Svět RNA a bílkovin. Transport a stabilita RNA. Transport a stabilita RNA. TRANSPORT A STABILITA mrna. Úrovně regulace genové exprese eukaryot

Transkript

1 Úrovně regulace genové exprese eukaryot Svět RNA a bílkovin TRANSPORT A STABILITA mrna Transport a stabilita RNA Transport a stabilita RNA hnrnp/mrnp Jaderný export Jaderné póry Transport komplexem jaderného póru Export RNA Stabilita RNA Degradační dráhy Motivy ovlivňující stabilitu RNA Umlčování genů hnrnp/mrnp Jaderný export Jaderné póry Transport komplexem jaderného póru Export RNA Stabilita RNA Degradační dráhy Motivy ovlivňující stabilitu RNA Umlčování genů 1

2 Heterogenní jaderné RNP (hnrnp) Heterogenní skupina RNA-vazebných bílkovin často asociovaných s chromatinem Původně 6 ( jádro ), dnes cca 30 polypeptidů (není konečné) Společné vlastnosti: přítomnost RNA-vazebného motivu rozličné doplňkové domény neobvyklé rozložení aminokyselin interakce protein-protein množství isoforem alternativní sestřih posttranslační modifikace hnrnp komplexní a dynamická struktura velká množina bílkovin vážících se k nascentnímu transkriptu Motiv RNP motiv ARM Arginine-rich motif RGG box KH motiv K-homology motif DSRM dsrnabinding motif RNA vazebné motivy v RBP Modulární struktura RNA-vazebných bílkovin Délka (aa) ~ RNP1 + RNP2 8aa 6aa ~ ~ ~ 50 ~ Konsensus K /RG F /Y G /AFVX F /Y L /I F /Y V /I G /K N /G L /M Aromatické a alifatické aa Arg-rich RGG repetice IGXXGXXI hydrofobní aa, nepravidelně Struktura βαββαβ variabilní β spirála, doplňkový motiv βααββα αββα RBP hnrnp PABP snrnp U1A HIV Rev HIV Tat hnrnp U nucleolin Mer-1 (kvasinky) rp S3 hnrnp K Drosophila Staufen DAI kinasa Vaccinia virus E3L Funkce biogeneze mrna translace, stabilita sestřih export HIV mrna transkripce biogeneze mrna biogeneze rrna alternativní sestřih translace biogeneze mrna vývojová regulace regulace translace regulace translace hnrnp A1/A1* RNA-vazebné motivy 2 x RBD, RGG Předpokládaná funkce sestřih, polyadenylace, transport mrna, biogeneze telomer Export mrna z jádra A2/B1 2 x RBD, RGG sestřih, transport mrna C1/C2 1 x RBD balení transkriptu, sestřih, stabilita mrna D1/D2 2 x RBD, RGG transkripce, rekombinace, turnover mrna E1/E2 3 x KH translační regulace (silencing), stabilita mrna F 3 x RBD sestřih (intronový zesilovač), interakce s CBP G 1 x RBD, RGG H 3 x RBD sestřih (intronový zesilovač) H 3 x RBD polyadenylace I (PTB) 4 x RBD sestřih (intronový zesilovač/represor), polyadenylace K 3 x KH, RGG transkripce, translační regulace (silencing) L 4 x RBD stabilita mrna, export mrna M P2 R 3 x RBD 1 x RBD, RGG 3 x RBD, RGG sestřih, odpověď na tepelný šok onkogenese Bílkoviny hnrnp komplexu U 1 x RBD HAP/SAF-B 1 x RBD transkripce, modelování chromatinu, odpověď na tepelný šok A0 CUG-BP 2 x RBD, RGG 3 x RBD sestřih sestřih (intronový zesilovač), translace Jaderný pór strukturovaná a přesně definovaná cesta pro bílkoviny a RNA HuR 3 x RBD stabilita mrna, transport mrna 2

3 Transport a stabilita RNA hnrnp/mrnp Jaderný export Jaderné póry Transport komplexem jaderného póru Export RNA Stabilita RNA Degradační dráhy Motivy ovlivňující stabilitu RNA Umlčování genů Jaderná lamina vnitřní kostra jaderných obalů interakce (komunikace) INM a chromatinu Komplex jaderného póru (NPC) multiproteinový kanál transport / jádro Jaderný obal Vnější jaderná membrána (ONM) jeden kompartment s ER asociované ribosomy Vnitřní jaderná membrána (INM) kontakt s chromatinem jaderná lamina Komplex jaderného póru - nuclear pore complex Hustota pórů na povrchu jádra oocytu Xenopus laevis Komplex jaderného póru Celý komplex průměr 120 nm Průměr kanálu 9 nm v klidu 26 nm v aktivním stavu Centrální kanál uzavřený mezi několika prstenci Centrální transportér jaderných pórů na jednom jádře Obratlovci (Xenopus) 125 MDa (30 x velikost ribosomu); odhad: původně bílkovin, dnes cca Kvasinky 50 MDa (základní struktura); bílkovin Čtyři prstence spojené paprsky Jaderný košík Komplexy fibril Proximální filamenta Cytoplasmatická filamenta 3

4 Komplex jaderného póru Bílkoviny jaderného póru Nukleoporiny (Nup) Obratlovci Odhad 100/40 bílkovin Charakterizováno Kvasinky Odhad bílkovin Char. téměř všechny FEISEM, Rekonstituce NPC in vitro (Goldberg et al. 1996, 1997) Repetitivní sekvence FXFG, GLFG, FG Obecný znak mnoha nukleoporinů Nup153, Tpr, Nup159p, Nup116p, Nup100p, Nsp1p, Nup53p Neslouží lokalizaci Regulační úloha při transportu Interakce s transportními faktory (importiny α i β, RanGTPasa) Bílkoviny jaderného póru Komunikace NPC s okolím Kontinuita buněčného skeletu Nukleoporiny (Nup) interakce cytoplasmatických filament s cytoskeletem interakce vnitřních filament s laminou interakce jaderného koše s filamentózními bílkovinami v jádře (nukleoskelet?) NPC dynamická struktura stacionární nukleoporiny kostra struktury komplexu mobilní nukleoporiny transport nákladu pohyb mezi jádrem a cytoplasmou Nukleoporiny integrální membránové bílkoviny rozpustné bílkoviny Teorie: Filamentní struktury NPC představují fyzickou spojku mezi cytoskeletální sítí v cytoplasmě a nukleoskeletálními strukturami v jádře a tvoří tak třetí složku komplexní sítě buněčného skeletu 4

5 Transport a stabilita RNA Transport jaderným pórem hnrnp/mrnp Jaderný export Jaderné póry Transport komplexem jaderného póru Export RNA Stabilita RNA Degradační dráhy Motivy ovlivňující stabilitu RNA Umlčování genů Komplexní proces Celá řada nezávislých mechanismů Difuse (metabolity) Aktivní transport (včetně RNP, ribosomální podjednotek či částic Balbianiho prstenců) - Horizontální transport v membráně (integrální membránové bílkoviny) Pasivní difuse Faktory koncentrační spád vzdálenost přenosu (200 nm) vlastnosti přenášených látek Teoreticky až do průměru 9 nm / Mw kda Malé molekuly BSA (68 kda, Ø 7 nm) metabolity difuse extrémně pomalá menší bílkoviny Ovalbumin (46 kda, Ø 6 nm) difuse velmi pomalá Prakticky jen do průměru 4-5 nm / Mw kda Histony (20-30 kda) a trna transportovány pomocí přenašečů? kontrola množství přenesených molekul? Aktivní transport látek komplexem jaderného póru 1982: Nukleoplasmin (Xenopus laevis) pentamerický jaderný protein jádro (resistentní vůči proteasám) a ocásek (citlivý vůči proteasám) mikroinjekce -> rychlá akumulace v buněčném jádře samotné jádro: mikroinjekce -> pentamer, akumulace v cytoplasmě samotný ocásek: mikroinjekce -> rychlá akumulace v buněčném jádře ocásek jaderný lokalizační signál (NLS) Jednotlivé molekuly Makromolekulární komplexy (i 1000x větší než při difusi) ribosomální podjednotky (1.4 a 2.8 MDa, 40S a 60S) ribonukleové částice (mrnp, snrnp) mrnp komplexy Balbianiho prstenců (> 10 MDa, 75S, Ø až 50 nm) 5

6 Jaderný lokalizační signál Aktivní transport látek komplexem jaderného póru Receptory importní (NLS) receptor Teorie: posun transportovaných komplexů po sérii po sobě importiny (Impα) (karyopherin α) následujících vazebných míst; exportní (NES) receptor Serial-binding complexes exportiny přenašečový receptor nadrodina importinu β (karyopherin β) systém RanGTPasy (RanGTPasa, NTF2 (nuclear transport factor2)) 24 kda 15 kda, homodimer, import receptor pro Ran pyruvát kinasa NLS::pyruvát kinasa Jednotlivé molekuly Makromolekulární komplexy (i 1000x větší než při difusi) ribosomální podjednotky (1.4 a 2.8 MDa, 40S a 60S) ribonukleové částice (mrnp, snrnp) mrnp komplexy Balbianiho prstenců (> 10 MDa, 75S, Ø až 50 nm) Kalderon et al. (1984) Cell 39: 499 Import přes NPC Export přes NPC Rozpoznání NLS nákladu importinem α Přenos Impα a nákladu do jádra prostřednictvím importinu β Disociace nákladu od importinu α Navázání Ran-GTP a CAS k importinu α Recyklace importinu α do cytoplasmy Hydrolýza Ran-GTP -> Ran-GDP Disociace Ran-GDP a CAS od importinu α Recyklace RanGTP Recyklace importinů αa β Rozpoznání NES nákladu exportinem Tvorba trimerického komplexu exportinu a nákladu s Ran-GTP Přenos nákladu do cytoplasmy Hydrolýza Ran-GTP -> Ran-GDP Disociace nákladu a Ran-GDP od exportinu Recyklace exportinu do jádra prostřednictvím Impβ Recyklace RanGTP Recyklace exportinu 6

7 RanGTPasový cyklus Přenos Ran-GTP v komplexu s importinem αči exportinem do cytoplasmy Navázání RanBP1 Hydrolýza GTP -> GDP zprostředkovaná RanGAP Disociace Ran-GDP od TR Navázání Ran-GDP k NTF2 Recyklace Ran-GDP do jádra Disociace Ran-GDP od NTF2 Ran GDP/GTP exchange prostřednictvím RanGEF (RCC1) Transportní cykly importinů a exportinů v koordinaci s RanGTPasovým systémem (cyklem) Ran může také pasivně difundovat neúčinné Importinový cyklus Importinový cyklus - VIDEO Allen video na URL článku Recyklace importinů αi β 7

8 RanGTPasový cyklus Netradiční formy jaderného transportu a) Import nezávislý na Ran cyklin B1-CDC2 / Impβ přímá interakce nákladu s Impβ RanGTP není potřeba pro žádný krok RanGTPasový cyklus - VIDEO Allen video na URL článku b) Jeden receptor pro import i export Msn5 (kvasinky, homolog Impβ) export Pho4 a Mig1 (TF) a Far1 (CDK inhibitor) import Rpa komplexu (DNA repair) jeden receptor import a export různých bílkovin různé domény rozpoznávané různými náklady c) Transportní receptory mimo nadrodinu Impβ kalretikulin (CRT) popsaný jako Ca-vazebný protein asociovaný s ER CRT-specifické náklady export glukokortiokoid receptoru přímá interakce s nákladem; RanGTP systém: přenos ve formě trimeru CRT/RanGTP/náklad Transport a stabilita RNA Export různých typů RNA z jádra hnrnp/mrnp Jaderný export Jaderné póry Transport komplexem jaderného póru Export RNA Stabilita RNA Degradační dráhy Motivy ovlivňující stabilitu RNA Umlčování genů 8

9 Export trna Klasická Impβ dráha s přímou vazbou receptoru k nákladu Export mrna z jádra Hlavní exportní dráha nezávislá na systému RanGTP Účast transportních receptorů mimo nadrodinu Impβ První popsaná exportní dráha zprostředkovaná saturovatelným přenašečem mrna exporter Exportin-t (Xpo-t) homolog Imp β, RanGTP vazebná bílkovina váže přímo trna, ne bílkovinný faktor vazba k trna v přítomnosti RanGTP vazba jen ke zralé trna Malé molekuly -> trna může pasivně difundovat -> VELMI malá účinnost Zrání trna odštěpení 3 a 5 -konců přidání CCA na 3 -konec modifikace bazí sestřih (není monitorován) heterodimer Malá podjednotka Homolog NTF2 Transport Velká podjednotka M+C transport N+M vazba k RNA a RNP bílkovinám Export mrnp z jádra Propojení exportu mrna se sestřihem Slinné žlázy larev Chironomus tentans Hlavní exportní dráha nezávislá na systému RanGTP Obrovská mrna ~ 75 kb, > 10 MDa, Ø 50 nm Obratlovci Hlavní zúčastněné bílkoviny: Kvasinky Tap P15/NXT mrna exporter Mex67 Mtr2 Aly/Ref EJC UAP56 interakce se sestřihovým aparátem Yra EJC Sub2 Účast transportních receptorů mimo nadrodinu Impβ 9

10 Alternativní dráhy transportu mrna Alternativní dráhy transportu mrna mrna obsahující ARE (adenosine/uridine-rich elements) v 3 -UTR early response genes cytokiny, lymfokiny, protoonkogeny nestabilní transkripty HuR RNA-vazebnábílkovina váže se k ARE pendlující faktor váže se i k transportinu 2 HuR rodina ELAV RanGTP-dependentní cesta Transport prostřednictvím Impβ-like receptorů Trn2 (transportin2) a Crm1 pp32 fosfoprotein zprostředkovává vazbu HuR k Crm1 Ran-dependentní cesta:?? výjimka či pravidlo?? Transport a stabilita RNA Stabilita mrna hnrnp/mrnp Jaderný export Jaderné póry Transport komplexem jaderného póru Export RNA Stabilita RNA Degradační dráhy Motivy ovlivňující stabilitu RNA Umlčování genů Abundance mrna poměr rychlosti syntézy a degradace Transkripty Extrémně stabilní - skladované mrna Stabilní - konstitutivní geny Nestabilní regulační bílkoviny transkripční faktory, geny buněčného cyklu, geny stresové odpovědi regulace stability mrna změna poločasu života dané mrna až 10x fyziologická vývojové stadium, rychlost růstu, diferenciace podněty okolí stres, výživa, hormony Poločas života mrna Escherichia coli desítky vteřin až téměř hodina Savci minuty ažněkolik dní 10

11 Stabilita mrna Faktory ovlivňující délku života (stabilitu) mrna Cis-elementy Trans-faktory Primární sekvence mrna Ribosomy Strukturní elementy RNA-vazebné bílkoviny Čepička (5-5 trifosfátová vazba) Ribonukleasy Poly(A) řetězec Antisense RNA Degradosom Endonukleolytické štěpení RNasa E 1061 aa N-konec katalytická doména C-konec: formování degradosomu RNasa III 226 aa štěpí ds v mrna a rrna autoregulační smyčka RNasa P štěpení 5 -konce trna Degradace bakteriálních mrna Stabilizační vlásenky se smyčkami v 5 i 3 UTR Exonukleolytické štěpení jen 3 ->5 Poly(A) polymerasa syntéza nt poly(a) destabilizace RNA, značka pro degradaci kotva pro navázání exonukleas RNasa II, PNPasa (polynukleotid fosforylasa) potřebují ss 3 -konec RNA vzájemně funkčně zastupitelné Oligoribonukleasa degradace oligoribonukleotidů mrna degradační dráhy eukaryot Hlavní degradační dráha (1) Deadenylace deadenylasa PAN (kvasinky) PARN, DAN (savci) (2) Odštěpení čepičky endonukleasa Dcp1p/Dcp2p (kvasinky) Značná variabilita mazi kvasinkami a živočichy; 2 základní směry exonukleas: 5 ->3 a 3 ->5 Faktory ovlivňující odštěpení čepičky interakce konců mrna (disociace) přítomnost eif4f (zejména eif4e) (3) Degradace RNA exonukleasa Xnr1p, Rat1p (kvasinky) 5 ->3 exosom (kvasinky) 3 ->5 11

12 Hlavní degradační dráha kvasinek Hypotetická endonukleolytická dráha Odštěpení čepičky Exosom bílkovin kda Ski2p ATP-dep. RNA helikasa, RNasy, GTPasa Transport a stabilita RNA Motivy v 3 -UTR ovlivňující stabilitu mrna hnrnp/mrnp Jaderný export Jaderné póry Transport komplexem jaderného póru Export RNA Stabilita RNA Degradační dráhy Motivy ovlivňující stabilitu RNA Umlčování genů ARE/AURE element IRE element Histonová mrna 12

13 ARE / AURE (AU/U-rich element) Funkce HuR Konsensus AUUUA Regulace genové exprese během buněčného růstu a vývoje Destabilizační signál v 3 -UTR Stabilizace mrna 4 známé bílkovinné ligandy SET α/β, pp32, APRIL inhibitory PP2A (protein fosfatasa 2A) Stimulace odstranění čepičky (Dcp1p) Stimulace aktivity exosomu (přes TTP, KSRP) Cílové místo pro endonukleasy Export mrna (ARE) prostřednictvím pp32 vazba k Crm1 nebo k transportinu 2 alternativní dráha závislá na Ran Stabilizace/export mrna za stresu úloha HuR Stresové granule Specifické RNP komplexy vznik po působení stresu fosforylace eif2α v ternálním komplexu eif-gtp-trna Met -> STOP iniciace translace navázání TIA-1 a TIAR agregace stresových granulí Normální podmínky export mrnp, pendlování HuR ochrana mrna v jádře i cytoplasmě Stresové podmínky export stresových komplexů akumulace HuR v cytoplasmě, snad ve stresových granulích revertovatelné HSP70 HSP70 mrna netvoří stresové granule 13

14 Iron-responsive element Transferrin receptor (TfR) exprimován při nedostatku železa IRE: vlásenka (23-27 nt) smyčka (6 nt) mrna pro transferrin receptor 5 IRE elementů 3 nutné pro regulaci T 1/2 TfR mrna IRP (IRE-binding protein) volný enzym akonitasa vazba k IRE stabilizuje TR mrna regulace železem Rostlinné RBP ABH1 (ABA hypersensitive 1) homolog CBP80 iniciace translace stabilisace mrna SAD1 (supersensitive to ABA and drought 1) ortolog Lsm5 (kvasinky) degradace mrna 14

15 Transport a stabilita RNA HYL1 (hyponastic leaves 1) neexistuje blízký homolog snad stabilisace a translační regulace mrna snad součást MAPK dráhy hnrnp/mrnp Jaderný export Jaderné póry Transport komplexem jaderného póru Export RNA Stabilita RNA Degradační dráhy Motivy ovlivňující stabilitu RNA Umlčování genů Umlčování genů / gene silencing Protismyslná RNA Petunia (1990): změny barev květů po transformaci genem pro chalcon synthasu za 35S promotorem TGS (transkripční umlčování genů) změny v přístupnosti genu pro transkripční komplex homologie antisense RNA k promotoru cílového genu změny chromatinu a methylace DNA PTGS (post-transkripční umlčování genů) destabilisace cílového transkriptu homologie antisense RNA k transkribované oblasti cílového genu RNA komplementární k cílové RNA, reguluje její funkci ovlivnění stability cílové RNA inhibice nebo zesílení exprese chemická modifikace cílové RNA/DNA Délka 22 nt až >10 kb Dva základní typy: cis- a trans-kódované RNA Všechny známé říše Eubacteria, Archaebacteria, Eukaryota Obranná strategie kontrola virové infekce umlčování cizorodých genů Umělé protismyslné molekuly antisense DNA oligonukleotidy terapeutické užití štěpeny RNasou H (štěpí DNA/RNA hybrid) 15

16 Antisense RNA u rostlin Gene silencing malé RNA (21-25 nt) produkty úprav prekurzorové dsrna CARPEL FACTORY (homolog DICER) sirna (small interfering RNA) úplná homologie s cílovou RNA destabilizátory ds úsek -> rozštěpení RISC (RNA-induced silencing complex) objeveny jako původci umlčování transgenů rostlin (gene silencing) mirna (micro RNA) neúplná homologie s cílovou RNA antisense translační represory objeveny u C. elegans jalko strna (small temporal RNAs) sirna mirna Normální situace: syntéza mrna -> transkripce Nenormální situace: vadná RNA rozpoznána specifickými bílkovinami, import do jádra Gene silencing Gene silencing Indukce silencingu: interakce DNA a komunikátorové RNA vznik RNA/DNA hybridu mezi RNA a obnaženým transkribovaným chromatinem Jádro: kritická koncentrace RNA/DNA hybridu STOP komplexu RNA pol.ii substrát pro RNA-dep. RNA polymerasu syntéza krátkých antisense RNA methylace DNA Cytoplasma: navázání antisense RNA k cílové RNA asociace degradosomu degradace maskovaná RNA chráněná před degradací RNP komplex aberantní RNA a spec. bílkovin 16