Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Využití sekvenování pro vyhledávání polymorfizmu DNA Diplomová práce Vedoucí práce: doc. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D. Vypracovala: Eva Lavická Brno 2007

2

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Využití sekvenování pro vyhledávání polymorfizmu DNA vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. dne. podpis diplomanta.

4 Na tomto místě chci poděkovat svému vedoucímu diplomové práce, doc. RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D., za cenné rady, které mi při psaní diplomové práce poskytl. Mgr. Zuzce Vykoukalové, Ph.D., která mne s nezlomnou trpělivostí a neutuchající mírou optimismu prováděla celou praktickou částí diplomové práce. V neposlední řadě chci poděkovat svým nejbližším, především svému příteli a rodičům, kteří mi psychickou i finanční podporou studium umožnili.

5 Abstrakt Cílem této práce bylo určení primární struktury části prasečího genu MYF6 automatickým sekvenováním PCR produktu, detekce polymorfizmů v získané sekvenci genu MYF6 a určení příslušných restrikčních enzymů pro jejich ověření. Délka sekvenovaného fragmentu byla 379 bp. Analyzovaná DNA pocházela od tří jedinců plemene Bílé ušlechtilé prase. Nejprve byla provedena PCR reakce všech tří vzorků prasečí DNA, vzniklé PCR produkty byly následně použity pro přípravu sekvenační reakční směsi a sekvenovány pomocí automatického genetického analyzátoru ABI PRISM 3100-Avant (Applied Biosystems), který využívá metody cyklického sekvenování v kombinaci se značenými koncovými nukleotidy. V získaných sekvencích prasečího genu MYF6 bylo detekováno 5 jednonukleotidových polymorfizmů. Klíčová slova: sekvenování DNA, automatické sekvenátory, MYF6, detekce polymorfizmů Abstract The aim of this study was to determine the primary structure of the part of the porcine MYF6 gene by automatic sequencing of the PCR product, the detection of the polymorphisms in the gained sequence of the MYF6 gene and determination of the appropriate restriction enzymes for their verification. The total length of the sequenced fragment was 379 bp. Analyzed DNA was isolated from three individuals of breed Large White. At first the PCR reaction of all three samples of porcine DNA was carried out, obtained PCR products were subsequently used for the preparation of sequencing reaction mixes and sequenced using the automated genetic analyzer ABI PRISM Avant (Applied Biosystems), which use methods of cycle sequencing in combination with a fluorescent labelled ddntp. Five single-nucleotide polymorphisms were detected in our sequences of the porcine MYF6 gene. Key words: sequencing DNA, automated sequencers, MYF6, polymorphisms detection

6 Obsah 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Bílé ušlechtilé Plemeno Plemenný standard plemene bílé ušlechtilé Sekvenování DNA Metody pro získání dostatečného množství DNA PCR Subklonování DNA ve fágových vektorech Přímé metody stanovení sekvence DNA Chemické sekvenování DNA (Maxamovo-Gilbertovo sekvenování) Enzymové sekvenování DNA (Sangerovo sekvenování) Automatické sekvenování DNA Sekvenování genomu Sekvenování pomocí hybridizace (SBH) Minisekvenování Aplikace a omezení sekvenování DNA Sekvenování proteinů Polymorfizmus Polymorfizmus DNA Bodový polymorfizmus (SNP, single nucleotide polymorphism) Repetitivní polymorfizmus Gen MYF Embryonální vývoj svalstva Diferenciace mezodermu Proces myogeneze Geny MyoD rodiny Gen MYF Lokalizace genu Struktura, exprese a funkce proteinu Myf Polymorfizmus v genu MYF Vztah polymorfizmu v genu MYF6 k užitkovým vlastnostem MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ Testovaná zvířata Izolace DNA PCR Složení PCR reakční směsi a podmínky cyklování Elektroforetická kontrola PCR Sekvenování Přečištění PCR směsi před přípravou sekvenační reakční směsi Přímé přečištění PCR produktu pomocí MinElute TM PCR Purification Kitu Určení koncentrace DNA v přečištěné PCR směsi Příprava sekvenační reakční směsi a amplifikace templátu Přečištění sekvenační reakční směsi po amplifikaci Přečištění sekvenační reakční směsi pomocí Sigma Spin TM PostReaction Clean-Up Columns Přečištění sekvenační reakční směsi ethanolem... 41

7 4.4.5 Analýza výsledných dat PCR-RFLP VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE Optimalizace metody přímého sekvenování PCR produktu s využitím automatického sekvenátoru Amplifikace specifického úseku genu MYF6 metodou PCR Přímé přečištění PCR produktu pomocí MinElute PCR Purification Kitu Určení koncentrace DNA Příprava sekvenační směsi a amplifikace templátu Přečištění sekvenační směsi a příprava pro analýzu v automatickém sekvenátoru Analýza výsledných dat Detekce polymorfizmů v genu MYF ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TABULEK SEZNAM PŘÍLOH... 58

8 1 ÚVOD Podstatou sekvenování DNA je stanovení pořadí nukleotidů v molekule DNA. V současnosti je sekvenování DNA již rutinní záležitostí, využívá automatických sekvenátorů, které umožňují rychle a spolehlivě stanovit sekvenci nukleotidů. Využití metody sekvenování je široké přes určení přesného pořadí nukleotidů ve specifické molekule DNA po přímou detekci polymorfizmů DNA. Znalost sekvence DNA je běžně používána k odvození informace o aminokyselinové sekvenci kódovaných proteinů, o regulaci jejich tvorby a můžeme ji také využít pro srovnávání homologních genů mezi druhy. Další využití sekvenování lze spatřit v detekci polymorfizmů mikrosatelitů například pro určování parentity, paternity či identifikaci konkrétního jedince a také polymorfizmů DNA genů. Předkládaná diplomová práce je zaměřena na detekci polymorfizmů DNA fragmentu prasečího genu MYF6, který je považován za kandidátní gen pro kvalitu masa. Polymorfizmy byly vyhledávány pomocí přímého sekvenování PCR produktu s využitím modifikované Sangerovy metody sekvenování a čtyřkapilárového automatického sekvenátoru ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems)

9 2 CÍL PRÁCE Zpracovat metodiku pro purifikaci PCR produktu, provedení sekvenační reakce metodou cyklického sekvenování se značenými koncovými nukleotidy. Optimalizovat podmínky čištění sekvenační směsi. Provést vlastní analýzu na sekvenátoru ABI Avant a testování vlivu parametrů elektroforézy. Vyhodnotit tři sekvenační reakce stejného genu u různých jedinců pomocí DNA sequencing analysis software v 5.1., vyhledat rozdíly v sekvenci DNA a pro tyto polymorfizmy vyhledat restrikční endonukleázy vhodné k jejich ověření

10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Bílé ušlechtilé Plemeno Plemenem se rozumí populace zvířat téhož druhu a shodného fylogenetického původu s charakteristickými vlastnostmi a znaky, které přenáší na potomstvo, schopná se reprodukovat (zákon č. 154/2000) Plemenný standard plemene bílé ušlechtilé Bílé ušlechtilé plemeno (BU) je masného užitkového typu. Plemenný typ je vyjádřen bílým zbarvením s hlavou mírně v profilu prohnutou, uši jsou kratší a vzpřímené. Je středního až většího tělesného rámce s kompaktní kostrou, harmonické stavby těla. Úroveň genofondu podmiňující vývin reprodukčních i produkčních vlastností je vysoká a realizuje se vynikající plodností a mléčností, nadprůměrnou výkrmností a průměrnou jatečnou hodnotou (Čechová et al., 2003). V hybridizačním programu je zařazeno do výchozí pozice A jako mateřské plemeno (Steinhauser et al., 2001). 3.2 Sekvenování DNA Sekvenováním se rozumí stanovení primární struktury nukleových kyselin, tj. určení jejich nukleotidového pořadí. Sekvenování nukleových kyselin je poměrně novou metodou. Prvními sekvenovanými nukleovými kyselinami byly v 60. letech 20. století krátké řetězce trna molekul. DNA se transkribovala pomocí RNA polymerázy a potom se sekvenovala. Zpočátku tedy byly používány techniky určující primární strukturu RNA (Křemen et al., 1998). Průlomovým rokem se stal rok 1977, kdy A. Maxam a W. Gilbert a F. Sanger nezávisle na sobě publikovali dvě odlišné metody sekvenování, jež umožnily analýzu mnohem delších úseků DNA. Jednalo se o chemickou (Maxam-Gilbertovu) a enzymovou (Sangerovu) metodu. Dalším pokrokem bylo zavedení automatických sekvenátorů, které znamenalo podstatné zjednodušení a zefektivnění sekvenovacího procesu (Zima et al., 2004)

11 3.2.1 Metody pro získání dostatečného množství DNA Podle Zima et al. (2004) existuje několik možných způsobů, jak získat dostatečné množství nukleové kyseliny potřebného pro další analýzy: lze například přímo amplifikovat cílovou DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR), nebo využít metody klonování pomocí bakteriálních nebo virových vektorů PCR Výhodou PCR (Polymerase Chain Reaction) je zejména to, že umožňuje získat požadovanou a specifickou sekvenci genomové DNA bez jejího předchozího klonování ve vektorech (Šmarda et al., 2005) a v některých svých modifikacích může sloužit i přímo k identifikaci polymorfizmů (Knoll a Vykoukalová, 2002). Podstatou reakce je enzymatická amplifikace DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané sekvence DNA v cyklické reakci o třech teplotních fázích (Dvořák a Vrtková, 2001). Syntézu DNA řízenou templátem katalyzuje teplotně rezistentní DNA polymeráza (např. Taq). PCR umožňuje současnou syntézu obou komplementárních vláken prodlužováním (extenzí) dvou primerů připojených ke komplementárním řetězcům na protilehlých koncích templátu. Každý cyklus PCR zahrnuje teplotní denaturaci DNA, připojení primerů (annealing) a syntézu DNA (elongaci) (Knoll a Vykoukalová, 2002). Reakce se provádějí v tzv. termocykleru, v němž se teplota mění automaticky v naprogramovaných časových intervalech. Postupným opakováním tohoto procesu se exponenciálně vytváří až miliarda kopií vybraného úseku cílové molekuly (Šmarda et al., 2005). V praxi je však amplifikace limitována koncentrací substrátů a aktivitou enzymu. Obecně násobné amplifikace může být dosaženo v 30 až 50 cyklech (Knoll a Vykoukalová, 2002) Optimalizace PCR Jako optimalizace PCR je označován proces výběru a testování nejvhodnějších parametrů, které reakci ovlivňují, tj. složení reakční směsi a teplotní a časový průběh reakce (Knoll a Vykoukalová, 2002) Složení reakční směsi Reakční směs obsahuje kromě DNA, která bude amplifikována, pufr pro DNA polymerázu, směs nukleotidů (dntp), pár primerů specifických pro cílovou sekvenci,

12 termostabilní DNA polymerázu (většinou Taq) a různá aditiva zvyšující účinnost nebo specifitu reakce. Koncentrace volného hořčíku Taq DNA polymeráza potřebuje volný hořčík pro vazbu na templátovou DNA, primery a dntp. Optimální hladina se mění v závislosti na sekvenci, která bude amplifikována a na povaze primerů. Obecně platí, že nedostatek Mg 2+ způsobuje snížení výtěžku reakce, nadbytek snížení její specifity. Deoxyribonukleozid trifosfáty (dntp) patrně neovlivňují specifitu, ale jejich nižší koncentrace může významně zvýšit přesnost Taq polymerázy. Koncentrace 200 µm pro každý nukleotid je dostatečná. Koncentrace PCR primerů má své optimum v závislosti na jejich sekvenci a složení nukleotidů cílové DNA. Pro většinu genomové DNA dává nejlepší výsledky koncentrace primerů v rozmezí 0,1-1,0 µm. Vyšší hladina primerů snižuje specifitu a zvyšuje pravděpodobnost vzniku primerových dimerů. Templátová DNA by měla být v amplifikovaném úseku neporušená. Obvykle se jí dává do PCR 0,1-1 µg. Aditiva v PCR směsi DMSO nebo formamid mohou zvyšovat specifitu tím, že snižují teplotu tání a separace a tím zlepšují nasedání primerů. Želatina, BSA a neionogenní detergenty pomáhají stabilizovat enzym (Knoll a Vykoukalová, 2002). Podle Šmarda et al. (2005) je přesnost a úspěšnost PCR závislá především na návrhu obou primerů, při kterém je nutno brát v úvahu především tato důležitá pravidla: délka primeru zpravidla nukleotidů, obsah G+C 40 % až 60 %, rovnoměrná distribuce oblastí bohatých na G/C a A/T páry, teplota tání primeru (T m ) alespoň 50 C Knoll a Vykoukalová (2002) uvádí, že T m by měla být u obou primerů stejná nebo co nejvíce podobná, souvisí hlavně s délkou a obsahem G+C, který ji zvyšuje a při použití primerů o vyšší teplotě tání je reakce víc specifická,

13 absence komplementárních sekvencí v primerech, které by mohly vést k tvorbě duplexů, zařazení 1 až 2 zbytků G nebo C v sekvenci na 3 -koncích primerů pro zajištění přesné vazby na templát (Šmarda et al., 2005) Teplotní a časový průběh reakce PCR probíhá inkubací vzorků při třech teplotách odpovídajících třem krokům v amplifikačním cyklu: denaturaci, annealing a elongaci (Knoll a Vykoukalová, 2002). Pro úplnou počáteční denaturaci templátu obvykle postačuje zahřátí směsi na C po dobu 2-5 min. Protože Taq DNA-polymeráza má při 95 C poločas stability 40 min, volí se pro následnou denaturaci amplikonů během reakce doba pouze s. (Šmarda et al., 2005). Podle Knoll a Vykoukalová (2002) je teplota potřebná k úplné denaturaci templátu závislá na jeho délce a obsahu GC a delší vystavení vysoké teplotě má za následek snižování aktivity Taq polymerázy. Podmínky pro hybridizaci primerů závisí na zastoupení bází, délce oligonukleotidů a hodnotě T m produktu. Teplota pro připojení primerů (T a ) se stanovuje podle vztahu: T a = 0,3 x T primer m + 0,7 x T primer m 25, avšak obecně užívaným pravidlem pro stanovení T a je snížení teploty T m o 5 C. Teplota T a se obvykle pohybuje v rozmezí 55 až 68 C po dobu s. (Šmarda et al., 2005). Knoll a Vykoukalová (2002) uvádí, že díky přebytku primerů obsažených v reakční směsi je hybridizace většinou okamžitá, a proto se dlouhá inkubace při annealační teplotě nedoporučuje. Vede ke vzniku nespecifických produktů. Syntéza DNA probíhá zpravidla při C, při níž Taq DNA-polymeráza syntetizuje DNA rychlostí cca 60 bází/s (Šmarda et al., 2005). Doba inkubace závisí na velikosti fragmentu DNA, který má být amplifikován, přičemž odpovídající je 1 min na 1000 bp syntetizované DNA (Knoll a Vykoukalová, 2002). Výsledným produktem PCR jsou amplikony úseky DNA definované délky, analogické restrikčním fragmentům, jejichž přítomnost se v reakční směsi prokazuje stanovením jejich velikosti elektroforézou v agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu nebo kvantitativním měřením množství produktu v reálném čase. Podrobná analýza polymorfizmů sekvencí v PCR produktech může být dále provedena některou z následujících metod:

14 elektroforetickou separací produktů za specifických podmínek pro detekci sekvenčních polymorfizmů denaturační gradientovou gelovou elektroforézou (DGGE), analýzou polymorfizmů konformace jednořetězcových forem (SSCP), hybridizací s neradioaktivně značenou sondou komplementární k části sekvence amplifikovaného úseku a detekcí enzymoimunoanalýzou v mikrotitrační destičce (PCR-EIA/ELISA), imobilizací PCR-produktů na membráně a tečkovou hybridizací se značenými alelově-specifickými oligonukleotidy, hybridizací na DNA-čipech, stanovením sekvence DNA (Šmarda et al., 2005) Faktory ovlivňující PCR PCR je plně automatizovaný proces využívající termostabilní DNA polymerázu, avšak i termostabilní DNA polymeráza katalyzuje prodlužování primeru při laboratorní teplotě, což může být příčinou vzniku nespecifických produktů, zejména při nízkých koncentracích templátové DNA. Vysoká citlivost a specifita PCR způsobuje, že kontaminace i jedinou molekulou exogenní DNA postačuje pro získání falešného signálu. Pro minimalizaci falešných výsledků byly doporučeny určité standardní postupy zahrnující používání autoklávových roztoků, fyzikální separaci používaných PCR-reagencií od templátové DNA a produktů PCR, přípravu reagencií i vzorků do alikvotních částí, používání UVsvětla k odstranění exogenních nukleových kyselin na pracovní ploše, používání jednorázových rukavic a přidávání DNA do reakce jako poslední složky. Vyloučení kontaminace je důležité zejména u nízkokopiových templátů DNA, kde je potřeba použít vysokého počtu amplifikačních cyklů, aby bylo dosaženo požadovaného množství produktu (Šmarda et al., 2005). Přítomnost většího množství templátu snižuje účinnost amplifikace, neboť se zvyšuje pravděpodobnost hybridizace templátu s komplementárním řetězcem DNA, místo s primerem (Knoll a Vykoukalová, 2002)

15 Subklonování DNA ve fágových vektorech Potřebné množství jednořetězcové DNA (ssdna) pro sekvenování lze získat klonováním ve fágových vektorech, které jsou vhodné pro klonování fragmentů DNA o délce až 3000 nukleotidů. Jedná se o vektory odvozené od bakteriofága M13, jenž má genom tvořený cirkulární ssdna o přibližně 6400 bp. Fágová DNA se v hostitelské buňce replikuje na cirkulární dvouvláknovou DNA (replikativní forma DNA), která slouží pro vkládání klonovaných fragmentů. Výhodou klonování ve fágu M13 je, že produkované virové částice obsahují pouze jednořetězcový genom a tedy i klonovanou sekvenci v jednořetězcové formě. V současné době je komerčně dostupná řada konstruovaných fágových vektorů M13mp, které jsou odvozené od divokého kmene fága M13 a obsahují gen Lac Z, do kterého je vložen spojovník (polylinker) s vhodnými klonovacími místy a komplementární sekvencí pro vazbu univerzálního sekvenačního primeru (Křemen et al., 1998) Přímé metody stanovení sekvence DNA Přímé metody stanovení sekvence DNA jsou takové metody, ve kterých je pozice každé báze stanovena jednotlivě. Mohou být použity pro studium sekvenčního polymorfizmu DNA, ale vzhledem k jejich časové náročnosti a nevhodnosti pro rutinní provádění se častěji používají nepřímé metody. Mezi přímé metody stanovení sekvence DNA patří např. chemická a enzymová metoda sekvenování, jejichž společným rysem je podle Šmarda et al. (2005) splnění těchto technologických požadavků: definování jednoho z konců fragmentu DNA, u něhož sekvenci stanovujeme, vytvoření souboru jednořetězcových molekul DNA, jejichž vzájemná velikost se liší o jedinou bázi, rozdělení tohoto souboru fragmentů elektroforézou s takovou rozlišovací schopností, která umožňuje navzájem oddělit řetězce DNA lišící se svou délkou o jedinou bázi Chemické sekvenování DNA (Maxamovo-Gilbertovo sekvenování) Podstatou chemické metody sekvenování je specifické rozštěpení molekuly DNA chemickými činidly v místech, kde je lokalizována báze určitého typu. Výchozím

16 materiálem je soubor identických fragmentů jednořetězcové DNA označených radioaktivně nebo fluorescenčně na 3 - nebo 5 - konci (Rosypal et al., 1997). Podle Křemen et al. (1998) je technika značení závislá na charakteru analyzovaných fragmentů. Každý ze čtyř typů bází v molekule DNA lze určitým způsobem modifikovat tak, aby bylo v tomto místě možno dosáhnout přerušení řetězce DNA. Mezi chemikálie používané k modifikaci bází patří dimethylsulfát, hydroxid sodný, kyselina mravenčí a hydrazin (tab. 1). Podmínky reakce se zvolí tak, aby byla poškozena v průměru pouze jedna báze v řetězci. Výsledkem modifikace a nakonec i eliminace báze je vytvoření křehkého místa v řetězci DNA, které je velmi citlivé ke štěpení. Poté je DNA za vysoké teploty vystavena působení piperidinu, což vede k rozštěpení řetězce v zeslabených místech (Šmarda et al., 2005). Důležité je uvědomit si, že v každém ze 4 chemicky modifikovaných vzorků se pracuje ne s jedním ale s populací statisíců DNA řetězců, takže i když k rozlomení dojde v různých místech náhodně, existuje stoprocentní šance, že se vyskytnou v jednom chemicky modifikovaném vzorku fragmenty všech délek (Hruban a Majzlík, 2000). Zima et al. (2004) by postupoval takto (obr. 1): 1. Nejprve je DNA rozštěpena na kratší fragmenty restriktázou. Poté jsou komplementární řetězce separovány a radioaktivně označeny izotopem 32 P. Každý z řetězců je samostatně sekvenován a výsledky jsou potom porovnány. Vývoj speciálních sekvenačních vektorů umožnil selektivní značení konců komplementárních řetězců, které tak lze sekvenovat bez jejich separace. 2. Fragmenty jsou rozděleny do čtyř vzorků. 3. Na každý vzorek se působí chemickou látkou, která specificky modifikuje jeden nebo dva typy bází, přičemž podmínky reakce jsou upraveny tak, že v řetězci DNA jsou modifikovány vždy jen některé z bází příslušného typu. 4. Působením další chemické látky piperidinu se štěpí DNA řetězce ve všech místech, v nichž byly báze modifikovány. Výsledkem štěpení molekul v daném vzorku je soubor fragmentů DNA všech různých délek, které odpovídají vzdálenosti bází příslušného typu od značeného konce výchozího fragmentu. 5. Jednotlivé fragmenty jsou rozděleny elektroforézou v denaturujícím polyakrylamidovém gelu, jehož rozlišovací schopnost umožňuje navzájem

17 oddělit řetězce DNA lišící se svou velikostí o jedinou bázi. Vzorky z každé ze čtyř reakcí jsou na gel naneseny vedle sebe v definovaném pořadí. 6. Detekce fragmentů se provede autoradiograficky po jejich přenosu na nitrocelulózový filtr, přičemž detekovány budou pouze fragmenty obsahující radioaktivně značený konec. 7. Sekvence DNA se stanoví podle autoradiogramu odečtením poloh pruhů v jednotlivých drahách. Délka sekvence, kterou lze odečíst, závisí na délce použitého gelu. Tab. 1 Chemické modifikace bází používané při Maxamově-Gilbertově sekvenování Báze Specifická modifikace Po metylaci guaninu dimethylsulfátem dochází v alkalickém prostředí G k otevření purinového cyklu mezi C 8 a C 9 a jeho následnému odštěpení řetězec bude rozštěpen v pozici, kde se nachází guanin. V prostředí piperidinu a kyseliny mravenčí dochází následkem protonace A + G atomů dusíku v purinových cyklech k přerušení N-glykosidové vazby a depurinaci DNA ke štěpení řetězce dojde v pozici A+G. Hydrazin otevírá a odštěpuje z řetězce pyrimidinové báze štěpení řetězce C + T v pozici C+T. Při vysoké iontové síle je štěpení tyminu hydrazinem potlačeno a specificky C je modifikován pouze cytosin štěpení řetězce pouze v pozici C. Křemen et al. (1998) fragmenty DNA rozděluje do pěti vzorků, přičemž ve vzorku 5 je účinkem vysoké teploty a alkalického ph odštěpován přednostně adenin a v menší míře cytosin

18 Obr. 1 Chemické sekvenování podle Maxama a Gilberta (Šmarda et al., 2005) Modifikace chemické metody sekvenování se využívá k identifikaci DNA sekvencí, na něž se vážou proteiny vázající se na DNA, např. transkripční faktory (Rosypal, 1997). Nevýhodou chemické metody sekvenování je, že vyprodukovaná data bývají častěji nejednoznačná než u enzymového sekvenování, protože reaktivita chemických činidel je ovlivněna různými nečistotami. K dalším důvodům nízkého používání této metody patří nutnost používat radioaktivní značení konců přinášející vysokou úroveň radioaktivity a v porovnání s enzymovým sekvenováním poskytuje chemické relativně kratší sekvence a postup pro jejich získání je laboratorně náročnější (Šmarda et al.,

19 2005). Podle Křemen et al. (1998) lze touto metodou sekvenovat řetězce o maximální délce nukleotidů Enzymové sekvenování DNA (Sangerovo sekvenování) Enzymová metoda sekvenování je v současné době nejběžnější metodou sekvenování DNA. Vyvinula se z techniky označené jako sekvenování + / -, která poprvé využila prodloužení primeru DNA polymerázou a její specifické zakončení, avšak byla poměrně málo přesná (Šmarda et al., 2005). Podstata této metody je opačná od předešlé. DNA řetězec zde není štěpen, ale naopak při sekvenování je komplementární vlákno podle předlohy prodlužováno DNA polymerázou (Hruban a Majzlík, 2000). Jako předloha pro syntézu komplementárních řetězců různé délky je použita DNA, jejíž sekvence má být stanovena. Syntéza řetězce na matricové DNA se zahájí z místa, ke kterému je připojen sekvenčně specifický primer, a ukončí se v místě, ve kterém se do rostoucího řetězce inkorporuje místo normálního deoxyribonukleozidtrifosfátu jeho analog 2,3 -dideoxynukleozidtrifosfát (ddntp) (Rosypal et al., 1997). Dideoxynukleozidtrifosfáty postrádají na 3 -uhlíku deoxyribózy OH-skupinu a proto k nim nemůže DNA polymeráza navázat další nukleotid. Jestliže během syntézy nukleotidového řetězce dojde k náhodné inkorporaci dideoxynukleozidtrifosfátu (dda, ddc, ddg, ddt), replikace se zde zastaví. ddntp tedy působí po začlenění do řetězce jako koncové inhibitory syntézy DNA (Zima et al., 2004). Alternativou ddntp mohou být arabinonukleozidtrifosfáty (Hindley and Staden, 1983). Postup Sangerovy metody je poměrně jednoduchý (obr. 2): 1. Podobně jako u chemické metody sekvenování jsou reakce prováděny ve čtyřech oddělených vzorcích. Každá reakce je určena ke stanovení relativní pozice specifické báze na konci analyzovaného řetězce. To je provedeno přípravou reakčních směsí, které obsahují: purifikovanou molekulu DNA, jejíž sekvence má být stanovena, specifický primer připojující se k části molekuly DNA nebo v případě, že jde o klonovanou DNA, k místu připojení na vektoru, směs všech čtyř nukleotidů,

20 DNA polymerázu (používají se různé typy polymeráz, např. Klenowův fragment DNA polymerázy I, T7 DNA polymeráza zbavená 3 -exonukleázové aktivity chemickou modifikací označovaná jako Sequenase TM, zpětná transkriptáza nebo Taq DNA polymeráza) (Šmarda et al., 2005). Na rozdíl od předchozí procedury lze Sangerovou metodou sekvenovat pouze jednořetězcovou DNA (ssdna), kterou lze získat buď tepelnou denaturací před vlastním sekvenováním, klonováním v bakteriálním či virovém vektoru nebo další PCR amplifikací s převahou jednoho primeru (asymetrickou PCR). 2. Do každého ze vzorků je přidán vždy jen jeden značený dideoxynukleotid (Zima et al., 2004). Poměr mezi ddntp a odpovídajícím dntp (zpravidla 1:100) v reakční směsi rozhoduje o tom, jak dlouhé řetězce budou DNA polymerázou syntetizovány. Vyšší poměr vede k tvorbě kratších fragmentů (Šmarda et al., 2005). 3. Po proběhnutí polymerizační reakce jsou jednotlivé fragmenty separovány pomocí denaturující PAGE v dlouhém gelu, přeneseny na velký list silného filtračního papíru a po vysušení ve vakuové sušičce detekovány autoradiograficky (Zima et al., 2004). Jako primery lze použít krátké restrikční fragmenty nebo synteticky připravené oligonukleotidy o délce zhruba 18 bází. V případě sekvenování produktů PCR je možné použít stejné primery se kterými byl fragment DNA amplifikován. Řada vektorů je pro účely sekvenování cíleně upravena a obsahuje obvykle po obou stranách mnohočetného klonovacího místa krátké specifické sekvence, k nimž se připojují univerzální sekvenační primery. Při manuálním provádění Sangerova sekvenování je možné stanovit sekvenci dlouhou přibližně bází (Šmarda et al., 2005). Modifikací Sangerovy metody je termální cyklické sekvenování. Při této metodě je syntéza DNA katalyzována termostabilní DNA polymerázu (Taq nebo Vent polymeráza). Dvouřetězcový templát je nejprve tepelně denaturován a na jeden z oddělených komplementárních řetězců je navázán značený primer, od jehož 3 -konce počíná polymerázová extenze. Následné cykly denaturace, vazby primerů a syntézy nové DNA vedou k lineární amplifikaci značeného produktu (Zima et al., 2004)

21 Obr. 2 Enzymové sekvenování DNA podle Sangera

22 Automatické sekvenování DNA Aby bylo možné zvládnout zvyšující se požadavky na kvalitu a množství sekvenování, byly v posledních letech vyvinuty plně automatizované sekvenátory DNA, které jsou vesměs založeny na termálně cyklické modifikaci Sangerovy metody (Nejedlá, 1998) a které zajišťují separaci reakčních produktů, detekci, shromáždění dat z reakce a analýzu pořadí bází. Automatické sekvenování DNA umožňuje stanovit a následně i zpracovat sekvence DNA mnohem rychleji než při standardních postupech. Je proto využíváno zejména při sekvenování DNA z genomových knihoven. Proti standardní enzymové metodě má tyto odlišnosti: Syntéza DNA probíhá metodou asymetrické PCR v termocykleru, s extenzí řetězce zprostředkovanou Taq DNA polymerázu. K detekci reakčních produktů se používají čtyři různé fluorescenční značky, každá určená pro detekci produktů zakončených specifickou bází. Chemie fluoroforů pro automatické sekvenování využívá 2 odlišné přístupy: barevně značené primery nebo barevně značené terminátory. K nejčastěji používaným fluoroforům patří FAM (6-karboxyfluorescein), TET (6-karboxy-2,4,7,7 tetrachloro-fluorescein), HEX (2,4,4,5,7,7 -hexachlorofluorescein) a TAMRA (5-karboxytetrametylrodamin). Pokud jsou fluorofory připojené k primerům, je třeba primer syntetizovat čtyřikrát a během tohoto procesu je k primeru připojena specifická fluorescenčně značená báze. Následně jsou pro asymetrickou PCR připraveny 4 reakční směsi, z nichž každá obsahuje templátovou DNA, čtyři dntp, specifický ddntp, specifický fluorescenčně značený primer a další potřebné reagenty. Primer definuje 5 -konec molekul produktů a začleněný ddntp definuje totožnost báze na 3 -konci. Jakmile je reakce dokončena, jsou barevné produkty ze všech čtyřech reakcí smíchány a naneseny do jedné dráhy automatického analyzátoru. V případě, že jsou pro detekci sekvenačních produktů použity barevně značené terminátory, 3 -konec molekuly a současně totožnost báze jsou určeny příslušnou fluorescenční značkou. Polymerizační reakci lze potom provést v jedné zkumavce obsahující templátovou DNA, primer, čtyři dntp, čtyři značené ddntp a další nezbytné reagenty. Reakční produkty jsou rozděleny v elektroforetickém gelu v téže dráze. Výhodou použití barevně značených terminátorů je skutečnost, že jsou vizualizovány pouze ty produkty

23 prodloužených primerů, které jsou zakončeny barevně značeným ddntp a nikoli produkty předčasně ukončené syntézy. To umožňuje snížit signály pozadí a obecně vede k získání kvalitnějších výsledků. Délka stanovené sekvence je typicky mezi bázemi. Detekce produktů sekvenačních reakcí probíhá v průběhu elektroforetické separace (v polyakrylamidovém gelu nebo v kapilárách) automaticky pomocí laserového detektoru napojeného na počítač, který z pořadí pruhů v příslušných drahách přímo vyhodnocuje sekvenci DNA. U aparatur poslední generace probíhá elektroforetická separace v kapilárách. Kapilárnímu uspořádání se dává přednost při prostém sekvenování a fragmentační analýze, zatímco deskovému v molekulární diagnostice při detekci heterozygotů (Šmarda et al., 2005) Sekvenování genomu První známé sekvence celého genomu byly publikovány v roce 1995 (Mycoplasma genitalium, Haemophilus influenzae), nyní je známa kompletní sekvence více než 100 druhů organizmů (Zima et al., 2004). V současnosti je možno v jedné sekvenační reakci zjistit sekvence fragmentů o délce přibližně nukleotidů (Flegr, 2005). Ke stanovení sekvence fragmentů DNA delších než bází, lze použít dvě zcela odlišné strategie: náhodné sekvenování nebo uspořádané sekvenování sousedních úseků, přičemž volba strategie závisí především na velikosti stanovované sekvence. Při náhodném sekvenování genomu jsou nejdříve připraveny mechanickým stříháním genomové DNA fragmenty s optimální velikostí ( bp) a po úpravě jejich konců jsou nahodile klonovány do vhodného vektoru za vzniku velkého počtu klonů. Předpokládá se, že celková informace o sekvenci obsažená v připravených malých klonech odpovídá původní DNA a sekvence fragmentů jednotlivých klonů se vzájemně překrývají. Pomocí univerzálních sekvenačních primerů připojujících se k vektoru v blízkosti klonovacího místa jsou stanoveny sekvence krátkých úseků na koncích klonovaných fragmentů. Pomocí speciálních počítačových programů jsou stanovené sekvence použity k uspořádání klonovaných fragmentů z jednotlivých vektorů do souvislých sekvencí genomové DNA kontigů. Nevýhodou této strategie je, že

24 neumožňuje získat úplnou sekvenci genomu, neboť po počítačovém sestavení zůstanou mezery odpovídající nenaklonovaným fragmentům. Uspořádané sekvenování umožňuje doplnit sekvence mezer zbývajících po náhodném sekvenování a to přístupem nazvaným procházení primerem nebo postupným zkracováním fragmentu exonukleázou a tvorbou přilehlých delecí. Procházení primerem vyžaduje znalost sekvence, ke které se připojuje primer. Sekvence získaná z první reakce je použita pro návrh primeru pro další reakci a tento krok se opakuje, dokud není dosaženo kompletního stanovení sekvence. Uspořádané sekvenování genomu je v porovnání s náhodným mnohem pomalejší a dražší v důsledku nutnosti návrhu a syntézy nových primerů a rovněž není vhodné pro stanovení repetitivních sekvencí (Šmarda et al., 2005) Sekvenování pomocí hybridizace (SBH) SBH je nepřímá metoda stanovení sekvence DNA, ve které je sekvence DNA sestavena na základě výsledku hybridizace oligonukleotidových sond se sekvencemi analyzované DNA. Perspektivní a účinnou metodou je varianta SBH prováděná prostřednictvím technologie DNA-čipů (DNA microarray), kdy fluorescenčně značený fragment analyzované DNA je hybridizován k DNA-čipu obsahujícímu všechny kombinace oligonukleotidů s konstantní délkou. Výsledek hybridizace je odečten konfokálním mikroskopem a sekvence je odvozena dedukcí z hybridizujících pozicí. Tato metoda by měla v budoucnu po dosažení miniaturizace a zvýšení citlivost detekčních sond až na jedinou molekulu sondy umožnit rutinní sekvenční analýzu celých genomů v jednom hybridizačním experimentu (Šmarda et al., 2005) Minisekvenování Metoda minisekvenování je založená na prodloužení 3 -konce primeru o jediný značený nukleotid, který slouží jako terminátor. Technologie je určená pro ověření jednonukleotidových polymorfizmů v sekvencích a umožňuje spolehlivě odlišit jednotlivé alely genů. Primer se váže svým 3 -koncem v těsném sousedství polymorfního místa. K prodloužení primeru DNA polymerázou dojde pouze tehdy, jestliže značený nukleotid přítomný v reakci je komplementární k bázi v cílovém místě (Šmarda et al., 2005)

25 3.2.6 Aplikace a omezení sekvenování DNA Dle Zima et al. (2004) je základním předpokladem úspěšného sekvenování DNA homogenita zkoumaných sekvencí. Nehomogennost způsobená kontaminací templátové DNA, nebo polymorfizmem v důsledku mezialelové proměnlivosti, může vést k chybným výsledkům. Další omezení může představovat vysoká frekvence inkorporace nesprávného nukleotidu u některých typů polymeráz včetně Taq polymerázy. Podle Šmarda et al. (2005) frekvence chyb Taq DNA polymerázy je 1 na 4000 až 5000 bp a in vitro je značně závislá na vyváženosti jednotlivých složek reakce. Aplikační možnosti sekvenování nukleových kyselin spadají do tří základních skupin: evoluce genů, vnitrodruhové (populační) studie a mezidruhové studie (Zima et al., 2004). 3.3 Sekvenování proteinů Metoda stanovení primární struktury proteinů čili sekvence aminokyselin je známa od roku 1953 a jejím otcem je F. Sanger. Příliš dlouhé proteiny jsou nejprve rozštěpeny na kratší peptidové řetězce, které jsou sekvenovány samostatně a sekvence celého proteinu je potom sestavena na základě překrytí jednotlivých fragmentů. V současné době se při sekvenování proteinů, podobně jako při sekvenování nukleových kyselin, používají automatické sekvenátory. Doba identifikace jedné aminokyseliny v nich trvá kolem dvou hodin a lze jimi zjišťovat sekvenci fragmentů dlouhých až 50 aminokyselin (Zima et al., 2004). 3.4 Polymorfizmus Pro většinu přírodních populací je charakteristický více či méně nápadný polymorfizmus (řec. polys = mnohý, morfe = tvar). Jedinci téhož pohlaví a téhož stáří se v rámci populace liší jeden od druhého v celé řadě kvantitativních i kvalitativních znaků. Část tohoto polymorfizmu je nedědičné povahy, vzniká jako odpověď jedince na vlivy vnějšího prostředí. Velká část polymorfizmu je však určena geneticky, a je tedy v různé míře dědičná (Flegr, 2005). Za genetický polymorfizmus je odpovědná přítomnost více než dvou variant genu v rámci jednoho druhu, přičemž výskyt nejméně frekventované alely v populaci nezáleží na opakované mutaci (Hruban, 1999), v širším smyslu slova je genetický polymorfizmus chápán jako dědičná mnohotvarost ve struktuře DNA a proteinů (Hruban a Majzlík, 2000)

26 V podstatě existují dva základní typy polymorfizmu (polymorfních genů). První skupinou jsou geny, které se vyskytují v populaci ve velké frekvenci v jedné standardní formě a v mnohem menší frekvenci, většinou méně než 1 %, ve formách minoritních. U těchto alel se předpokládá, že se v populaci vyskytují pouze přechodně, případně že jsou zde udržovány díky dynamické rovnováze dvou procesů mutačního tlaku a selekce (Flegr, 2005). Nussbaum et al. (2004) tyto alely nacházející se na méně než 1 % chromozómů v celé populaci označuje termínem vzácné varianty, Hruban (1999) jako mutační formy polymorfizmu. U druhé skupiny genů je obtížné říci, která alela je standardní a která mutovaná, neboť všechny, nebo alespoň mnohé se vyskytují v populaci ve vysoké frekvenci (Flegr, 2005). Jedná se o tzv. populační formy polymorfizmu, které se staly součástí genofondu populace (Hruban, 1999) Polymorfizmus DNA Detekce polymorfizmů se může týkat celkové genomové, chromozómové nebo mitochondriové DNA a nebo polymorfizmů specifických genů, případně jejich částí (Šmarda et al., 2005). Variabilita na úrovni DNA je zpravidla způsobena bodovou mutací v sekvenci nukleotidů nebo různým počtem opakování nukleotidových motivů a podle toho lze polymorfizmus DNA rozdělit na bodový a repetitivní (Hruban a Majzlík, 2000) Bodový polymorfizmus (SNP, single nucleotide polymorphism) Polymorfizmus v jednom nukleotidu je nejmenší možná genetická změna, týkající se pouze jednoho páru bází, a to ve významné části populace (> 1 %). Vznikl bodovými mutacemi (tranzice, transverze), které se u eukaryontů v rámci druhu vyskytují každých bp a proto prakticky v každém genu lze nalézt polymorfizmus (Hruban a Majzlík, 2000). Většina SNP leží mimo kódující sekvence, ty které leží uvnitř exonů jsou převážně bez vlivu na aminokyseliny, díky degeneraci genetického kódu. SNP nacházející se v restrikčních místech mohou být stanovovány jako RFLP (restriction fragment length polymorphism, polymorfizmus v délce restrikčních fragmentů) pomocí Southernova blotu s DNA štěpenou příslušnou restrikční endonukleázou a s detekcí značenou sondou, nebo pomocí PCR, amplifikací fragmentu s primery okolo restrikčního místa a následným rozštěpením produktu reakce restrikční endonukleázou (Šmarda et al., 2005). Metoda stanovení polymorfizmů délky

27 restrikčních fragmentů je založena na schopnosti specifických restrikčních enzymů štěpit vlákna DNA jen v místě určitých kombinací bází, přičemž tyto sekvence jsou přísně specifické pro jednotlivé druhy restrikčních endonukleáz (Dvořák et al., 1993). SNP ležící mimo restrikční místa jsou stanovovány pomocí hybridizace DNA s oligonukleotidy, sekvenčně specifickými pro každou variantu, nebo využitím metody minisekvenování. Nejmodernější metodou k testování SNP je technologie DNA čipů (Dvořák a Vrtková, 2001). Pomocí 500k GeneChip lze určit najednou genotyp SNP, na dvou čipech o SNP. Podstatou polymorfizmu délky restrikčních fragmentů jsou mutace vedoucí k vytvoření nebo ztrátě rozpoznávacích míst pro restrikční endonukleázy, nebo vznikají jako důsledek přítomnosti různého počtu repetitivních sekvencí, delecí, inzercí nebo přestaveb ve specifických oblastech chromozómů (Šmarda et al., 2005) Repetitivní polymorfizmus Podstatou repetitivního polymorfizmu je existence variabilních a hypervariabilních opakujících se sekvencí v genomu. Jedinci se od sebe liší počtem opakování určitých sekvencí tak, jak jdou tandemově za sebou, nebo se kromě toho v repetitivním segmentu liší výskytem mutací, které jsou rozpoznatelné jako restrikční místa pro endonukleázy. Obvykle se rozlišuje tzv. polymorfizmus minisatelitní a mikrosatelitní DNA. Z hlediska polymorfizmu jsou vysoce informativní (Hruban, 1999). Polymorfizmus mikrosatelitní DNA Mikrosatelity jsou úseky DNA tvořené opakováním jednotky o délce dvou, tří nebo čtyř nukleotidů. Počet opakování základních nukleotidových jednotek obsažených v jednom mikrosatelitu se může lišit mezi dvěma homologními chromozomy jednotlivce i mezi jednotlivci v populaci (Nussbaum et al., 2004). Vyskytují v kódujících i nekódujících oblastech a vzhledem ke své struktuře a tandemovému uspořádání bývají někdy označovány jako krátké tandemové repetice (STR, short tandem repeats), nebo repetice jednoduchých sekvencí (SSR, simple sequence repeats) (Zima et al., 2004). Na rozdíl od bodového polymorfizmu k detekci mikrosatelitního polymorfizmu není třeba restrikční štěpení, lze jej určit pouze pomocí PCR (Hruban a Majzlík, 2000)

28 Polymorfizmus minisatelitní DNA Minisatelitní DNA je tvořena motivy v sekvenci dlouhé nukleotidů, které se v genomu opakují x (Hruban, 1999). Tandemovou inzercí několika minisatelitů do DNA mezi dvěma restrikčními místy vzniká polymorfizmus označovaný jako variabilní počet tandemových repetic (VNTR variable number of tandem repeats) (Nussbaum et al., 2004). 3.5 Gen MYF6 Růst svaloviny a konečné množství svaloviny jsou determinovány převážně počtem a velikostí svalových vláken. Rozsah multiplikace svalové buňky do značné míry určuje, kolik svalových vláken se v období myogeneze vytvoří. Proto je počet svalových vláken determinován především genetickými faktory a těmi faktory prostředí, které jsou schopny ovlivnit prenatální myogenezi. Současný výzkum naznačuje, že zvířata s větším počtem svalových vláken průměrné velikosti produkují více masa lepší kvality (Rehfeldt et al., 2000). Tvorba svalových vláken u savců probíhá pouze během embryonálního vývoje a je kontrolována MyoD rodinou zahrnující geny MYF3, MYF4, MYF5 a MYF6 (Olson, 1990; Weintraub et al., 1991; te Pas et al., 1999), přičemž MYF3, MYF4 a MYF5 se podílí na regulaci tvorby a počtu myofibril ve svalech v embryogenezi a MYF6 působí po narození (Steinhauser et al., 2000) Embryonální vývoj svalstva Myogeneze je komplex biologických procesů, při němž se z multipotenčních mezodermálních kmenových buněk diferencují funkční svalové buňky (Braun et al., 1991) Diferenciace mezodermu Svalová tkáň vzniká ze středního zárodečného listu mezodermu. Diferenciace mezodermu probíhá v raném embryonálním období a pro vývoj kosterního svalstva je důležitá diferenciace paraxiálního mezodermu. Celistvá ploténka paraxiálního mezodermu se ve 20. až 30. dnu věku embrya rozděluje na párové epitelové útvary zvané somity neboli prvosegmenty. Brzy po svém vzniku se každý prvosegment rozdělí na sklerotom, myotom a dermatom a zatímco mezodermové buňky sklerotomů a dermatomů migrují a přeměňují se na mezenchym,

29 buňky myotomů zůstávají na místě a diferencují se na základy kosterních svalů (Steinhauser et al., 2000) Proces myogeneze V počáteční fázi myogeneze se buňky myotomů diferencují v buňky vřetenovitého tvaru, myoblasty. Většina embryonálních svalových buněk podléhá diferenciaci, některé z nich však zůstávají nediferencované a perzistují jako nediferencované myoblasty až do dospělosti. Z těchto myoblastů vznikají tzv. satelitní buňky, které se přímo nepodílejí na tvorbě svalových vláken (Steinhauser et al., 2000). Diferenciace myoblastů ve svalová vlákna je ovlivněna MyoD rodinou transkripčních faktorů, MyoD, MRF4 a obzvláště myogeninem. Z jiných transkripčních faktorů hraje při diferenciaci myoblastů významnou roli Mef2 rodina (Buckingham et al., 2003). Diferencované myoblasty se řadí za sebe do sloupců a v místě buněčných kontaktů dochází k postupnému zanikání buněčných membrán. Tím se vytvoří syncyciálně uspořádané útvary zvané myotuby, k jejichž povrchu naléhají satelitní buňky. Jednotlivé myotuby se postupem vývoje prodlužují a řadí v podélném směru vedle sebe. Jedna myotuba může obsahovat až 100 jader myoblastů uložených uprostřed myotuby. Satelitní buňky se diferenciace myotuby ve svalové vlákno dále neúčastní, zůstávají nediferencované a slouží jako rezervní materiál, jehož latentní potenciál, tzn. schopnost buněčného dělení a diferenciace, se uplatňuje podle potřeby mnohem později. Ve stádiu myofibrilogeneze dochází k další diferenciaci myoblastů, tvorbě myofibril a vzniku příčně pruhovaného svalového vlákna. Výsledkem myofibrilogeneze je definitivní přeměna myotuby ve svalové vlákno (Steinhauser et al., 2000). Schématické znázornění utváření kosterního svalu je uvedeno na obrázku

30 Obr. 3 Schématické znázornění utváření kosterního svalu, s odlišnými fázemi a geny potenciálně se účastnících každého stádia (Buckhingham et al., 2003) Geny MyoD rodiny MYF3 (MYOD1) indukuje diferenciaci fibroblastů na myoblasty a je lokalizován na chromozómu 2p 1.4 p 1.7 (Knoll a Vykoukalová, 2002). MYF5 je exprimován během proliferace myoblastů z mezodermu (te Pas et al., 1999). Myogenin (MYF4, MYOG) sehrává rozhodující roli v průběhu myogeneze. Je exprimován ve všech myoblastech od začátku diferenciace a jeho exprese pokračuje během fúze buněk. Exprese myogeninu rovněž určuje konec proliferace myoblastů a reguluje fúzi jednojaderných myoblastů v mnohojaderné myofibrily (te Pas et al., 1999). U plemene Large White bylo zjištěno, že genotypy MYF4 jsou v asociaci s hmotností selat při narození, s růstem a jatečnou hmotností a s množstvím masa (Steinhauser et al., 2000). MYF6 (MRF4)

31 3.5.3 Gen MYF6 Alternativní názvy: herculin (herkulin) MRF4 (muscle regulatory factor 4) Becker muscular dystrophy modifier Produktem genu MYF6 je myogenní faktor 6 (Myogenic factor 6, Myf6), který je členem MyoD rodiny čtyř bhlh transkripčních faktorů (MyoD, Myogenin, Myf5, Myf6) (Vykoukalová, 2005), které ovlivňují myogenezi indukcí exprese svalově specifických genů (Lassar et al., 1989; Wyszyńska et al., 2004). Geny MyoD rodiny také regulují aktivitu satelitních buněk v postnatálním období (Dvořák a Vrtková, 2001). Transkripční faktor je kterýkoli protein eukaryotní buňky, který po specifické vazbě na protisměrný element promotoru příslušné transkripční jednotky nebo na zesilovač transkripce navozuje a reguluje její transkripci (Rosypal et al., 2001). U eukaryot je přítomnost transkripčních faktorů na rozdíl od prokaryot pro zahájení transkripce příslušné transkripční jednotky nutná. Rosypal et al. (1997) dělí transkripční faktory do těchto dvou skupin: Obecné transkripční faktory, které se vyskytují ve všech nebo většině eukaryotických buněk a buněčných typech mnohobuněčného organizmu. Geny, jejichž promotory jsou obsazeny obecnými transkripčními faktory, bývají obvykle provozní tzn. vyjádřené ve všech buňkách, jelikož jsou potřebné pro udržování jejich základních funkcí. Speciální transkripční faktory, které se vyskytují v buňkách určitých tkání a v určité době. Zvyšují účinnost transkripce nad bazální hladinu u těch genů, které svou expresí specifikují daný buněčný typ pro produkci určitých proteinů. Uplatňují se proto i při diferenciaci buněk a jsou indukovatelné. Transkripce genů daného buněčného typu je výsledkem kombinace účinků obecných a speciálních transkripčních faktorů Lokalizace genu Vykoukalová et al. (2003) lokalizovali gen MYF6 u prasete pomocí vazbového mapování na q raménko chromozomu 5, do pozice 146 cm na vazbové mapě USDA

32 MARC. Radiačně hybridním mapováním pak umístili gen MYF6 na RH mapě mezi markery SW378 a SW967. U člověka se gen MYF6 nachází na chromozómu 12 v těsné blízkosti genu MYF5. Vzdálenost mezi těmito geny je 6,5 kb (Braun et al., 1990). Lokalizace genu u různých živočišných druhů je uvedena v tab. 2 (Vykoukalová, 2005). Tab. 2 Lokalizace genu MYF6 u různých živočišných druhů myš 10 Bureau et al., 1995 krysa 7 Rhodes a Konieczny, 1989 skot 5 Ryan et al., Struktura, exprese a funkce proteinu Myf6 Společným znakem svalově regulačních proteinů Myf3, Myf4, Myf5 a Myf6 je vysoce konzervovaná DNA vázající a dimerizaci umožňující doména, která je složena ze skupiny zásaditých aminokyselin a helix-smyčka-helix struktury. Tyto svalově specifické HLH proteiny vytváří proteinové komplexy s všudypřítomně exprimovanými HLH proteiny E12, E2-2 a E2-5 (Braun et al., 1991) a váží se na sekvenci známou jako E-box (CANNTG) nacházející se v promotorech většiny svalověspecifických kosterních genů (Dodou et al., 2003). Většina genů kosterní svaloviny vyžaduje k aktivaci transkripce kromě MyoD rodiny také MEF2 (myocyte enhancer factor 2) rodinu transkripčních regulátorů (Dodou et al., 2003). Mezi svalově specifické geny aktivované Myf6 patří acetylcholin a alfaaktin. Myf6 se váže i k enhancerům genů MCK a TnI, ale na rozdíl od MyoD a myogeninu neaktivuje transkripci z těchto enhancerů (Yutzey et al., 1990; Vykoukalová, 2005). Exprese MYF6 je dvoufázová: první fáze začíná brzy po expresi MYF5 v myoblastech a trvá od 9. do 11,5. dne u myšího embrya. Přesná úloha první fáze není známa. Druhá fáze exprese MYF6 začíná u myší 16. den a je spojena s procesy zrání myotub a pokračuje rovněž po narození. Gen MYF6 je po narození exprimován v přibližně desetkrát vyšší míře než ostatní členové MyoD rodiny (Bober et al., 1991; Wyszynska-Koko et al., 2006)

33 Polymorfizmus v genu MYF6 Ernst et al. (1994) objevili po štěpení prasečí genomové DNA restrikční endonukleázou MspI a hybridizaci s krysí MRF4 probou tři fragmenty, dva polymorfní fragmenty 6,3 a 4,6 kb a jeden monomorfní 2,3 kb. V prasečím genu MYF6 nebyly do roku 2003 známy žádné polymorfizmy. Vykoukalová et al. (2003) identifikovali pomocí BseRI, AvaI a AcyI v intronu 1 tři jednonukleotidové polymorfizmy G C, C T a C A. Dvě mutace byly odhaleny v oblasti kódující základní doménu (Wyszynska-Koko et al., 2004) a jedna v promotorové oblasti (Wyszynska-Koko a Kury, 2004) Vztah polymorfizmu v genu MYF6 k užitkovým vlastnostem Vykoukalová (2005) sledovala u 95 prasniček plemene bílé ušlechtilé asociaci mezi genotypy polymorfních lokusů in1-c202t a in1-a48c a průměrným denním přírůstkem, výškou hřbetního tuku a obsahem libového masa a nezjistila žádné průkazné rozdíly mezi genotypy obou těchto lokusů a sledovanými znaky pro masnou užitkovost. Wyszynska-Koko et al. (2006) provedli pro polymorfizmus T C v pozici -335 promotorové oblasti a 2 jednonukleotidové polymorfizmy v oblasti kódující základní doménu asociační analýzu u souboru 660 prasat plemen Polská landrase, Polské bílé ušlechtilé a linie L990. Mutace v promotorové oblasti byla asociována s denním přírůstkem prasnic plemene Polské bílé ušlechtilé, kdy CC měla významně nižší denní přírůstek než TT a TC. U prasnic plemene Polská landrase a linie L990 nebyl zaznamenán průkazný vliv na sledované vlastnosti

34 4 MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ Metodika byla sestavena podle Vykoukalová (2005) a Knoll a Vykoukalová (2002). 4.1 Testovaná zvířata Pro optimalizaci PCR reakcí, sekvenování a ověřování polymorfizmů byla použita DNA tří různých prasat plemene bílé ušlechtilé. 4.2 Izolace DNA Genomová DNA byla izolována z krve zvířat pomocí izolačního kitu QIAamp Blood Kitu firmy Qiagen. Při izolaci byl dodržován postup dle protokolu výrobce. 4.3 PCR Polymerázová řetězová reakce byla použita pro získání dostatečného množství specifického úseku DNA, potřebného pro další analýzy. Vzhledem k tomu, že vypracování PCR metodik bylo součástí vlastní práce, postup při optimalizacích a jejich výsledky jsou uvedeny v kapitole 5. V této kapitole je uveden pouze popis použitých chemikálií a výsledné složení reakční směsi a podmínky cyklování Složení PCR reakční směsi a podmínky cyklování Použité chemikálie: PCR pufr příslušný pro LA Taq polymerázu kompletní LA Taq DNA polymeráza koncentrace 1U/µl (Top Bio, Praha, ČR) primery zásobní roztok o koncentraci 100 pmol/µl, pracovní roztok o koncentraci 10 pmol/µl (KRD, Praha, ČR) dntp mix zásobní roztok 100 mm, pracovní roztok 10 mm každý dntp (Fermentas, St.Leon-Rot, SRN) dh 2 O Konkrétní složení bylo optimalizováno pro reakční směs o objemu 25 µl a 50 µl. Výsledné složení reakčních směsí a podmínky cyklování pro amplifikaci PCR produktů určených pro další analýzy jsou uvedeny v tabulce 3. Primery použité pro amplifikaci fragmentu genu MYF6, jejich sekvence, délka, teplota tání, obsah GC a orientace, jsou uvedeny v tab

35 Tab. 3 Složení PCR reakčních směsí a podmínky cyklování pro amplifikaci PCR produktů využitých pro sekvenování PCR fragment MYF6 Velikost PCR fragmentu 379 bp Složení PCR reakční směsi o celkovém objemu 25 µl 2µl DNA, 8µl H 2 O, 15µl Master mixu (MM) složeného z 10,8µl H 2 O, 2,5µl PCR pufru P complete pro LA Taq polymerázu, 0,5µl dntp, 0,5µl MF6 2A, 0,5 µl MF6 2B, 0,2 µl LA Taq polymerázy Teplotní profil PCR Úvodní denaturace 95 C/2 min.; 30 cyklů: 95 C/20 s, 62 C/30 s, 68 C/50 s; závěrečná extenze: 68 C/7 min. Složení PCR reakční směsi o celkovém objemu 50 µl 4 µl DNA, 16 µl H 2 O, 30 µl MM složeného z 21,6 µl H 2 O, 5,0 µl PCR pufru P com pro LA Taq polymerázu, 1,0 µl dntp, 1,0 µl každý primer a 0,4 µl LA Taq polymerázy Teplotní profil PCR Úvodní denaturace 95 C/2 min.; 30 cyklů: 95 C/20 s, 64 C/30 s, 68 C/50 s; závěrečná extenze: 68 C/7 min. Složení PCR reakční směsi o celkovém objemu 50 µl 10 µl DNA, 10 µl H 2 O, 30 µl MM složeného z 21,6 µl H 2 O, 5,0 µl PCR pufru P com pro LA Taq polymerázu, 1,0 µl dntp, 1,0 µl každý primer a 0,4 µl LA Taq polymerázy Teplotní profil PCR Úvodní denaturace 95 C/2 min.; 30 cyklů: 95 C/20 s, 64 C/30 s, 68 C/50 s; závěrečná extenze: 68 C/7 min

36 Tab. 4 Dvojice primerů použitá při optimalizaci PCR u genu MYF6 a při sekvenování název sekvence (5 3 ) délka (bp) Tm ( C) % G+C orientace MF6 2A TGC TGC ACC GGC TGG ATC AG 20 61,6 65 přímý MF6 2B GCA GGA AAT CCG CAC CCT CAA 21 60,7 57,1 zpětný PCR reakční směs byla z důvodu snížení pipetovacích chyb připravována ve dvou složkách: tzv. Master mixu (MM) připravovaném dohromady pro více vzorků a směsi DNA a H 2 O připravené pro každý vzorek zvlášť. Obě složky reakční směsi byly připravovány na ledu a po smíchání ihned vloženy do termálního cykleru předehřátého na 95 C. Amplifikace byly prováděny na termálních cyklerech GeneAmp PCR Systém 2400 firmy Pelkin Elmer Elektroforetická kontrola PCR Po skončení PCR reakce byly získané produkty separovány elektroforeticky na 3% agarózovém gelu. Na přípravu agarózových gelů byla použita prášková agaróza SERVA for DNA electrophoresis (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg) a 1x TBE pufr. Do jamek bylo nanášeno 5 µl PCR produktu smíchaného s 6x nanášecím pufrem (0,25 % bromfenolová modř a 40 % sacharóza ve vodě). Pro ověření velikosti PCR produktů byl použit DNA hmotnostní marker M100 Gene Ruler TM 100 bp DNA Ladder, MBI Fermentas (tab. 5), který byl nanášen stejným způsobem jako PCR produkty, tj. 5 µl markeru smíchaného s 6x nanášecím pufrem. Elektroforéza probíhala v 1x trisborátovém elfo pufru (TBE) při napětí 4 V/cm po dobu minut. Vizualizace DNA na gelu byla provedena pomocí ethidium bromidu (EtBr) přidávaného do gelu v množství 0,5 µg/ ml. Po ukončení elektroforézy byl gel umístěn na transiluminátor a poté vyfotografován. Při vyhodnocování se zjišťovalo množství a kvalita PCR produktu

37 Tab. 5 Použitý DNA hmotnostní marker a velikost jeho fragmentů (v bp) M Sekvenování Metoda sekvenování byla použita pro detekci polymorfizmů ve zvoleném genu. Bylo prováděno oboustranné přímé sekvenování PCR produktů s využitím značených dideoxynukleotidů a automatického sekvenátoru ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Před vlastním sekvenováním bylo nezbytné PCR produkt přečistit pomocí MinElute TM PCR Purification Kitu, určit koncentraci DNA v přečištěné směsi, připravit sekvenační směs, amplifikovat templát a přečistit sekvenační směs. Postup při výpočtu koncentrace DNA v přečištěné PCR směsi a přesné složení sekvenační reakční směsi je uvedeno v kapitole Přečištění PCR směsi před přípravou sekvenační reakční směsi Přímé přečištění PCR produktu pomocí MinElute TM PCR Purification Kitu (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) 1. K 20 µl PCR produktu bylo přidáno 100 µl PB pufru a zamícháno. 2. Směs byla nanesena do MinElute kolony umístěné v 2 ml zkumavce a centrifugována 1 min/ rpm

38 3. Po vylití odpadu ze zkumavky byla do ní vrácena zpět kolona a přidáno 750 µl PE pufru a centrifugováno 1 min/ rpm. 4. Opět byl odstraněn odpad ze zkumavky a zkumavka dodatečně centrifugována 1 min/ rpm. 5. Poté byla MinElute kolona umístěna do čisté 1,5 ml zkumavky, doprostřed membrány kolony bylo naneseno 10 µl EB pufru a po 10 minutách byla zkumavka s kolonou centrifugována 1 min/ rpm Určení koncentrace DNA v přečištěné PCR směsi Koncentrace DNA v přečištěné PCR směsi byla určována na 3 % agarózovém gelu. Způsob přípravy gelu byl obdobný jako v případě elektroforetické kontroly PCR (kap ). Do jamek byly nanášeny 3 µl purifikovaného PCR produktu smíchaného s nanášecím pufrem (6x Loading Dye Solution, Fermentas) a pak 20, 10, 5, 2,5, 1,25 a 0,625 µl DNA hmotnostního markeru Gene Ruler TM 50 bp DNA Ladder (MBI Fermentas, St.Leon-Rot, SRN) (tab. 6), připraveného následujícím způsobem: 56 µl zásobního markeru (0,05µg/µl) + 4 µl 100xTE pufru + 66 µl 6x Loading Dye Solution µl voda Elektroforéza probíhala v 1x trisborátovém elfo pufru (TBE) při napětí 4 V/cm po dobu minut. Vizualizace DNA na gelu byla provedena pomocí ethidium bromidu (EtBr) přidávaného do gelu v množství 0,5 µg/ ml. Po ukončení elektroforézy byl gel umístěn na transiluminátor a poté vyfotografován. Na základě srovnání velikosti a intenzity PCR produktu s koncentrační řadou DNA hmotnostního markeru Gene Ruler TM 50 bp DNA Ladder byla určena koncentrace DNA (v ng/µl) v přečištěné PCR směsi a následně připravena sekvenační reakční směs (viz následující kapitola)

39 Tab. 6 Koncentrační řada hmotnostního markeru využívaná pro určení koncentrace DNA pro přípravu sekvenační reakce fragmenty (v bp) 2 µl Množství DNA v ng na gelu při nanášení ředěného standardu: neřeď. 20 µl 10 µl 5 µl 2,5 µl 1,25 µl 0,625 µl 0, ,5 25,75 12,875 6,4375 3, ,5 11,25 5,625 2, , ,5 8,75 4,375 2, ,5 3,75 1, ,5 6,25 3, ,5 1, ,5 3,75 1,875 0, ,5 6,25 3,125 1,5625 0, ,5 1, ,5 3,75 1,875 0,9375 0, ,5 3,75 1,875 0, ,5 1,25 0,624 marker Gene Ruler TM 50 bp DNA Ladder (MBI Fermentas) Příprava sekvenační reakční směsi a amplifikace templátu Použité chemikálie: 2,5x BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v1.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) součástí kitu je Reagent Quantity Terminator Ready Reaction Mix (reakční mix), 5x Sequencing Buffer (ředící sekvenační pufr), primer a kontrolní sekvence (templát) H 2 O sekvenační primer MF6 2A, MF6 2B, 10 pmol/µl µl složení sekvenační reakce o objemu 20 µl: templátová DNA (purifikovaný PCR produkt) + 4 µl Reagent Quantity Terminator Ready Reaction Mix + 2 µl 5x Sequencing Buffer + 0,32 µl sekvenační primer + do 20 µl H 2 O

40 Množství templátové DNA potřebného do sekvenační reakce bylo určováno v závislosti na koncentraci PCR produktu a jeho velikosti dle tab. 7. Amplifikace templátu probíhala v termálním cykleru GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) za následujících podmínek: 96 C/1 min, 25 cyklů: 96 C/ 10 s, 50 C/ 5 s, 60 C/ 4 min; 4 C/. Tab. 7 Tabulka pro určení množství templátové DNA potřebného pro přípravu 20µl sekvenační reakce velikost fragmentu (v bp) množství DNA (v ng) ,75 4,5 5,25 6 6,75 7,5 8,25 9 9,75 velikost fragmentu (v bp) množství DNA (v ng) , 5 11, ,75 13,5 14, Přečištění sekvenační reakční směsi po amplifikaci Přečištění sekvenační reakční směsi pomocí Sigma Spin TM PostReaction Clean-Up Columns (Sigma) 1. Nejprve byla uvolněna čepička kolony, poté ulomen uzávěr na spodní straně kolony, kolona byla vložena do 2 ml zkumavky a centrifugována 2 min/ 2800 rpm. 2. Po zcentrifugování byla kolona opatrně přenesena do čisté 2 ml zkumavky a na gel v koloně naneseno 20 µl sekvenační reakční směsi, která byla centrifugována 4 min/ 2800 rpm

41 3. Poté byla kolona vyhozena a přečištěná směs dále přečišťována ethanolem (viz protokol Přečištění sekvenační reakční směsi ethanolem) Přečištění sekvenační reakční směsi ethanolem µl sekvenační směsi přečištěné kolonou bylo přepipetováno do 0,75 ml zkumavky a smícháno s 16 µl H 2 O a 64 µl 96 % EtOH, vortexováno a necháno stát 15 minut při pokojové teplotě. 2. Poté byla zkumavka vložena do centrifugy, označena její orientace a centrifugována 20 min/ rpm. 3. Po odebrání supernatantu bylo do zkumavky přidáno 250 µl 70 % EtOH a zvortexováno. Poté opět centrifugováno 20 min/ rpm. 4. Po zcentrifugování byl rychle odstraněn supernatant a vzorky sušeny asi 10 min ve vakuové centrifuze při pokojové teplotě. 5. Ve 20 µl formamidu byla peleta resuspendována, denaturována 2 min. při 95 C. Pak až do doby analýzy uchovávána na ledu Analýza výsledných dat K vyhodnocení a zpracování sekvenačních dat byl použit DNA Sequencing Analysis Software verze 5.1, který je součástí softwarového vybavení automatického sekvenátoru ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Pro vyhledávání polymorfizmů byly získané sekvence porovnány pomocí programu ClustalW ( a pomocí programu Webcutter 2.0 ( byly nalezeny restrikční endonukleázy vhodné pro ověřování a testování detekovaných polymorfizmů. 4.5 PCR-RFLP Metoda PCR-RFLP byla využita k ověření nově detekovaných jednonukleotidových polymorfizmů a jejich testování. Reakční směs pro štěpení PCR produktu restrikčními endonukleázami obsahovala pufr pro restrikční endonukleázu, restrikční endonukleázu, v některých případech přídavek BSA a příslušné množství destilované vody. Přesné složení reakčních směsí je v kapitole 5. Zde je pouze uvedeno schéma, podle kterého byla v závislosti na výtěžku PCR reakce připravována reakční směs:

42 Silný PCR produkt: 5 µl PCR + 10 µl MM obsahujícího 1,5 µl pufru příslušného pro RE, 0,075 µl BSA *, 1 5 U RE, do 10 µl H 2 O Slabý výtěžek PCR: 10 µl PCR + 5 µl MM obsahujícího 1,5 µl pufru příslušného pro RE, 0,075 µl BSA *, 1 5 U RE, do 5 µl H 2 O BSA * - se přidává tehdy, pokud je to doporučeno výrobcem RE Štěpení probíhalo v termostatu předehřátém na teplotu příslušnou danému enzymu. Při použití 1 U restrikční endonukleázy (RE) probíhalo štěpení přes noc (asi 16 hodin), při použití 5 U RE asi 2 hodiny. Tab. 8 Seznam použitých restrikčních endonukleáz V prvním sloupci je uveden komerční název restrikční endonukleázy, v druhém sloupci je uveden všeobecně zavedený název poprvé popsaného enzymu (tzv. prototyp). Další RE rozeznávající stejné restrikční místo (RES) jsou uvedeny v posledním sloupci tabulky. Označení pufrů odpovídá označení výrobce. název prototyp pufr inkubační teplota ( C) RES izoschizomery výrobce RE Hin1I AhaII, AcyI G + 37 gr cgyc cygc rg AcyI, BsaHI, BstACI, Hsp92I, Msp17I MBI Fermentas Eco88I AvaI B + 37 c ycgrg grgcy c Ama87I, AvaI, BcoI, BsoBI MBI Fermentas BseRI NEB2 37 gaggag ctcctc - New England BioLabs DdeI NEB3 +BSA 37 c tnag gant c BstDEI New England BioLabs Výsledek štěpení fragmentu genu MYF6 restrikčními endonukleázami Hin1I, Eco88I, BseRI a DdeI byl ověřován elektroforeticky na 3 % agarózovém gelu vizualizovaném ethidiumbromidem

43 5 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE Cílem práce bylo detekovat polymorfizmy ve fragmentu prasečího genu MYF6 za pomoci metod PCR-RFLP a cyklického sekvenování PCR produktu s využitím značených dideoxynukleotidů a automatického čtyřkapilárového sekvenátoru ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). K tomu bylo nezbytné zpracovat metodiku a optimalizovat podmínky výše uvedených metod. Následující kapitola se právě těmito úkoly zabývá. 5.1 Optimalizace metody přímého sekvenování PCR produktu s využitím automatického sekvenátoru Příprava vzorků pro sekvenování probíhala v následujících krocích: 1. Amplifikace specifického úseku genu MYF6 metodou PCR. 2. Přímé přečištění PCR produktu pomocí MinElute PCR Purification Kitu. 3. Určení koncentrace DNA pomocí elektroforézy. 4. Příprava sekvenační směsi a amplifikace templátu. 5. Přečištění sekvenační směsi a příprava pro analýzu v automatickém sekvenátoru. 6. Analýza výsledných dat Amplifikace specifického úseku genu MYF6 metodou PCR Z krve tří prasat plemene bílé ušlechtilé byla izolována genomová DNA a pomocí dvojice specifických primerů MF6 2A a MF6 2B se podařilo amplifikovat zvolený fragment genu MYF6 o velikosti 379 bp (338 bp bez primerů), obsahující část exonů 1 a 2 a intron 1 mezi nimi. Podmínky PCR byly optimalizovány pro reakční směsi o objemu 25 µl a 50 µl a to tak, že se sledovalo, jak se projeví rozdílné složení reakční směsi a podmínky cyklování v souvislosti s kvalitou a kvantitou získaného PCR produktu. Nejprve byla namíchána reakční směs o objemu 25 µl. Ke 2 µl DNA (vzorky V61, V71 a V87) a 8 µl vody bylo přidáno 15 µl MM připraveného zvlášť na ledu smícháním vody, PCR pufru, dntp, primerů a polymerázy. Přesné složení reakční směsi a podmínky cyklování jsou uvedeny v tab. 3 (kapitola 4.3.1). Kvalita i kvantita PCR produktů vzorků V61 a V71 byla dostačující pro další analýzy, u vzorku V87 (obr. 4) však bylo nutné pro další analýzy získat větší množství PCR produktu. U tohoto vzorku byla proto provedena nová PCR reakce o větším

44 objemu (50 µl). Poměrné množství DNA v reakční směsi byl zachováno, byla pouze upravena teplota annealingu na 64 C po dobu 30 s. Všechny vzorky byly následně přečištěny pomocí MinElute PCR Purification Kitu. Ověřením výsledku purifikace na 3 % agarózovém gelu bylo zjištěno, že se množství PCR produktu V87 snížilo (obr. 6) na množství nedostatečné pro další analýzy. Z tohoto důvodu byla polymerázová řetězová reakce pro vzorek V87 ještě jedenkrát opakována. Množství genomové DNA bylo zvýšeno na 10 µl pro objem 50 µl reakční směsi. Podmínky cyklování zůstaly stejné (kapitola 4.3.1). Výsledek PCR reakce byl opět elektroforeticky ověřován na 3 % agarózovém gelu (obr. 5). Tento PCR produkt byl již používán pro následující analýzy bp 400 bp Obr. 4 Výsledný produkt amplifikace fragmentu prasečího genu MYF6 o velikosti 379 bp V61, V71, V87 amplifikované PCR produkty M100: DNA hmotnostní marker M100 Gene Ruler TM 100 bp DNA Ladder, MBI Fermentas

45 Obr. 5 Výsledný produkt amplifikace fragmentu prasečího genu MYF6 V87 amplifikovaný PCR produkt M100: DNA hmotnostní marker M100 Gene Ruler TM 100 bp DNA Ladder, MBI Fermentas Přímé přečištění PCR produktu pomocí MinElute PCR Purification Kitu Přečištění PCR produktů V61, V71 a V87 před přípravou vlastní sekvenační směsi pro sekvenování bylo prováděno z důvodu odstranění složek PCR reakce, které by mohly měnit podmínky sekvenační reakce nebo ji inhibovat (nespecifické produkty, volné primery nebo dimery primerů, dntp, soli). Jelikož se podmínky PCR reakce podařilo optimalizovat tak, že vznikal pouze specifický produkt (specifický PCR fragment), stačilo přímé přečištění PCR produktu pomocí kitu MinElute PCR Purification (QIAGEN). V opačném případě by bylo nutné nejprve získat specifický PCR fragment extrakcí z gelu a teprve poté provést přečištění Určení koncentrace DNA Koncentrace DNA v přečištěné PCR směsi byla určována elektroforeticky na 3% agarózovém gelu obarveném ethidium bromidem srovnáním velikosti a intenzity PCR produktů V61, V71 (obr. 6) a V87 (obr. 7) s koncentrační řadou hmotnostního markeru se známou koncentrací DNA v jednotlivých fragmentech (tab. 7, kapitola 4.4.3). Po zjištění koncentrace DNA v ng/µl v příslušných PCR produktech, bylo vypočítáno množství templátové DNA potřebné na sekvenační reakční směs (tab. 9)

46 1031 bp 400 bp Obr. 6 Srovnání PCR produktů s koncentrační řadou hmotnostního markeru V61, V71, V87 tři různé vzorky prasečí DNA přečištěné metodou přímého čištění PCR 20 µl 1,25 µl množství ředěného hmotnostního markeru Gene Ruler łm 50 bp DNA Ladder (MBI Fermentas): 1031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100, 50 bp Obr. 7 Srovnání PCR produktu V87 s koncentrační řadou hmotnostního markeru V87 vzorek prasečí DNA přečištěný metodou přímého čištění PCR 20 µl 0,625 µl množství ředěného hmotnostního markeru Gene Ruler 50 bp DNA Ladder (MBI Fermentas): 1031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100, 50 bp

47 Tab. 9 Množství templátové DNA v ng/µl potřebného do sekvenační reakční směsi Vzorek DNA velikost fragmentu intenzita bandu na koncentrace v na sekvenační směs (v bp) gelu 3 µl 1 µl ng µl 1 V ng 13,3 ng 5,5 0,4 2 V ng 26,7 ng 5,5 0,2 3 V ,25 5 ng 1,67 ng 5, Příprava sekvenační směsi a amplifikace templátu Po určení koncentrace DNA v přečištěných PCR produktech a určení množství templátové DNA potřebné do sekvenační směsi byly namíchány sekvenační reakční směsi. Vzhledem k tomu, že bylo prováděno oboustranné sekvenování vzorků, bylo nutné připravit pro každý vzorek dvě sekvenační reakce, jednu s přímým primerem a druhou s primerem zpětným. Přesné složení sekvenační reakční směsi pro všechny tři vzorky prasečí DNA je uvedeno v tab. 10. Tab. 10 Přesné složení sekvenačních reakčních směsí o objemu 20µl složení sekvenační reakční směsi o objemu 20 µl voda reakční mix sekvenační templátová pufr DNA sekvenační primer 13,28 µl 4 µl 2 µl 0,4 µl V61 0,32 µl MF6 2A 13,28 µl 4 µl 2 µl 0,4 µl V61 0,32 µl MF6 2B 13,48 µl 4 µl 2 µl 0,2 µl V71 0,32 µl MF6 2A 13,48 µl 4 µl 2 µl 0,2 µl V71 0,32 µl MF6 2B 11,68 µl 4 µl 2 µl 2 µl V87 0,32 µl MF6 2A 11,68 µl 4 µl 2 µl 2 µl V87 0,32 µl MF6 2B Amplifikace templátové DNA byla prováděna v termálním cykleru GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) za podmínek uvedených v kapitole Materiál a metody zpracování (4.4.3)

48 5.1.5 Přečištění sekvenační směsi a příprava pro analýzu v automatickém sekvenátoru K odstranění volných terminátorů, které po skončení amplifikace zůstávají v reakci, byly provedeny u každého vzorku dvě metody: přečištění sekvenační reakční směsi pomocí Sigma Spin TM PostReaction Clean-Up Columns a přesrážení ethanolem. Přítomnost volných terminátorů ve směsi znehodnocuje výsledek sekvenování, projevuje se jako vysoké píky na začátku sekvence. V tomto místě pak nelze odečíst správná sekvence. Dodržován byl postup dle protokolu výrobce, který je uveden v kapitole Materiál a metody zpracování. Purifikované vzorky byly následně analyzovány na automatickém sekvenátoru ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer Analýza výsledných dat K vyhodnocení a zpracování sekvenačních dat byl použit DNA Sequencing Analysis Software verze 5.1, který je součástí softwarového vybavení automatického sekvenátoru ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer. Výsledkem je jednak grafické znázornění sekvence (příloha 1), jednak sekvence ve formě textu. Oba výstupy jsou uloženy ve dvou samostatných souborech. Vzhledem k tomu, že tento software umožňuje v grafickém výstupu jen některé manuální úpravy sekvence, bylo nutné nejprve ověřit správnost sekvence v grafickém souboru a potřebné úpravy provést v textovém souboru. Opravené sekvence byly následně použity pro detekci polymorfizmů Detekce polymorfizmů v genu MYF6 Sekvenován byl fragment genu MYF6 o velikosti 379 bp, který podle Vykoukalové (2005) obsahuje část exonů 1 a 2 a intron 1 mezi nimi. Získané sekvence byly srovnány pomocí programu ClustalW ( a v sekvenci bylo detekováno pět jednonukleotidových polymorfizmů: A/C v pozici 48 intronu 1 (in1-a48c), C/G v pozici 81 intronu 1 (in1-c81g), A/G v pozici 112 intronu 1 (in1-a112g), T/C v pozici 124 intronu 1 (in1-t124c) a T/C v pozici 202 intronu 1 (in1-t202c) (příloha 1). Pomocí programu Webcutter 2.0 ( pak byly vyhledány příslušné restrikční endonukleázy (RE) vhodné pro ověření a následné testování těchto polymorfizmů (tab. 11) metodou PCR-RFLP

49 Tab. 11 Detekované jednonukleotidové polymorfizmy (SNP) ve fragmentu prasečího genu MYF6 Označení lokusu SNP ve fragmentu genu MYF6 in1-a48c in1-c81g in1-a112g in1-t124c in1-t202c pozice v sekvenci PCR produktu pozice v intronu 1 restrikční endonukleázy možné pro ověření polymorfizmu Hin1I, AspS9I, BsaHI, AsuI, BbiII, Acyl, BseRI, Cfr13I, - - Hsp92I, Mn1I Sau96I, Msp17I, BsaJI, HgaI, CviJI BseDI Polymorfizmus A/C v pozici 48 intronu 1 byl ověřován pomocí restrikční endonukleázy Hin1I. Alela A, která postrádá polymorfní restrikční místo (RES), je po štěpení tímto enzymem charakterizována dvěma fragmenty 288 a 91 bp. U alely C obsahující polymorfní RES je PCR produkt štěpen na kratší fragmenty 252, 91 a 36 bp. Na základě výsledků štěpení (obr. 9) lze konstatovat, že jedinec V61 je v tomto lokusu homozygot AA, neboť po štěpení PCR produktu vznikly fragmenty o velikosti 288 a 91 bp. Jedinec V71 je heterozygotního genotypu AC a jedinec V87 je homozygotního genotypu CC, neboť štěpením PCR produktu vznikly fragmenty o velikosti 252, 91 a 36 bp. Pro ověření polymorfizmu C/G v pozici 81 intronu 1 byl použit restrikční enzym BseRI. U heterozygotního genotypu CG byly očekávány fragmenty o délce 379, 216 a 163 bp, u homozygotního genotypu CC kratší fragmenty 216 a 163 bp a u homozygota GG neštěpený fragment o velikosti 379 bp. Z obr. 9 je vidět, že vzorek V61 je homozygot CC. Vzorek V71 byl ve sledovaném lokusu heterozygotního genotypu CG, po štěpení PCR produktu vznikly fragmenty o délce 379, 216 a 163 bp. Vzorek V87 je genotypu GG, neboť PCR produkt zůstal neštěpen

50 Poslední polymorfizmus, pro jehož ověření se podařilo nalézt restrikční endonukleázy, byl T/C v pozici 202 intronu 1. Byl ověřován dvěmi restrikčními endonukleázami AvaI a DdeI, obě se projevily jako vhodné pro testování tohoto polymorfizmu. Polymorfizmus AvaI zahrnuje dvě alely, označované jako T (neštěpený fragment 379 bp) a C (obsahuje restrikční místo, fragment 379 bp je štěpen na fragmenty 280 a 99 bp). PCR produkt o velikosti 379 bp štěpený restrikčním enzymem DdeI je u heterozygotního genotypu charakterizován přítomností 379, 281 a 98 bp, u homozygotního 281 a 98 bp nebo 379 bp. Oba enzymy potvrdili, že vzorky V61 a V87 jsou v daném lokusu homozygotního genotypu a vzorek V71 heterozygotem. Pro polymorfizmy A/G v pozici 112 intronu 1 a T/C v pozici 124 intronu 1 se sice podařilo nalézt restrikční endonukleázu (FauI), ale vzhledem k tomu, že je pro oba polymorfizmy stejná, není možné ji pro jejich ověření použít. Jelikož vzorky V61 a V87 jsou ve všech sledovaných lokusech homozygoti a vzorek V71 je ve všech lokusech heterozygot, lze říci, že se u těchto vzorků vyskytují jen dvě kombinace alel jednotlivých lokusů (tzv. haplotypy), tj. A-C-T a C-G-C (při pořadí lokusů in1-a48c in1-c81g in1-t202c). Použité restrikční endonukleázy včetně restrikčního místa a velikosti alel jsou shrnuty v tab. 12. Výsledek štěpení byl poté ověřován elektroforeticky na 3 % agarózovém gelu (obr. 9). Tab. 12 Velikosti alel po štěpení PCR produktu o velikosti 379 bp restrikčními endonukleázami Hin1I, BseRI, AvaI a DdeI Polymorfizmus označení lokusu restrikční enzym sekvence restrikčního místa A/C in1-a48c Hin1I gr/cgyc velikosti alel v bp po štěpení PCR produktu C má polymorfní RES, vzniknou fragmenty 91, 36 a 252 bp A nemá polymorfní RES, vzniknou fragmenty 91 a 288 bp

51 C/G in1-c81g BseRI gaggag DdeI c/tnag T/C in1-t202c AvaI c/ycgrg C má polymorfní RES, vzniknou fragmenty 163 a 216 bp G nemá polymorfní RES, neštěpený fragment 379 bp T má polymorfní RES, fragmenty 281 a 98 bp C nemá polymorfní RES, fragment 379 bp T nemá polymorfní RES, fragment 379 bp C má polymorfní RES, fragmenty 280 a 99 bp Obr. 8 Genotypy prasečího genu MYF6 po štěpení 379 bp PCR produktu restrikčními enzymy Hin1I, BseRI, AvaI a DdeI PCR PCR produkt o velikosti 379 bp M8 marker V61, V71, V87 PCR produkty