) a Humpolíček et al. (2005), kteří své studie zaměřili naopak na některé reprodukční vlastnosti prasnic. Zjistili tak např. vliv na počet narozených selat ve vrhu a na počet odstavených selat. MYF5 Zde byla spočítána asociační analýza pro ČBU i přesto, že genotyp AA nebyl zjištěn. I tak byl ale pozorován průkazný vliv mezi genotypy a výškou hřbetního tuku a zdánlivá průkaznost u podílu HMČ. U plemene ČL byl gen MYF5 monomorfní a nebyl tak zařazen do asociační analýzy. Te Pas et al. (1999b) nezjistili žádné asociace tohoto genu se znaky masné užitkovosti, ale naznačili možnost využívat ho jako marker ke studiu asociací MYF6 se znaky masné produkce nebo s embryonálním vývinem svaloviny. Cieślak et al. (2002) testovali dva polymorfismy genu MYF5 a pozorovali vztah mezi genotypy a zmasilostí a tučností u kýty a plochy nejdelšího zádového svalu. U stejného polymorfismu zjistili Kuryl

71 70 et al. (2002) průkazné rozdíly mezi genotypy AA a AB u hmotnosti kýty a plochy nejdelšího zádového svalu. Jinými znaky kvality masa se zabývali Carmo et al. (2005). Ti analyzovali soubor 356 zvířat kříženců plemen landrase x LW a landrase x LW x pietrain, u kterých identifikovali normální (N) a inzerční (I) alelu a u znaků jatečné hodnoty nenalezli žádné statistické průkaznosti. Statisticky významné rozdíly zjistili u znaků kvality masa, a to mezi genotypy NN a NI pro odkap vody z masa a celkovou ztrátu. U tohoto genu mnoho studií zaměřených na asociační analýzu dosud není a dosavadní statistické analýzy zatím neodhalily žádné asociace s hmotností při narození, intenzitou růstu, hmotností jatečného těla ani výškou hřbetního tuku. Lze tak těžko porovnávat potenciální průkaznosti. MYF6 Zde nebyly zjištěny žádné významné asociace se sledovanými znaky. Pouze u znaků tučnosti, konkrétně výšky hřbetního tuku T2, byl u ČBU nalezen zdánlivě průkazný rozdíl a navíc nejvyšší hodnoty vykazoval genotyp BB, který ale výrazně snižoval obsah myoglobinu. Také Ernst a Davis (1995) a Te Pas et al. (1999b) nezjistili žádné významné asociace genotypů MYF6 s užitkovými vlastnostmi. Te Pas et al. (1999b) dospěli k názoru, že tento gen u prasat nevysvětluje žádnou genetickou variabilitu ve znacích masné užitkovosti. S tím se dá v tomto případě souhlasit, neboť se zdá, že stejně jako výsledky v této práci, tak i ostatní asociační studie nepotvrzují vztah tohoto genu k užitkovým vlastnostem prasat. Wyszynska-Koko et al. (2006) studovali asociace u plemen polský LW, polská landrase a komerční linie L990. Mutace v oblasti promotoru byla asociovaná s průměrným denním přírůstkem (polský LW). U polské landrase a linie L990 nebyl žádný efekt pozorován. IGF2 Gen IGF2 ovlivňoval především znaky tučnosti. U ČBU a ČL byly prokázány signifikantní rozdíly u výšek hřbetního tuku, přičemž nejvyšší hodnoty byly sledovány v genotypu AA. Navíc u ČL byla pozorována signifikance pro obsah IMT. Ostatní znaky nejevily žádné statistické významnosti mezi genotypy. Že je patrný vliv tohoto genu na

72 71 znaky tučnosti, vyplývá nejen z této práce, ale také z dalších studií zabývajících se vlivem IGF2 ať už na obsah libového masa, nebo intenzitu růstu. V takové podobné studii Kolaříková et al. (2003) nalezli u plemene ČBU významnou asociaci mezi genotypy AB a BB a živou hmotností. Dále zjistili významné rozdíly mezi pohlavími ve výšce hřbetního tuku, v procentu libového masa, průměrném denním přírůstku, tělesné hmotnosti během testu, na konci testu a před porážkou. Vliv otců byl významný u tělesné hmotnosti, výšky hřbetního tuku a procentu libového masa. Na druhou stranu třeba Estany et al. (2002) zkoumali u dvou linií plemene landrace polymorfismus na úrovni mikrosatelitů a detekovali alely, u kterých pozorovali asociace s konverzí krmiva. To může být nesporně dalším příspěvkem potvrzujícím vliv na tučnost, neboť ta je spojována kromě jiného také právě s kvalitou a složením krmné dávky. Co se týká kauzální mutace v intronu 3, Estellé et al. (2005) dospěli k závěru, že substituce G3072A je u plemen LW a landrace asociována se silným efektem na některé ekonomicky významné znaky jako např. hmotnost kýty nebo tučnost. Potvrdili tak pozorované efekty této mutace, ke kterým dospěli ve své práci Van Laere et al. (2003), a to že alela A snižuje množství tuku a naopak zvyšuje plochu nejdelšího zádového svalu, hmotnost plece, kýty a jatečného těla. Nezer et al. (1999) popsali diference mezi genotypy u F 2 generace hybridních potomků kříženců LW x pietrain. Tyto rozdíly nebyly statisticky významné, ale u jedinců s genotypem BB byl pozorován vyšší podíl libového masa a nižší výška hřbetního tuku. K podobným výsledků dospěli také Jeon et al. (1999), kteří u LW a divokého prasete popsali asociace genotypů IGF2 s obsahem libového masa. GDF8 Asociace s obsahem libového masa byla pozorována u plemene ČBU. Zdánlivá průkaznost mezi genotypy byla pozorována u hmotnosti kotlety, zatímco průkazný rozdíl byl nalezen mezi genotypy u podílu hlavních masitých částí. Plemeno ČL nevykazovalo žádnou významnost spojenou se znaky kvality masa nebo jatečné hodnoty. U výšek hřbetního tuku však byly zjištěny největší rozdíly mezi genotypy, a to u všech sledovaných genů. Jiang et al. (2002) se zase zaměřili na sledování reprodukčních znaků a zjišťovali výskyt polymorfismu u prasat plemen landrace, duroc, hampshire, pietrain a yorkshire. U yorkshirských prasat pozorovali asociace s hmotností při narození, kdy u genotypu TA našli vysokou průkaznost a popsali pozitivní vliv alely A na hmotnost při narození.

73 72 Nejvyšší hodnoty vykazovali vesměs heterozygotní jedinci také pro průměrný denní přírůstek měřený od 60 do 100 kg. Podobně se vlivem tohoto polymorfismu na reprodukční vlastnosti zabývali také Ji et al. (1998) a ti zjistili zajímavý fakt, že selata s nižší hmotností při narození vykazovala nižší expresi myostatinu než selata, která měla podstatně větší porodní hmotnost. Cieślak et al. (2003) se v tomto genu zabývali celkem 3 mutacemi, neshledali však žádné vztahy asociované s obsahem libového masa. Zjistili však, stejně jako Stratil a Kopečný (1999), velmi nízkou četnost těchto mutací. Skutečnost, že výskyt mutací je u prasat obecně malý, ukazuje na větší stabilitu u tohoto druhu než u skotu. 6.3 Alelická diskriminace Na základě PCR v reálném čase byla optimalizována metoda pro testaci intronu 3 genu IGF2. Byly detekovány všechny tři genotypy (AA, AG, GG). Alelickou diskriminací pro gen IGF2 se ve své práci zabývali Carrodeguas et al. (2005), kteří testovali 32 kříženců plemen LW a pietrain, 30 kříženců plemen iberian a duroc a 13 kříženců plemen iberian a divoké prase. Došli k závěru, že četnost mutace je mezi komerčními plemeny a kříženci značně rozdílná, přičemž u komerčních plemen nebyl detekován žádný genotyp GG, a alela A tak měla největší relativní četnost (80 %). K podobnému závěru došli i Van Laere et al. (2003). U kříženců byly potom detekovány ve většině případů heterozygotní jedinci. Tato metoda představuje jednoduchý, efektivní a hlavně finančně a časově nenáročný přístup v detekci mutací. Oproti klasickým metodám, jako jsou PCR či RFLP, šetří finance a hlavně dobu strávenou jednak přípravou vzorků a jednak samotným procesem kvantifikace (amplifikace), který je o téměř dvě třetiny rychlejší. Metoda bude do budoucna využitelná studenty pro další aplikace v laboratoři Ústavu morfologie, fyziologie a genetiky zvířat a může být vhodným tématem příštích bakalářských i diplomových prací.

74 73 7 ZÁVĚR Byl naplněn hlavní cíl této dizertační práce, a to poskytnout všeobecný přehled o základních genech s předpokládaným vztahem ke znakům masné užitkovosti prasat. Analýza souboru prasat ze stanice kontroly výkrmnosti a jatečné hodnoty byla provedena za účelem zjištění polymorfních variant a frekvencí genotypů a alel v genech MYOD rodiny, IGF2 a GDF8 a nalezení možných účinků těchto genů na vybrané znaky jatečné hodnoty a kvality masa. Výsledky zde prezentované ukazují na rozličnou variabilitu v genech u jednotlivých plemen a také na signifikantní rozdíly mezi polymorfními variantami genů a vybranými znaky masné užitkovosti. Co se týká detekce polymorfismu/monomorfismu a vyhodnocení možných asociací, byl u některých genů problém především v nedostatečném počtu otestovaných zvířat. Malý počet vzorků vedl v konečné fázi k velkým standardním chybám, které mohou omezit detekci signifikantních rozdílů a z tohoto důvodu nebyly varianty genů zahrnuty do asociační analýzy. I když nebyl u genů MYF5 a GDF8 detekován genotyp AA, výsledky naznačily, že právě alela A může mít určitý vliv na sledované znaky. Z důvodu těchto zjištění by bylo vhodné nadále pokračovat v dané studii za účelem nalezení vlivu této alely na znaky jatečné hodnoty u prasat. Navíc, co se týká statistických analýz u genů MYF6 a GDF8, stále ještě není do dnešní doby tolik prací na toto téma a další studie jsou v očekávání. Zjištění průkazných rozdílů ve sledovaných genech a vztahy mezi polymorfními variantami by bylo dobré ověřit také u dalších komerčních (a nejen těch) plemen prasat. Zvláště potom u masných typů by bylo zajímavé sledovat a vyhodnocovat projevy genů ovlivňujících formaci svalových vláken a tím i tvorbu kvalitního libového masa. Popsané metody analýzy DNA a identifikace mutací v jednotlivých genech jsou vesměs jednoduchými, rutinními, přesnými a vysoce reprodukovatelnými přístupy v laboratorní praxi na molekulárně-genetické úrovni, a mohou tak být měřítkem pro efektivně využitelnou aplikaci markerů v šlechtění hospodářských zvířat. Stejně tak mohou být prospěšné i zjištěné asociace, jež byly už dříve popsány u genů MYOD rodiny, a které mohou zdůraznit důležitost markery asistované selekce do budoucna. Na základě těchto zjištění mohou být navrhnuty nové strategie a postupy v mnoha směrech šlechtitelských programů cílených na zlepšení masné produkce u prasat.

75 74 8 SHRNUTÍ Tato dizertační práce si kladla za cíl ověřit variabilitu genů tzv. MYOD rodiny, kam patří myogenní faktory MYOD1, MYOG, MYF5 a MYF6 a dále genů IGF2 a GDF8. Tyto geny jsou považovány za kandidátní geny pro masnou užitkovost prasat v důsledku jejich klíčového významu v regulaci tvorby svaloviny a intenzity růstu. U souboru prasat plemen ČBU (218 ks), ČL (70 ks) a duroc (17 ks), pocházejících ze stanice kontroly výkrmnosti a jatečné hodnoty bylo cílem určit polymorfní varianty v těchto genech a vyhodnotit jejich potenciální vliv na znaky jatečné hodnoty a kvality masa. U genu IGF2 bylo nadstandardním cílem popsat metodiku detekce kauzální mutace v intronu 3, založenou na PCR v reálném čase. Porcinní DNA ze vzorků krve byla naamplifikována a naštěpena pomocí metody PCR-RFLP. K namnožení DNA byly použity primery popsané již v dřívějších pracích. Kvalita získaných PCR produktů byla ověřena na agarózovém gelu. Štěpení produktů bylo provedeno pomocí restrikčních endonukleas DdeI, MspI, HpaII a BseRI. Restrikční místa se nacházejí v intronu 1 (MYOD1, MYF6), v oblasti 3 konce (MYOG), v exonu 2 (MYF5), v intronu 7 (IGF2) a v oblasti promotoru (GDF8). U sledovaných genů s výjimkou MYF5 a GDF8 byly detekovány všechny tři genotypy, u MYF5 byl potvrzen monomorfismus. Byla optimalizována metodika alelické diskriminace a na základě navržených primerů byly detekovány (diskriminovány) genotypy AA, AG a GG, charakterizující kauzální mutaci v intronu 3 genu IGF2. Byly sledovány asociace mezi polymorfními variantami genů a těmito znaky masné užitkovosti: hmotností jatečného těla za tepla, hmotností jatečného těla za studena, délkou trupu, výškou hřbetního tuku, hmotností krkovice, hmotností kotlety, hmotností plece, hmotností kýty, podílem hlavních masitých částí, ph 45 minut po porážce, ph 24 hodin po porážce, remisí masa, sušinou masa, obsahem myoglobinu a obsahem intramuskulárního tuku. Následné statistické vyhodnocení bylo provedeno pomocí smíšeného lineárního modelu (REML) s uplatněním pevných efektů genotypu, pohlaví, plemene a roku/měsíce porážky, náhodného efektu otce a lineární regrese na živou hmotnost. U plemene ČBU byly zjištěny vysoce průkazné rozdíly (P 0,01) mezi genotypy AA-BB genu MYOG pro délku jatečného těla a mezi genotypy AA-AB genu IGF2 pro výšku hřbetního tuku měřenou ke středu druhého hrudního obratle. Průkazné rozdíly (P 0,05) byly zjištěny mezi genotypy AA-AB genu MYOG pro délku jatečného těla, dále mezi genotypy AB-BB genu

76 75 MYF5 pro výšku hřbetního tuku měřenou ke středu prvního křížového obratle, mezi genotypy AA-BB genu IGF2 pro výšku hřbetního tuku měřenou ke středu posledního hrudního obratle a mezi genotypy TT-TA genu GDF8 pro podíl hlavních masitých částí. U plemene ČL byly zjištěny vysoce průkazné rozdíly mezi genotypy AA-AB genu MYOD1 pro hmotnost jatečného těla za tepla i za studena a pro hmotnost kýty a dále mezi genotypy AA-AB genu MYOG pro výšku hřbetního tuku. Průkazné rozdíly byly zjištěny mezi genotypy AA-AB genu IGF2 pro výšku hřbetního tuku měřenou ke středu prvního křížového obratle a intramuskulárním tukem. 9 SUMMARY This PhD. thesis was aimed at examination and verification of variability of MYOD genes family, IGF2 and GDF8 genes. These genes are considered to be candidate in consequence of their key roles in growth and muscle development regulation. A total of 305 pigs, sibs and half-sibs, from Czech Large White (218 animals), Czech Landrace (70 animals) and duroc (17 animals) breeds were included into the analysis. All the pigs were originated from fattening control station. The analysis was carried out in order to find polymorphic variants of studied genes and to evaluate possible relationship between these polymorphisms and selected traits of meat performance. The extra aim was to optimize and establish a new method for detection of causal mutation in intron 3 of IGF2 gene based on Real-Time PCR. DNA from porcine blood samples was amplified and digested using PCR-RFLP method. To amplify DNA, the primers described earlier were used. The PCR products obtained were controlled on agarose gel. Overnight digestion of each product was performed with DdeI, MspI, HpaII and BseRI restriction enzymes on % agarose gel. Restriction sites are located within intron 1 (MYOD1, MYF6), at the 3 end (MYOG), within exon 2 (MYF5), within intron 7 (IGF2) and within promoter region (GDF8). In the studied genes except for MYF5 and GDF8, all the three genotypes were detected; a monomorphic variant in MYF5 was confirmed. By means of allelic discrimination, genotypes AA, AG and GG characterizing a causal mutation in intron 3 were detected. The associations of studied polymorphisms with hot carcass weight, cold carcass weight, carcass length, backfat thickness, neck weight, loin weight, shoulder weight, ham weight, lean meat content, ph 45 minutes after slaughtering, ph 24 hours after

77 76 slaughtering, remission of meat, dry matter of meat, myoglobin content and intramuscular fat content were estimated using a mixed linear model (REML). The genotypes of relevant gene, gender, breed and year/month of the slaughter were used as fixed effects. The effect of the sire of pigs was included in model as a random effect and live weight as a linear regression. In Czech Large White breed were found out highly significant differences (P 0.01) between MYOG AA-BB genotypes for carcass length and between IGF2 AA-AB genotypes for backfat thickness measured to the middle of second thoracic vertebra. Significant differences (P 0.05) were found out between MYOG AA-AB genotypes for carcass length, between MYF5 AB-BB genotypes for backfat thickness measured to the middle of first sacral vertebra, between IGF2 AA-BB genotypes for backfat thickness measured to the middle of last thoracic vertebra and between GDF8 TT-TA genotypes for lean meat content. In Czech Landrace breed were found out highly significant differences between MYOD1 AA-AB genotypes for hot and cold carcass weight and for ham weight and between MYOG AA-AB genotypes for backfat thickness. Significant differences were found out between IGF2 AA-AB genotypes for backfat thickness measured to the middle of first sacral vertebra and intramuscular fat.

78 77 10 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ArkDb genomová databáze hospodářských a jiných zvířat bhlh basic helix-loop-helix; strukturní motiv proteinu bp basis pairs; páry bází BseRI Bacillus species R; restrikční endonukleasa ČBU české bílé ušlechtilé ČL česká landrase DdeI Desulfovibrio desulfuricans; restrikční endonukleasa DMSO dimethylsulfoxid DNA deoxyribonucleic acid; deoxyribonukleová kyselina cdna complementary DNA; komplementární DNA vzniklá zpětným přepisem z mrna dsdna double strand DNA; dvouřetězcová DNA dntp 2 -deoxynukleosid-5 -trifosfát; nukleotidy DraI Deinococcus radiophilus; restrikční endonukleasa EDTA ethylendiaminetetraacetate; ethylendiamintetraoctová kyselina, chelaton 3 EMBL European Molecular Biology Laboratory EtBr ethidium bromid; fenantridinium, 3,8-diamino-5-etyl-6-fenyl-bromid ETL economic trait loci; lokusy ekonomicky významných znaků FRET fluorescent resonance energy transfer; sondy s přenosem energie pomocí fluorescenční rezonance GDF8 growth differentiation factor 8 (myostatin) HMCPR procento hlavních masitých částí HMTC hmotnost JOT za tepla celkem HMSC hmotnost JOT za studena celkem HpaII Haemophilus parainfluenzae; restrikční endonukleasa IGF2 insulin-like growth factor 2; inzulínu podobný růstový faktor 2 IMT intramuskulární tuk JOT jatečně opracované tělo KOTL krkovička KYTA kýta s kostí KRK kotleta

79 78 LSM least square means; průměr nejmenšího čtverce LW Large White MspI Moraxella species; restrikční endonukleasa MYF5 myogenic factor 5 MYF6 myogenic factor 6 (herculin) MYO myoglobin MYOD1 myogenic differentiation 1; myoblasty determinující protein 1 MYOG myogenin; myogenic factor 4 NciI Neisseria cinerea; restrikční endonukleasa PCR polymerase chain reaction; polymerázová řetězová reakce PLEC plec s kostí bez kolínka PH 1 ph 45 minut po poražení PH 24 QTL REM ph 1 hodinu po poražení quantitative trait loci; lokusy kvantitativních znaků remise RFLP restriction fragment length polymorphism; polymorfismus délky restrikčních fragmentů RNA ribonucleic acid; ribonukleová kyselina mrna messenger RNA; mediátorová RNA SNP single nucleotide polymorphisms; jednonukleotidové polymorfismy SSC Sus scrofa; prasečí chromozom STR short tandem repeats; mikrosatelity SUS sušina Taq Thermus aquaticus; baktérie poskytující enzym DNA polymerázu TAE trisacetát EDTA; ph pufr TBE trisborát EDTA; ph pufr TE trisedta; ph pufr TPRUM průměrná výška hřbetního tuku TRUP délka trupu JOT UNG uracil N-glykosyláza VNTR variable number tandem repeats; minisatelity

80 79 11 SEZNAM LITERATURY Allan G. J., Flint D. J., Patel K. (2001): Insulin-like growth factor axis during embryonic development, Reproduction, 122, Andersson L., Haley C. S., Ellegren H., Knott S. A., Johansson M., Andersson K., Andersson-Eklund L., Edfors-Lilja I., Fredholm M., Hansson I., Hakansson J., Lundström K. (1994): Genetic mapping of quantitative trait loci for growth and fatness in pigs, Science, 263, Andersson-Eklund L., Marklund L., Lundström K., Haley C. S., Andersson K., Hansson I., Moller M., Andersson L. (1998): Mapping quantitative trait loci for carcass and meat quality traits in a wild boar x large white intercross, Journal of Animal Science, 76, Anton I., Fésüs L., Zsolnai A. (2002): Simultaneous identification of two MspI polymorphisms of the porcine myogenin gene in Hungarian breeds, Journal of Animal Breeding and Genetics, 119, Anton I., Zsolnai A., Komlosi I., Kiraly A., Fésüs L. (2006): Effect of MYOG genotypes on growth rate and production traits in Hungarian Large White pigs, Acta Veterinaria Hungarica, 54, Archibald A. L., Haley C. S., Brown J. F., Couperwhite S., McQueen H. A., Nicholsnon D., Coppieters W., Vandeweghe A., Stratil A., Wintero A. K. et al. (1995): The PiGMaP consortium linkage map of the pig (Sus scrofa), Mammalian genome, 6, Berg F. (2006): Genetic analysis of fat metabolism in domestic pigs and their wild ancestor, Acta Universitatis Upsaliensis, Digital Comprehensive Summaries of Uppsala Dissertations, 164, ISBN , 40 pp. Bidanel J. P., Milan D., Iannuccelli N., Amigues Y., Boscher M. Y., Bourgeois F., Caritez J. C., Gruand J., Le Roy P., Lagant H., Quintanilla R., Renard C., Gellin J., Ollivier L., Chevalet C. (2001): Detection of quantitative trait loci for growth and fatness in pigs, Genetics Selection Evolution, 33,

81 80 Braun T., Buschhausen-Denker G., Bober E., Tannich E., Arnold H. H. (1989): A novel human muscle factor related to but distinct from MYOD1 induces myogenic conversion in 10T1/2 fibroblasts, EMBO Journal, 8, Braun T., Bober E., Winter B., Rosenthal N., Arnold H. H. (1990): MYF6, a new member of the human gene family of myogenic determination factors - evidence for a gene cluster on chromosome 12, EMBO Journal, 9, Carmo F. M. S., Guimarães S. E. F., Lopes P. S., Pires A. V., Guimarães M. F. M., da Silva M. V. G. B., Schierholt A. S., e Silva K. M., Gomide L. A. M. (2005): Association of MYF5 gene allelic variants with production traits in pigs, Genetics and Molecular biology, 28, Carrodeguas J. A., Burgos C., Moreno C., Sánchez A. C., Ventanas S., Tarrafeta L., Barcelona J. A., López M. O., Oria R., López-Buesa P. (2005): Incidence in diverse pig populations of an IGF2 mutation with potential influence on meat quality and quantity: An assay based on real time PCR (RT-PCR), Meat Science, 71, Cassady J. P., Johnson R. K., Pomp D., Rohrer G. A., Van Vleck L. D., Spiegel E. K., Gilson K. M. (2001): Identification of quantitative trait loci affecting reproduction in pigs, Journal of Animal Science, 79, Cieślak D., Kapelanski W., Blicharski T., Pierzchała M. (2000): Restriction fragment length polymorphism in myogenin and MYF-3 genes and their influence on lean meat content in pigs, Journal of Animal Breeding and Genetics, 117, Cieślak D., Kuryl J., Kapelanski W., Pierzchala M., Grajewska S., Bocian M. (2002): A relationship between genotypes at MYOG, MYF3 and MYF5 loci and carcass meat and fat deposition traits in pigs, Animal Science Papers and Reports, 20, Cieślak D., Blicharski T., Kapelanski W., Pierzchala M. (2003): Investigation of polymorphisms in the porcine myostatin (GDF8; MSTN) gene, Czech Journal of Animal Science, 48, Čepica S., Yerle M., Stratil A., Schroffel J., Redl B. (1999): Regional localization of porcine MYOD1, MYF5, LEP, UCP3 and LCN1 genes, Animal Genetics, 30, Čepica S., Schroffel J., Stratil A., Hojný J., Pierzchala M., Kuryl J., Brunsch C., Sternstein I., Davoli R., Fontanesi L., Reiner G., Bartenscelager H., Moser G., Geldermann H.

82 81 (2003): Linkage and QTL mapping for Sus scrofa chromosome 9, Journal of Animal Breeding and Genetics, 120, Davis R. L., Weintraub H., Lassar A. B. (1987): Expression of a single transfected cdna converts fibroblasts to myoblasts, Cell, 51, De Chiara T. M., Robertson E. J., Efstratiadis A. (1991): Parental imprinting of the mouse insulin-like growth factor II gene, Cell, 64, De Koning D. J., Janss L. L. G., Rattink A. P., van Oers P. A. M., de Vries B. J., Groenen M. A. M., van der Poel J. J., de Groot P. N., Brascamp E. W., van Arendonk J. A. M. (1999): Detection of quantitative trait loci for backfat thickness and intramuscular fat content in pigs (Sus scrofa), Genetics, 152, De Koning D. J., Harlizius B., Rattink A. P., Groenen M. A. M., Brascamp E. W., van Arendonk J. A. M. (2001): Detection and characterization of quantitative trait loci for meat quality traits in pigs, Journal of Animal Science, 79, Désautés C., Bidanel J. P., Milan D., Iannuccelli N., Amigues Y., Bourgeois F., Caritez J. C., Renard C., Chevalet C., Mormede P. (2002): Genetic linkage mapping of quantitative trait loci for behavioral and neuroendocrine stress response traits in pigs, Journal of Animal Science, 80, Edmondson D. G., Olson E. N. (1989): A gene with homology to the myc similarity region of MyoD1 is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle differentiation program, Genes and Development, 3, Ernst C. W., Vaske D. A., Larson R. G., Rothschild M. F. (1993): MspI restriction fragment length polymorphism at the swine myogenin locus, Journal of Animal Science, 71, Ernst C. W., Vaske D. A., Larson R. G., White M. E., Rothschild M. F. (1994): MspI restriction fragment length polymorphism at the swine MYF6 locus, Journal of Animal Science, 72, 799. Ernst C. W., Davis M. E. (1995): Characterization of regulatory genes involved in the development of porcine muscle. From the 1995 Research Investment Report, the Ohio State University.

83 82 Ernst C. W., Mendez E. A., Robic A., Rothschild M. (1998): Rapid communication: myogenin (MYOG) physically maps to porcine chromosome 9q2.1-q2.6, Journal of Animal Science, 76, 328. Estany J., Tor M., Amills M., Villalba D., Jiménez N., Noguera J. L., Sánchez A. (2002): Relationship of IGF1, IGF2, LEP and LEPR genotypes with plasma IGF-1 and leptin concentrations and production traits in pigs, 7 th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production, Aug 19-23, Montpellier, France. Estellé J., Mercadé A., Noguera J. L., Pérez-Encizo M., Óvilo C., Sánchez A., Folch J. M. (2005): Effect of the porcine IGF2-intron3-G3072A substitution in an outbred Large White population and in an Iberian x Landrace cross, Journal of Animal Science, 83, Feil R., Walter J., Allen N. D., Reik W. (1994): Developmental control of allelic methylation in the imprinted mouse Igf2 and H19 genes, Development, 120, Florini J. R., Ewton D. Z., Falen S. L., Van Wyk J. J. (1986): Biphasic concentration dependency of stimulation of myoblast differentiation by somatomedins, American Journal of Physiology, 250, C Florini J. R., Magri K. A., Ewton D. Z., James P. L., Grindstaff K., Rotwein P. S. (1991): Spontaneous differentiation of skeletal myoblasts is dependent upon autocrine secretion of insulin-like growth factor-ii, Journal of Biological Chemistry, 266, Geldermann H., Müller E., Moser G., Reiner G., Bartenschlager H., Čepica S., Stratil A., Kuryl J., Moran C., Davoli R., Brunsch C. (2003): Genome-wide linkage and QTL mapping in porcine F2 families generated from Pietrain, Meishan and Wild Boar crosses, Journal of Animal Breeding and Genetics, 120, Georges M., Massey J. M. (1991): Velogenetics, or the synergistic use of marker assisted selection and germ-line manipulation, Theriogenology, 35, Gerrard D. E., Okamura C. S., Ranalletta M. A. M., Grant A. L. (1998): Developmental expression and location of IGF-I and IGF-II mrna and protein in skeletal muscle, Journal of Animal Science, 76,

84 83 Gold J. D., Pedersen R. A. (1994): Mechanisms of genomic imprinting in mammals, Current Topics in Developmental Biology, 29, Handel S. E., Stickland N. C. (1984): Muscle cellularity and its relationship with birth weight and growth, Journal of Anatomy, 139, 726. Handel S. E., Stickland N. C. (1988): Catch-up growth in pigs: relationship with muscle cellularity. Anim. Prod. 47, Harlizius B., Rattink A. P., de Koning D. J., Faivre M., Joosten R. G., van Arendonk J. A. M., Groenen A. M. (2000): The X Chromosome harbors quantitative trait loci for backfat thickness and intramuscular fat content in pigs, Mammalian Genome, 11, Hasty P., Bradley A., Morris J. H., Edmondson D. G., Venuti J. M., Olson E. N., Klein W. H. (1993): Muscle deficiency and neonatal death in mice with a target mutation in the myogenin gene, Nature, 364, Hirooka H., De Koning D. J., Harlizius B., Van Arendonk J. A. M., Rattink A. P., Groenen M. A. M., Brascamp E. W., Bovenhuis H. (2001): A whole-genome scan for quantitative trait loci affecting teat number in pigs, Journal of Animal Science, 79, Horák P., Míková G., Urban T., Putnová L., Knoll A., Dvořák J. (2001): Association of polymorphism in the IGF2 gene with litter size in Black Pied Přeštice pigs, Czech Journal of Animal Science, 46, Horák P., Urban T., Dvořák J. (2004): Genetic variability of the CRC and MYF4 genes in genetic resource Přeštice Black-Pied pig, Archiv fűr Tierzucht, 47, Chang K. C., Fernandes K., Chantler P. D. (1995): Cloning and in vivo expression of the pig MYOD gene, Journal of Muscle Research and Cell Motility, 16, Chowdhary B. P. (1998): Cytogenetics and physical chromosome maps, In: The Genetics of the Pig, Rothschild M. F. and Ruvinsky A., Oxon, UK, CAB International, Ingr I. et al. (1993): Hodnocení živočišných výrobků - cvičení, 1. vyd., Brno, ISBN , Jakubec V., Říha J., Matoušek V., Pražák Č., Majzlík I. (2002): Šlechtění prasat, Rapotín, ISBN , 220 s.

85 84 Jeon J. T., Carlborg O., Tornsten A., Giuffra E., Amarger V., Chardon P., Andersson- Eklund L., Andersson K., Hansson I., Lundstrom K., Andersson L. (1999): A paternally expressed QTL affecting skeletal and cardiac muscle mass in pigs maps to the IGF2 locus, Nature Genetics, 21, Ji S., Losinski R. L., Cornelius S. G., Frank G. R., Willis G. M., Gerrard D. E., Depreux F. F. S., Spurlock M. E. (1998): Myostatin expression in porcine tissues: tissue specifity and developmental and postnatal regulation, American Journal of Physiology, 275, Jiang Y. L., Li N., Plastow G., Liu Z. L., Hu X. X., Wu C. X. (2002): Identification of three SNPs in the porcine myostatin gene (MSTN), Animal Biotechnology, 13, Klosowska D., Kuryl J., Elminowska-Wenda G., Kapelanski W., Walasik K., Pierzchala M., Cieslak D., Bogucka J. (2004): A relationship between the PCR-RFLP polymorphism in porcine MYOG, MYOD1 and MYF5 genes and microstructural characteristics of m. longissimus lumborum in Pietrain x (Polish Large White x Polish Landrace) crosses, Czech Journal of Animal Science, 49, Knoll A., Nebola M., Dvořák J., Čepica S. (1997): Detection of a DdeI PCR-RFLP within intron 1 of the porcine MYOD1 (MYF3) locus, Animal Genetics, 28, 321. Knoll A. (1998): Detekce polymorfismu DNA ve vztahu k mapování QTL u prasat, Dizertační práce, MZLU Brno, 117 s. Knoll A., Putnová L., Dvořák J., Čepica S. (2000): A NciI PCR-RFLP within intron 2 of the porcine insulin-like growth factor 2 (IGF2) gene, Animal Genetics, 31, Knoll A., Vykoukalová Z. (2002): Metody detekce polymorfizmů DNA genů, MZLU Brno, ISBN , 168 s. Knott S. A., Marklund L., Haley C. S., Andersson K., Davies W., Ellegren H., Fredholm M., Hansson I., Hoyheim B., Lundstrøm K., Moller M., Andersson L. (1998): Multiple marker mapping of quantitative trait loci in a cross between outbred Wild Boar and Large White pigs, Genetics, 149,

86 85 Kolaříková O., Putnová L., Urban T., Adámek J., Knoll A., Dvořák J. (2003): Associations of the IGF2 gene with growth and meat efficiency in Large White pigs, Journal of Applied Genetics, 4, Kuciel J., Lahučký P. (1996): Vliv genů s velkým účinkem na kvalitu vepřového masa, Živočišná výroba, 41, Kuryl J., Kapelanski W., Cieślak D., Pierzchala M., Grajewska S., Bocian M. (2002): Are polymorphisms in non-coding regions of porcine MyoD genes suitable for predicting meat and fat deposition in the carcass?, Animal Science Papers and Reports, 20, Kuryl J., Pierzchala M., Hojný J., Reiner G., Bartenschlager H., Moser G., Geldermann H. (2003): Linkage and QTL mapping for Sus scrofa chromosome 15, Journal of Animal Breeding and Genetics, 120, Kwok P.-Y. (2003): Single Nucleotide Polymorphisms, Methods and Protocols, Humana Press Inc., 269 pp. Lee S. S., Chen Y., Moran C., Čepica S., Reiner G., Bartenschlager H., Moser G., Geldermann H. (2003): Linkage and QTL mapping for Sus scrofa chromosome 2, Journal of Animal Breeding and Genetics, 120, Lee S. S., Chen Y., Moran C., Stratil A., Reiner G., Bartenschlager H., Moser G., Geldermann H. (2003): Linkage and QTL mapping for Sus scrofa chromosome 5, Journal of Animal Breeding and Genetics, 120, Li E., Beard C., Jaenisch R. (1993): Role for DNA methylation in genomic imprinting, Nature, 366, Li N., Jiang Y.-L., Fan X., Xiao R.-L. (2002): Associations of T-A mutation in the promoter region of myostatin gene with birth weight in Yorkshire pigs, Asian- Australian Journal of Animal Science, 15, Magri K. A., Benedict M. R., Ewton D. Z., Florini J. R. (1994): Negative feedbackregulation of insulin-like growth factor-ii gene-expression in differentiating myoblasts in-vitro, Endocrinology, 135,

87 86 Malek M., Dekkers J. C. M., Lee H. K., Baas T. J., Rothschild M. F. (2001a): A molecular genome scan analysis to identify chromosomal regions influencing economic traits in the pig. I. Growth and body composition, Mammalian Genome, 12, Malek M., Dekkers J. C. M., Lee H. K., Baas T. J., Prusa K., Huff-Lonergan E., Rothschild M. F. (2001b): A molecular genome scan analysis to identify chromosomal regions influencing economic traits in the pig. II. Meat and muscle composition, Mammalian Genome, 12, Marklund L., Moller M. J., Hoyheim B., Davies W., Fredholm M., Juneja R. K., Mariani P., Coppieters W., Ellegren H., Andersson L. (1996): A comprehensive linkage map of the pig based on a wild pig - Large White intercross, Animal Genetics, 28, McPherron A. C., Lawler A. M., Lee S. J. (1997): Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member, Nature, 387, McPherron A. C., Lee S. J. (1997): Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 94, Mikawa S., Akita T., Hisamatsu N., Inage Y., Ito Y., Kobayashi E., Kusumoto H., Matsumoto T., Mikami H., Minezawa M., Miyake M., Shimanuki S., Sugiyama C., Uchida Y., Wada Y., Yanai S., Yasue H. (1999): A linkage map of 243 DNA markers in an intercross of Gottingen miniature and Meishan pigs, Animal Genetics, 30, Milan D., Bidanel J. P., Iannuccelli N., Riquet J., Amigues Y., Gruand J., Le Roy P., Renard C., Chevalet C. (2002): Detection of quantitative trait loci for carcass composition traits in pigs, Genetics Selection Evolution, 34, Miner J. H, Wold B. (1990): Herculin, a 4th member of the MYOD family of myogenic regulatory genes, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 87, Naidu P. S., Ludolph D. C., To R. Q., Hinterberger T. J., Konieczny S. F. (1995): Myogenin and MEF2 function synergistically to activate the MRF4 promoter during myogenesis, Molecular and Cellular Biology, 15,

88 87 Nebola M., Dvořák J., Kuciel J. (1994): Stanovení citlivosti prasat ke stresu DNA testem, Živočišná výroba 39, Nezer C., Moreau L., Brouwers B., Coppieters W., Detilleux J., Hanset R., Karim L., Kvasz A., Le Roy P., Georges M. (1999): An imprinted QTL with major effect on muscle mass and fat deposition maps to the IGF2 locus in pigs, Nature Genetics, 21, Olson E. (1990): MyoD family: a paradigm for development? Genes Development, 4, Paszek A. A., Wilkie P. J., Flickinger G. H., Rohrer G. A., Alexander L. J., Beattie C. W., Schook L. B. (1999): Interval mapping of growth in divergent swine cross, Mammalian Genome, 10, Pinton P., Schibler L., Cribiu E., Gellin J., Yerle M. (2000): Localization of 113 anchor loci in pigs: improvement of the comparative map for humans, pigs, and goats, Mammalian Genome, 11, Quintanilla R., Milan D., Bidanel J. P. (2002): A further look at quantitative trait loci affecting growth and fatness in a cross between Meishan and Large White pig populations, Genetics Selection Evolution, 34, Rattink A. P., de Koning D. J., Faivre M., Harlizius B., van Arendonk J. A. M., Groenen M. A. M. (2000): Fine mapping and imprinting analysis for fatness trait QTLs in pigs, Mammalian Genome, 11, Rathje T. A., Rohrer G. A., Johnson R. K. (1997): Evidence for quantitative trait loci affecting ovulation rate in pigs, Journal of Animal Science, 75, Rehfeldt C., Fiedler I., Dietl G., Ender K. (2000): Myogenesis and postnatal skeletal muscle cell growth as influenced by selection. Livestock Production Science, 66 (2): Rohrer G. A., Alexander L. J., Keele J. W., Smith T. P., Beattie C. W. (1994): A microsatellite linkage map of the porcine genome, Genetics, 136, Rohrer G. A., Alexander L. J., Hu Z. L., Smith T. P., Keele J. W., Beattie C. W. (1996): A comprehensive map of the porcine genome, Genome Research, 6,

89 88 Rohrer G. A., Keele J. W. (1998a): Identification of quantitative trait loci affecting carcass composition in swine: I. Fat deposition traits, Journal of Animal Science, 76, Rohrer G. A., Keele J. W. (1998b): Identification of quantitative trait loci affecting carcass composition in swine: II. Muscling and wholesale product yield traits, Journal of Animal Science, 76, Rohrer G. A. (2000): Identification of quantitative trait loci affecting birth characters and accumulation of backfat and weight in a Meishan-White Composite resource population, Journal of Animal Science, 78, Rosypal S. (2000): Úvod do molekulární biologie, díl druhý, Brno, ISBN X, 300 s. Saiki R. K., Gelfand D. H., Stoffel S., Scharf S. J., Higuchi R., Horn G. T., Mullis K. B. (1985): Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cel anaemia, Science, 230, SAS , 2004 Cary, NC, SAS Institute Inc. Sato S., Oyamada Y., Atsuji K., Nade T., Shin-ichi Sato, Kobayashi E., Mitsuhashi T., Nirasawa K., Komatsuda A., Saito Y., Terai S., Hayashi T., Sugimoto Y. (2003): Quantitative trait loci analysis for growth and carcass traits in a Meishan x Duroc F2 resource population, Journal of Animal Science, 81, Soller M., Andersson L. (1998): Genomic approaches to the improvement of disease resistance in farm animals, Revue scientifique et technique, 17, Sonstegard T. S., Rohrer G. A., Smith T. P. L. (1998): Myostatin maps to porcine chromosome 15 by linkage and physical analyses, Animal Genetics, 29, Soumillion A., Erkens J. H. F., Lenstra J. A., Rettenberger G., Te Pas M. F. W. (1997a): Genetic variation in the porcine myogenin gene locus. Mammalian Genome, 8, Soumillion A., Rettenberger G., Vergouwe M. N., Erkens J. H. K., Lenstra J. A., Te Pas M. F. W. (1997b): Assignment of the porcine loci for MYOD1 to chromosome 2 and MYF5 to chromosome 5, Animal Genetics, 28,

90 89 Steinhauser L. et al. (2000): Produkce masa, Vydavatelství Last, Tišnov, 465 s., ISBN Stratil A., Čepica S. (1999): Three polymorphisms in the porcine myogenic factor 5 (MYF5) gene detected by PCR-RFLP, Animal Genetics, 30, Stratil A., Kopečný M. (1999): Genomic organization, sequence and polymorphism of the porcine myostatin (GDF8; MSTN) gene, Animal Genetics, 30, Te Pas M. F. W., Visscher A. H. (1994): Genetic regulation of meat production by embryonic muscle formation - a review, Journal of Animal Breeding and Genetics, 111, Te Pas M. F. W., Soumillion A., van den Bosch T. J., Veninga G., Meuwissen T. H. E. (1996): Association between polymorphism in the porcine myogenin gene locus and growth traits. In: 47 th Annual Meeting of EAAP, August, Lillehammer, Norway. Te Pas M. F. W., Soumillion A., Harders F. L., Verburg F. J., Van den Bosch T. J., Gauesloot P., Meuwissen T. H. E. (1999a): Influences of myogenin genotypes on birth weight, growth rate, carcass weight, backfat thickness and lean weight of pigs, Journal of Animal Science, 77, Te Pas M. F. W., Harders F. L., Soumillion A., Born L., Meuwissen T. H. E. (1999b): Genetic variation in the porcine MYF5 gene locus. Lack of association with meat production traits, Mammalian Genome, 10, Tothová K. (2003): Štúdium genetickej determinácie vybraných produkčných vlastností ošípaných na molekulárno-genetickej úrovni, Dizertačná práca, SPU Nitra, 109 s. Urbanski P., Kuryl J. (2004): New SNPs in the coding region and 5 flanking region of porcine MYOD1 (MYF3) and MYF5 genes, Journal of Applied Genetics, 45, Urbanski P., Flisikowski K., Starzynski R. R., Kuryl J., Kamyczek M. (2006): A new SNP in the promoter region of the porcine MYF5 gene has no effect on its transcript level in musculus longissimus dorsi, Journal of Applied Genetics, 47, Van Laere A. S., Nguyen M., Braunschweig M., Nezer C., Collette C., Moreau L., Archibald A. L., Haley C. S., Buys N., Tally M., Andersson G., Georges M., Andersson L. (2003): A regulatory mutation in IGF2 causes a major QTL effect on muscle growth in the pig, Nature, Oct. 23, 425,

91 90 Vykoukalová Z., Knoll A., Dvořák J., Rohrer G. A., Čepica S. (2003): Linkage and radiation hybrid mapping of the porcine MYF6 gene to chromosome 5, Animal Genetics, 34, Vyskot B. (1999): Přehled vývojové biologie a genetiky, Ústav molekulární genetiky AV ČR, Praha, ISBN , 241 s. Wada Y., Akita T., Awata T., Furukawa T., Sugai N., Inage Y., Ishii K., Ito Y., Kobayashi E., Kusumoto H., Matsumoto T., Mikawa S., Miyake M., Murase A., Shimanuki S., Sugiyama T., Uchida Y., Yanai S., Yasue H. (2000): Quantitative trait loci (QTL) analysis in a Meishan x Göttingen cross population, Animal Genetics, 31, Wang Y., Jaenisch R. (1997): Myogenin can substitute for Myf5 in promoting myogenesis but less efficiently, Development, 124, Wernersson R., Schierup M. H., Jørgensen F. G., Gorodkin J. et al. (2005): Pigs in sequence space: A 0.66X coverage pig genome survey based on shotgun sequencing, BMC Genomics, 6, 70. Wilkie P. J., Paszek A. A., Beattie C. W., Alexander L. J., Wheeler M. B., Schook L. B. (1999): A genomic scan of porcine reproductive traits reveals possible quantitative trait loci (QTLs) for number of corpora lutea, Mammalian Genome, 10, Wright W. E., Sassoon D. A., Lin V. K. (1989): Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a domain homologous to MYOD, Cell, 56, 607. Wutz A., Smrzka O. W., Schweifer N., Schellander K., Wagner E. F., Barlow D. P. (1997): Imprinted expression of the Igf2r gene depends on an intronic CpG island, Nature, 389, Wyszynska-Koko J., Pierzchala M., Flisikowski K., Kamyczek M., Rozycki M., Kuryl J. (2006): Polymorphisms in coding and regulatory regions of the porcine MYF6 and MYOG genes and expression of the MYF6 gene in musculus longissimus dorsi versus productive traits in pigs, Journal of Applied Genetics, 47, Yang X., Liu D., Li J., Yu L., Xia Y., Yang J. (2002): Studies on porcine myostatin in 5 promoter region, 7 th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production, Aug , Montpellier, France.

92 91 Yoon J. K., Olson E. N., Arnold H. H., Wold B. J. (1997): Different MRF4 knockout alleles differentially disrupt MYF5 expression: cis-regulatory interactions at the MRF4/MYF5 locus, Developmental Biology, 188, Zhou Z., Bornemann A. (2001): MRF4 protein expression in regenerating rat muscle, Journal of Muscle Research and Cell Motility, 22, Internetové odkazy:

93 92 12 ŽIVOTOPIS Jméno a příjmení: Jan Verner Datum narození: Místo narození: Aš, okr. Cheb Národnost: česká Bydliště: Žitná 2601, Pardubice verjan2@post.cz Vzdělání: PhD. studium na Ústavu morfologie, fyziologie a genetiky zvířat, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, obor Molekulární biologie a genetika živočichů, řešitel projektu Fondu rozvoje vysokých škol Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, magisterský studijní program Zootechnika, diplomová práce na téma Detekce mrna genu leptinu u prasat Střední odborná škola veterinární, Hradec Králové

94 93 13 PUBLIKOVANÉ VÝSLEDKY 1. Vykoukalová Z., Knoll A., Verner J.: Study of the leptin gene expression in sows, VII. Miedzynarodowa konferencja studenckich kól naukowych, Akademia Rolnicza, Wroclaw, Verner J., Urban T., Kuciel J.: Variability of MYOD1 gene and its associations with meat production in pigs, XXI Genetic Days, Wroclaw, September 1-3, Verner J., Kuciel J.: Variabilita genu MYOD1 u prasat, Konference doktorandů a studentů MendelNet Agro 04, sborník článků, MZLU Brno, 1. prosince, 2004, ISBN Verner J., Urban T.: Variabilita genů MYF-3 a IGF2 a jejich vliv na kvalitu vepřového masa, XI. medzinárodná vedecká konferencia študentov a doktorandov, FAPZ SPU, Nitra, 2005, ISBN: Verner J.: Relationship between the porcine MYF-3 and MYF-4 genes and their influence on pork meat quality, X. Miedzynarodowa konferencja studenckich kól naukowych, Akademia Rolnicza, Wroclaw, May 12-14, Verner J., Urban T.: Variabilita v genech MYF-3 a MYF-4 u prasat plemene Bílé ušlechtilé, VI. mezinárodní konference doktorandů a pregraduálních studentů "Genetika a šlechtění zvířat", Přerov, , ISBN Verner J., Urban T.: Genetic variability of MYF3 and MYF4 genes in Large White and Landrace breeds of pigs in the Czech Republic, 56 th Annual Meeting of the European Association for Animal Production, Uppsala, Sweden, June 5-8, 2005, ISBN Humpolíček P., Urban T., Verner J.: Relationship between the myogenin gene (MYF4) and litter size of Large White sows, 56 th Annual Meeting of the European Association for Animal Production, Uppsala, Sweden, June 5-8, 2005, ISBN

95 94 9. Knoll A., Verner J., Vykoukalová Z.: SNPs analysis in selected candidate genes in pigs using resequencing, 56 th Annual Meeting of the European Association for Animal Production, Uppsala, Sweden, June 5-8, 2005, ISBN Verner J., Knoll A.: Analýza vybraných genů ovlivňujících masnou užitkovost prasat, MendelNet Agro 05, Proceedings of Ph.D. students conference, MZLU Brno, 2005, ISBN X. 11. Gazdová V., Verner J., Humpolíček P.: Geny MYOD rodiny v masné užitkovosti prasat plemene české bílé ušlechtilé, Acta fytotecnica et zootechnica: Proceedings of the XXII. Genetic Days Conference, Nitra, September 12-14, 2006, ISSN X. 12. Humpolíček P., Verner J., Urban T.: Infuence of MYOD family on meat performance of Czech Large White and Czech Landrace pigs, 57th Annual Meeting of the European Association for Animal Production, Antalya, Turkey, September 17-20, 2006, ISBN Verner J., Humpolíček P., Knoll A.: Impact of MYOD family genes on pork traits in Large White and Landrace pigs, Journal of Animal Breeding and Genetics, sv. 124, č. 2, s ISSN

96 95 14 PŘÍLOHA Výstup z databáze

97 Ukázka posterů 96