Stanovení hladiny tyrosinkinasových inhibitorů pomocí UHPLC-MS/MS

Transkript

1 Stanovení hladiny tyrosinkinasových inhibitorů pomocí UPLC-MS/MS Kateřina Mičová a, David riedecký a, Adriana Polýnková a, Edgar aber b a Tomáš Adam a a Laboratoř dědičných metabolických poruch, Lékařská fakulta, Univerzita Palackého v lomouci b emato-onkologická klinika, akultní nemocnice lomouc K.Micova@seznam.cz Úvod Díky novým poznatkům v biologii a patofyziologii u některých onemocnění byla v poslední době vyvinuta řada léků působících přímo na molekulární úrovni. K těmto lékům se řadí také inhibitory tyrosinkinas (TKI), které způsobily průlom v léčbě některých nádorových onemocnění, jako například lapatinib (Tykerb) v léčbě karcinomu prsu, imatinib (Glivec) v léčbě gastrointestinálního stromálního tumoru (GIST) a společně s dasatinibem (Sprycel) a nilotinibem (Tasigna) zaznamenal velký úspěch v léčbě chronické myeloidní leukemie (CML) (br. 1). Práce byla zaměřena na stanovení TKI v krevní plasmě pacientů s CML a karcinonem prsu na terapii Glivecem, Tasignou, Sprycelem a Tykerbem metodou vysoce účinné kapalinové chromatografie s detekcí tandemovou hmotnostní spektrometrií. Plasma byla deproteinována methanolem s přídavkem interního standardu, zcentrifugována a supernatant byl následně analyzován. Separační pufr byl složen z acetonitrilu s přídavkem formiátu amonného. Separace byla provedena na koloně s reverzní fází a jako detektor sloužil tandemový hmotnostní spektrometr s trojitým kvadrupólem. ově vyvinutá metoda pro stanovení TKI v krevní plasmě pomocí UPLC-MS/MS je vysoce účinná a časově nenáročná. Karcinom prsu Karcinom prsu je jedním z nejčastějších zhoubných onemocnění poskytující ženskou část populace. Jeho incidence neustále stoupá, ovšem příznivou zprávou je pokles úmrtí způsobených tímto onemocněním zaznamenaný ve vyspělých zemích včetně ČR a to díky novým diagnostickým a terapeutickým možnostem. Pro cílenou molekulární biologickou léčbu je nutná přesná identifikace terčové struktury molekuly. Dochází k narušení základních signálních drah vedoucích k maligní transformaci buňky. Tento typ léčby již není pouze předmětem výzkumu, ale je již s úspěchem používán v klinické praxi. Základními nástroji terapie jsou monoklonální protilátky a nízkomolekulární tyrosinkinasové inhibitory, jako např. lapatinib. 1

2 Lapatinib je selektivní duální inhibitor tyrosinkinas ErbB-1 (EGR; je zodpovědný za regulaci normálního buněčného růstu, jeho porucha vede k neregulovatelné proliferaci a potenciální malignizaci procesu) a ErbB-2 (ER2; onkogen zaručující predispozici ke karcinomu, je pomalu aktivovatelný a má dlouhodobý vliv na proliferaci). Řadí se mezi cytostatika a jako jediný dokáže procházet hematoencefalitickou bariérou, tudíž je účinný i v léčbě mozkových metastáz. Chronická myeloidní leukemie CML je klonální myeloproliferativní onemocnění vznikající transformací hemopoetické kmenové buňky. Toto onemocnění tvoří 25 % leukemií dospělého věku. úzí genu BCR na 22. chromosomu s genem ABL na 9. chromosomu vzniká onkogen BCR/ABL nacházející se na nově vzniklém tzv. iladelfském chromosomu. Gen BCR/ABL exprimuje protein o hmotnosti 210 kd; je to konstitutivně aktivní tyrosinkinasa aktivující řadu signálních transdukčních drah, které podporují množení buněk a blokují apoptózu. Dřívější možnosti léčby nezaznamenávaly takový úspěch jako v posledních letech nově vyvinuté selektivní inhibitory tyrosinkinas zamezující maligní růst buněk a utváření metastází. K těmto novým přípravkům řadíme deriváty 2-fenylaminopyrimidinu imatinib, dasatinib a nilotinib. Imatinib a nilotinib jsou účinné inhibitory nejen proti kinase Bcr/Abl, ale i proti tyrosinkinase receptoru pro SC a PDG, proto se jich využívá nejen v léčbě CML, ale také gastrointestinálního stromálního tumoru, systémové mastocytosy, hypereozinofilního syndromu a chronické eozinofilní leukemie. Dasatinib je navíc účinný inhibitor kinas rodiny Src (SK), kam řadíme kinasy Lck, yn, ck, Lyn a Src. Předchozí studie prokázaly, že četné domény BCR/ABL interagují s aktivovanými Src kinasami nezávisle na BCR/ABL kinasové aktivitě. Src kinasy mohou přispívat k proliferaci a přežívání myeloidní řady buněk exprimujících BCR/ABL. C 3 Imatinib C 3 Dasatinib S C 3 3 C Cl C 3 C 3 Cl Lapatinib ilotinib 3 C S br. 1: Molekuly TKI 2

3 Mechanismus účinku TKI spočívá v reverzibilní vazbě na intracelulární cytoplasmatické ATPvazebné místo tyrosinkinasové Abl domény a zablokování fosforylace tyrosinu bílkovin, které patří k substrátům onkoproteinů, čímž dochází ke znemožnění přenosu signálů vedoucích k maligní transformaci a proliferaci buněk. Experimentální část Metoda byla původně validována pro stanovení imatinibu, později byla použita i pro stanovení ostatních TKI. Plasma byla získána z hemato-onkologického oddělení lomouc. Pacientům s CML byla odebrána nesrážlivá krev do zkumavek s EDTA v průměru 24 hodin po užití poslední dávky léku. Krev byla poté zcentrifugována a získaná plasma byla zamražena na -20 C. Imatinib obdržený od firmy ovartis (Curych, Švýcarsko) byl rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (DMS) a deionizované vodě (18,3 MΏ/cm) na výslednou koncentraci 10-3 mol/l. Tento standardní roztok byl použit pro přípravu všech ostatních standardů. Všechny reagencie měly analytický stupeň čistoty a byly získány od firmy Sigma (St. Louis, M, USA). Příprava vzorku spočívala v deproteinaci 20 µl plasmy pomocí 180 µl methanolu s přídavkem interního standardu deuterovaného imatinibu (D8IMA). Poté byl vzorek 3 minuty třepán na vortexu a následně 5 minut centrifugován při RPM. Supernatant byl analyzován pomocí techniky UPLC-MS/MS. Separace probíhala na přístroji UPLC (Dionex Ultima 3000 RS) za použití kolony s reverzní fází ACQUITY UPLC BE C µm (2,1 x 50 mm; Waters). Mobilní fáze se skládala z formiátu amonného o koncentraci 4 mmol/l a p 3,2 (A) a acetonitrilu (B). Počáteční složení mobilní fáze bylo nastaveno na 17 % B, minutu po nástřiku bylo během jedné minuty zvýšeno množství acetonitrilu na 50 % a drženo po dobu 0,1 min, poté byl systém opět nastaven na počáteční podmínky. Celková doba analýzy byla 2,2 min při průtokové rychlosti 0,5 ml/min. Kolona byla termostatována na 40 C. Pro detekci byl použit tandemový hmotnostní spektrometr trojitý kvadrupól (API 4000, Applied Biosystems) s ionizací elektrosprejem. Přístroj pracoval v MRM (multiple reaction monitoring) módu, kdy pro imatinib byl zvolen přechod m/z , D8IMA , desima a pro lapatinib. Metoda je vhodná pro stanovení i jiných inhibitorů tyrosinkinas (TKI), jako například nilotinibu používaného rovněž pro léčbu CML a lapatinibu pro léčbu karcinomu prsu (br. 2). 3

4 Imatinib 494=>394 D8-Imatinib 502=>394 de-imatinib 480 =>394 ilotinib 531=>290 Lapatinib 582=> br. 2: Separace jednotlivých TKI. Výsledky Metoda byla aplikována na vzorky pacientů s CML a karcinomem prsu na terapii Glivecem, Tasignou a Tykerbem. Retenční čas imatinibu byl v 1,61 min. Během analýz byly sledovány intenzity odezvy v závislosti na koncentraci léku v krvi (br. 3), kvantifikace probíhala pomocí interního standardu. IM ISTD (D8-IMA) dima br. 3: Aplikace metody na reálné vzorky pacientů Další součástí práce bylo sledování korelace mezi plasmatickou hladinou imatinibu a molekulární odpovědi. Bylo zpracováno 600 vzorků od 120 pacientů, jimž byla krev odebírána v průměru 24±6 hodin od poslední podané dávky (br. 4). 4

5 E D br. 4: Při optimální molekulární odpovědi (D) je medián roven 1010 ng/ml, přičemž plasmatická hladina IM se pohybuje v rozmezí ng/ml. U nízké molekulové odpovědi (E) je medián roven 785 ng/ml a pohybuje se v rozmezí ng/ml. Závěr: Tato práce byla zaměřena na vývoj nové metody pro stanovení TKI v krevní plasmě pacientů trpících chronickou myeloidní leukemií a rakovinou prsu, a to pomocí techniky vysoce účinné kapalinové chromatografie s detekcí tandemovou hmotnostní spektrometrií. Metoda se v současné době dostává do rutinní praxe v laboratoři dědičných metabolických poruch, ddělení klinické biochemie, lomouc. Další výzkum bude směřován do oblasti stanovení imatinibu v leukocytech pacientů s CML. Předpokládá se, že stanovení hladiny intracelulárního IM a v kombinaci se stanovením plasmatické hladiny při současném vyšetření aktivity transportních systémů umožní lépe předpovědět vznik rezistence na IM a bude mít lepší praktický dopad na rozhodování o léčbě u nemocných s CML léčených IM. Tento projekt je podporován granty IGA MZCR S9627 and MSM Literatura: o aber E. (2005) Imatinib. armakoterapie 3, o aderl S., Talpaz M., Estrov Z., Kantarjian.M. (1999) Chronic myelogenous leukemia: Biology and therapy. Ann Intern Med. 131, o aouala A., Zanolari B., Rochat B., Montemurro M., Zaman K., Duchosal M.A., Ris.B., Leyvraz S., Widmer., Decosterd L.A. (2009) Therapeutic Drug Monitoring of the new targeted anticancer agents imatinib, nilotinib, dasatinib, sunitinib, sorafenib and lapatinib by LC tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B 877, o Kantarjian.M., Giles., Gattermann., Bhalla K., Alimena G., Palandri., ssenkoppele G.J., icolini.e., Brien S.G., Litzow M., Bhatia R., Cervantes., aque A., Shou Y., Resta D.J., Weitzman A., ochhaus A., le Coutre P. (2007) ilotinib (formerly AM107), a 5

6 highly selective BCR_ABL tyrosine kinase inhibitor, is effective in patients with Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia in chrinic phase following imatinib resistance and intolerance. Blood 110; o Kantarjian.M., Talpaz M., Giles., Brien S., Cortes J. (2006) ew insight into the pathophysiology of chronic myeloid leukemia and imatinib resistence. Ann Intern Med. 145, o Petráková K., Demlová R. (2008) Lapatinib. Remedia 18, o Quintas-Cardama A., Kantarjian., Jones D., icaise C., 'Brien S., Giles., Talpaz M. and Cortes J. (2007) Dasatinib (BMS ) is active in Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia after imatinib and nilotinib (AM107) therapy failure. Blood, 109, o Titier K., Picard S., Ducint D., Teilhet E., Moore., Berthaud P., Mahon.X. and Molimard M. (2005) Quantification of Imatinib in uman Plasma by igh-performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry. Ther Drug Monit. 27,