Nové trendy v prenatální diagnostice

Transkript

1 Nové trendy v prenatální diagnostice Diana Nikulenkov Grochová Cytogenetická laboratoř Brno, s.r.o.

2 Víme, co hledat

3 Netušíme, kde a co hledat arraycgh NGS

4 Rozlišení Klasický karyotyp (rozlišení ~ 5 Mb) Array-CGH (rozlišení ~ 0,1 Mb) NGS (rozlišení- jednotlivé báze)

5 UZ nález/ věk/ biochemický skríning karyotyp QF-PCR amniocentéza/ CVS Array CGH

6 vzorek reference

7

8 typy array-cgh BAC próby kb cílené klinicky jasný projev rozlišení 100 kb v klinicky významných oblastech a 500 kb v páteři Oligo větší denzita - próby bp v prenatální diagnostice - cílené SNP dlouhé úseky homozygozity, UPD (Angelman sy)

9 NT- šíjové projasnění SYNDROM OMIM Lokus Dandy-Walker syndrom q24 Joubert syndrom q13 Di George syndrom q11.21 Noonan syndrom q24.13 Beckwith-Wiedemann syndrome q35; 11p15

10 Srdeční vady SYNDROM OMIM Lokus Alagille syndrom p12.2 Di George syndrom q11.21 Holt-Oram syndrom q24.21 Kabuki syndrom p22 Noonan syndrom q24.13 Williams-Bauren syndrom q11.23

11 Syndrom DiGeorge 1:4000 Prenatálně: srdeční vada (stenóza aorty, FT) rozštěp patra/rtu hypoplázie thymu mikrodelečnísyndrom 22q11 (4q34.2, 10p, 8p23, 17p13, 18q21.33, 4q21-q25, 9q34.3)

12 Array CGH v prenatální diagnostice (Dept. Of Genetics, Groningen a Genetic Services Quality Committee of the ESHG) Úskalí omezení na případy s UZ nálezem? vyšetření rodičů? (de novo CNV) cena interpretace etické problémy Obecná doporučení databáze př. Database of Genomic Variants materiál DNA z nekultivovaných amniocytů kontrola kontaminace mateřskou DNA platforma rozlišení 400 kb páteř rodiče cíleně: mikrodeleční/mikroduplikační syndromy laboratoř + klinik co ještě interpretovat

13 Problém s CNV segmenty DNA (~1 kb), které v populaci mají variabilní počet opakování oproti referenčnímu genomu cca 12% genomu - CNV (Redon et al., Nature 2006) CNV patogenní benigní (99% zděděné, < 500 kb) VOUS - nové varianty s neznámým významem 1000 genomes project

14 Databáze aktuální verze!!! (hg38 a GRCh38) UCSC Genome Browser ISCA International Standards for Cytogenomic Arrays NCBI, Ensembl Database of genomic variants (DGV) Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensembl Resources - DECIPHER ECARUCA OMIM, Chromosomal Variation in Man, Orpha.net

15

16

17 Validace array-cgh nálezů FISH qpcr QF-PCR MLPA

18 Hillman et al., Ultrasound Obstet Gynecol2012

19 Abnormální nálezy u UZ- zahrnuta array-cgh za předpokladu 6,3% záchytu Abnormální nálezy u UZ - zahrnuta array-cgh za předpokladu 6.3% záchytu 1.6% 0.4% 0.2% 0.4% 5.3% 0.6% 21.4% UZ nálezy bez patologie trizomie 21 trizomie 13, 18 a monozomie X 0.6% 5.4% 6.9% XXY, XXX, XYY triploidie další nebalancované přestavby mozaika nad 10% mozaika pod 10% 78.6% balancované přestaby n=1863 nálezy na arraycgh za předpokladu 6.3% záchytu

20 UZ nález / věk / biochemický skríning karyotyp QF-PCR amniocentéza / CVS Array CGH

21 Abnormální nálezy u UZ- zahrnuta array-cgh za předpokladu 6,3% záchytu Abnormální nálezy u UZ - zahrnuta array-cgh za předpokladu 6.3% záchytu 1.6% 0.4% 0.2% 0.4% 5.3% 0.6% 21.4% UZ nálezy bez patologie trizomie 21 trizomie 13, 18 a monozomie X 0.6% 5.4% 6.9% XXY, XXX, XYY triploidie další nebalancované přestavby mozaika nad 10% mozaika pod 10% 78.6% balancované přestaby n=1863 nálezy na arraycgh za předpokladu 6.3% záchytu

22 Abnormální nálezy u UZ- aberace detekované pomocí QF-PCR Abnormální nálezy u UZ abnormality zachycené pomocí QF-PCR UZ nálezy bez patologie 1.6% 0.4% 0.2% 0.4% 5.3% trizomie 21 QF-PCR trizomie 13, 18 a monozomie X XXY, XXX, XYY triploidie další nebalancované přestavby mozaika nad 10% mozaika pod 10% 78.6% balancované přestaby n=1863 nálezy na arraycgh za předpokladu 6.3% záchytu

23 Abnormální nálezy u UZ- kombinace QF-PCR a array-cgh Abnormální nálezy u UZ kombinace QF-PCR a array-cgh UZ nálezy bez patologie 0.2% 0.4% trizomie 21 QF-PCR + array-cgh trizomie 13, 18 a monozomie X XXY, XXX, XYY triploidie další nebalancované přestavby mozaika nad 10% mozaika pod 10% 78.6% balancované přestaby n=1863 nálezy na arraycgh za předpokladu 6.3% záchytu

24 G-pruhování vs. QF-PCR/array-CGH G-pruhování QF-PCR/array-CGH rozlišení balancované přestavby X Interpretace/VOUS / X X/ triploidie mozaicismus! ne pod 10% kultivace buněk nutná ne čas cena

25 1. kazuistika del 17p13.3 (2.37 Mb)

26 kazuistika Klinický popis Věk matky31 Gravidita po IVF 28. týden gravidity UZ: nižší hmotnost plodu symetrická hypotrofie lisencefalie amniocentéza karyotyp normální 46, XX Array CGH

27 del 17p13.3 syndrom Miller-Dieker MLPA 34.týden gravidity porod, stigmatizace, lisencefalie

28 Syndrom Miller-Dieker Miller-Dieker lissencephaly syndrome mikrocefalie růstová retardace srdeční malformace mentální retardace se záchvaty zkrácená délka života Geny: LIS1(PAFAH1B1) ε (YWHAE) CRK Dobyns and Dans, 2009, GeneReviews

29 Syndrom Miller-Dieker Geny: LIS1(PAFAH1B1) ε (YWHAE) CRK Software Cardoso et al., 2003, AJHG

30 BlueFuse DecisionTrack (NCBI37)

31

32

33 2. kazuistika detekce velkých přestaveb v genomu, které konvenční cytogenetika neodhalila

34 kazuistika Klinický popis věk matky 30let 17. týden gravidity ultrazvukový nález: výpotek v levé polovině hrudníku NT 3,0 mm srdeční hrot směřující více ke sternu suspektní koarktace aorty diskrepance v biometrii plodu

35 kazuistika Klinický popis věk matky 30let 17. týden gravidity biochemický screening: riziko trizomie 21 1:2 riziko trizomie 13 a 18 1:180 amniocentéza

36 parciální monozomie X

37 Turnerův syndrom 1: Postnatálně porucha růstu neplodnost vrozená srdeční vada široký krk s kožní řasou problémy se sluchem, zrakem osteoporóza, diabetes, inteligence normální zdroj:

38 Turnerův syndrom Prenatálně 1: zvýšené šíjové projasnění koarktace aorty hypoplázie levého srdce hydrops zdroj: zdroj:

39 Turnerův syndrom Prenatálně 1: zvýšené šíjové projasnění koarktace aorty hypoplázie levého srdce hydrops zdroj: zdroj:

40 Turnerův syndrom kritická oblast SHOX Short stature homeobox-containing protein array CGH zdroj:

41 array CGH SHOX delece Xp11.22p22.33 (~50 Mb)

42 array CGH SHOX delece Xp11.22p22.33 (~50 Mb) duplikace 15q25.2q26.3 (~21 Mb)

43 FISH der(x)t(x;15) der(x)t(x;15)

44 15q overgrowthsyndrome Postnatálně mentální retardace nadměrná výška obličejová asymetrie výrazný nos skolióza kraniosynostóza Prenatálně nadměrný růst plodu makrocefalie hypertelorismus obličejová malformace

45 15q overgrowthsyndrome Postnatálně mentální retardace nadměrná výška obličejová asymetrie výrazný nos skolióza kraniosynostóza Prenatálně nadměrný růst plodu makrocefalie hypertelorismus obličejová malformace

46 der(x)t(x;15) zdroj: Spatz et al. (2004) Nature Reviews Cancer 4,

47 Stará generace versus Nová generace

48

49

50

51

52

53

54

55

56 VCC panel 60 genů 60 genů = 1330 exonů = bp stará generace nová generace Čas měsíce několik dní Cena ~ Kč ~ Kč

57 NGS v prenatální diagnostice Zárodečné mutace v klinice zatím omezené použití Panely genů pro specifické fenotypové skupiny např. vrozené srdeční vady, skeletální vady NIPT neinvazivní prenatální testování

58 UZ nález/ věk/ biochemický skríning karyotyp QF-PCR amniocentéza/ CVS riziko potratu 0.5 1% nelze před 11. tg

59 Další zdroje fetálního materiálu pro prenatální diagnostiku Fetální buňky v maternální cirkulaci erytroblasty trofoblastické buňky leukocyty Obtížné je izolovat a přetrvávají roky po porodu Volná fetální DNA v maternální cirkulaci Detekovatelná od 5. tg Po porodu mizí za minut 3 25 % celkové cirkulující DNA Původ z trofoblastu

60 Volná fetální DNA cirkulující v krvi matky

61 Volná fetální DNA v krvi matky určení pohlaví pro X vázaná onemocnění, př. hemofilie, DMD při nejasnosti genitálu na UZ Y specifické sekvence: SRY/ DYS14 Přítomnost fetální DNA: RASSF1A

62 RhD genotypizace plodu identifikaci plodů v riziku fetální erytroblastózy u aloimunizovaných těhotenství redukce podávání humánního IgG anti-d rutinní profylaxe 3. trimestr urhnegativníchmatek bez genotypizace 38% zbytečně s genotypizací ~ 2% zbytečně UK Chitty et al., BMJ (2014)

63 Volná fetální DNA v krvi matky monogenní onemocnění AD: achondroplázie, thanatoformní dysplázie, Huntingtonova chorea, myotonická dystrofie AR: beta-talasemie, cystická fibróza, kongenitální adrenální hyperplázie X vázené: hemofilie, retinitis pigmentosa

64 Wong a Lo, Annu. Rev. Med.2016

65 Volná fetální DNA v krvi matky Downův syndrom

66

67

68 Relativní velikost chromozómů % of Genome 8% 7% 6% 5% 4% 3% 2% 1% 0% X Y Chromosome

69 NIPT aneuploidií -přístupy Všechny přístupy vyžadují složité bioinformatické a statistické zpracování dat NGS Kvantitativní-MPSS shotgut, cílená NGS Kvalitativní- SNP Epigenetika MeDIP Array-hybridizace Digital PCR mrna SNP

70

71

72 Chromozóm 21 Euploidní Trizomie 21 z- score NCV normalised chromosome value

73 NIPT pomocí přístupu NGS / SNP

74 NIPT aneuploidie 21, 18, 13 aneuploidie pohlavních chromozómů (monozomie X) triploidie mikrodeleční syndromy DiGeorge, Cri-du-chat, Wolf-Hirschorn, Prader Willi/Angelman sy fetální frakce již od 8. týdne těhotenství BMI >35 vícečetná těhotenství darované oocyty

75 neinvazivní před 11. týdnem těhotenství vysoká sensitivita + specificita Ne diagnostický test! Falešně pozitivní/negativní Cena

76 Falešně pozitivní / negativní / zkreslené výsledky NIPT feto-placentární mozaicismus mizející dvojčata rozdílný karyotyp u vícerčat maternální karyotyp terapie (transfuze, transplantace ) malignita

77 Fetální frakce

78 Malignita u matky Bianchi et al., JAMA, 2015

79 Feto-placentární mozaicismus převzato a upraveno: Quizlet.com (2015)

80 Kazuistika 13. týden gravidity: T21: 1/110 T13,T18: 1/180 UZ v normě NIPT TRIZOMIE chromozómu týden gravidity: UZ snížený průtok krve pupečníkem amniocentéza QF-PCR

81 QF-PCR chromozóm 18 STR markery neinformativní delece chromozómu 18? uniparentální disomie(upd)

82 plod matka otec SNP array( SNPs) Mgr. Miroslav Horňák, Ph.D. (Repromeda, Brno) Uniparentální heterodizomie

83 Kazuistika 13. týden gravidity: T21: 1/110 T13,T18: 1/180 UZ v normě NIPT TRIZOMIE chromozómu týden gravidity: UZ UZ sníženýprůtok krve pupečníkem amniocentéza UPD 18 minimum literárních údajů LOH 21. týden gravidity: oligohydramnion nulový průtok krve pupečníkem morfologické anomalienenalezeny, časná růstová retardace z důvodu insuficience placenty

84 Feto-placentární mozaicismus trizomie 18 trisomic rescue UPD 18

85 ETIKA VOUS-varianty nejasného významu nemoci s nástupem v pozdějším věku genetická konzultace výběr pohlaví, estetických, povahových, dovednostních znaků (GATACA) Chtěla byste vědět, zda Vaše dítě bude mít závažné onemocnění (např. Downův syndrom)? ANO 100%

86 ETIKA VOUS-varianty nejasného významu nemoci s nástupem v pozdějším věku genetická konzultace výběr pohlaví, estetických, povahových, dovednostních znaků (GATACA) Chtěla byste vědět, zda Vaše dítě bude mít mírnější onemocnění (např. rozštěpovou vadu rtu)? NE 5% ANO 95%

87 ETIKA VOUS-varianty nejasného významu nemoci s nástupem v pozdějším věku genetická konzultace výběr pohlaví, estetických, povahových, dovednostních znaků (GATACA) Chtěla byste vědět, zda Vaše dítě bude mít onemocnění, které se však projeví až vpozdějším věku (po 50-ti letech) např. nádorové onemocnění, psychickou poruchu apod.? Nevím 38% ANO 32% NE 30%

88