ZPRÁVA O VÝVOJI NOVÝCH TECHNOLOGIÍ CHOVU RYB

ZPRÁVA O VÝVOJI NOVÝCH TECHNOLOGIÍ CHOVU RYB Název projektu: Vývoj technologie uchování testikulárního spermtu štiky oecné Registrční číslo projektu: CZ.1.25/3.1.00/13.00447 1

Příjemce dotce: Název neo ochodní jméno: Ryářství Nové Hrdy s.r.o. Adres: IČ: 15789799 Registrční číslo projektu: Štiptoň, č.p. 78, 37401 Nové Hrdy CZ.1.25/3.1.00/13.00447 Název projektu: Vývoj technologie uchování testikulárního spermtu štiky oecné Jméno příjmení osoy, která je oprávněn příjemce dotce zstupovt: Luomír Zvonř, jedntel Vědecký ústv: Název neo ochodní jméno: Jihočeská univerzit v Českých Budějovicích, Fkult ryářství ochrny vod Adres: IČ: 60076658 Zátiší 728/II, 389 25 Vodňny Místo dtum zprcování zprávy: Vodňny, 31.5.2015 Jméno příjmení osoy, která je oprávněn vědecký ústv zstupovt: prof. RNDr. Lior Gruhoffer, CSc. Zprcovtel zprávy: Název neo ochodní jméno: Jihočeská univerzit v Českých Budějovicích, Fkult ryářství ochrny vod Adres: IČ: 60076658 Zátiší 728/II, 389 25 Vodňny Místo dtum zprcování zprávy: Vodňny 31.5.2015 Jmén příjmení oso, které zprcovly zprávu: prof. Ing. Otomr Linhrt, DrSc. Jméno příjmení osoy, která je oprávněn zprcovtele zprávy zstupovt: prof. RNDr. Lior Gruhoffer, CSc. 2

Souhls s pulikcí zprávy: Souhlsím se zveřejněním této zprávy projektu v rámci optření 3.1. Společné činnosti, záměr ) podpor spolupráce mezi vědeckými ústvy, odorným školstvím hospodářskými sujekty v odvětví ryářství z Operčního progrmu Ryářství 2007 2013 n internetových stránkách Ministerstv zemědělství s využíváním výsledků této zprávy všemi sujekty z odvětví ryářství. Podpis osoy oprávněné zstupovt: 1. Příjemce dotce: Luomír Zvonř 2. Spoluprcující sujekt projektu (vědecký ústv): prof. RNDr. Lior Gruhoffer, CSc. 3. Zprcovtele zprávy: prof. RNDr. Lior Gruhoffer, CSc. 3

Osh 1. CÍL... 5 1.1. Co je cílem projektu... 5 1.2. V čem spočívá inovtivnost vyvíjené technologie... 5 1.3. Proč je nutná vyvíjená inovce... 5 2. ÚVOD... 6 3. MATERIÁL A METODIKA... 8 3.1. Mlíčáci, zákldní ukztele spermtu testikulárního spermtu... 8 3.2. Hodnocení motility spermií, rychlosti pohyu spermií fertility... 9 3.3. Experiment 1: Ověření dvou způsoů extrkce testikulárního spermtu z testes... 10 3.4. Experiment 2: Ověření vhodného testikulárního roztoku... 10 3.5. Experiment 3: Testování testikulárního roztoku v kominci s ktivčním roztokem... 11 3.6. Experiment 4: Ověření výtěžnosti testikulárního spermtu propočet stndrdizce osemenění z hledisk počtu spermií n jednu jikru... 11 3.7. Experiment 5: Testování oplozenosti s doplněním v poloprovozním pokusu... 12 3.8. Sttistické hodnocení... 13 4. VÝSLEDKY A DISKUSE... 14 4.1. Mlíčáci, zákldní ukztele spermtu testikulárního spermtu... 14 4.1.1. Závěr... 15 4.2. Experiment 1: Ověření dvou způsoů extrkce testikulárního spermtu z testes... 15 4.2.1. Závěr... 15 4.3. Experiment 2: Ověření vhodného testikulárního roztoku... 18 4.3.1. Závěr... 18 4.4. Experiment 3: Testování testikulárního roztoku v kominci s ktivčním roztokem... 19 4.4.1. Závěr... 19 4.5. Experiment 4: Ověření výtěžnosti testikulárního spermtu propočet stndrdizce osemenění z hledisk počtu spermií n jednu jikru... 20 4.5.1. Závěr... 20 4.6. Experiment 5: Testování oplozenosti s doplněním v poloprovozním pokusu... 20 4.6.1. Závěr... 22 5. ZÁVĚR... 23 4

1. Cíl 1.1. Co je cílem projektu Cílem projektu je odstrnit šptnou kvlitu testikulárního spermtu štiky oecné zvést jeho ěžné užívání do ryích líhní v ČR. Smluvní cíle spočívly v příprvě použití testikulárního ktivčního roztoku pro testikulární sperm se zdůvodněním složení, zjištění vlivu roztoků n motilitu spermií jejich oplozovcí schopnost v závislosti n uchovtelnosti testikulárního spermtu. Posledním cílem ylo njít vhodný postup extrkce testes tk, y ylo získáno testikulární sperm co nejlepší kvlity. 1.2. V čem spočívá inovtivnost vyvíjené technologie Inovtivnost spočívá v ověření zvedení nového technologického postupu pro využití testikulárního spermtu při výtěru štiky se zlepšením jeho fertility s popisem techniky seprce testikulárního spermtu, jeho uchování ve speciálním testikulárním roztoku s následnou ktivcí v ktivčním roztoku. Proztím vyvíjená technologie neyl nikde pulikován tudíž ni dostupná. 1.3. Proč je nutná vyvíjená inovce Technologie je nutná pro zezpečení lepší produkce váčkového plůdku štiky oecné, která je důležitou součástí kvkulturního chovu v České repulice. Celá technologie využití testikulárního spermtu nízí nutný doplněk líhňřům při oecně šptné kvlitě vytírného spermtu související jk s jeho kontmincí močí, tk i s teplotními změnmi. Technologie njde upltnění n všech ryích líhních v ČR. 5

2. Úvod Štik se stává v Evropě význmným chovným druhem, který má vysoké ekonomické prktické využití n trhu konzumentů. Dorá znlost reprodukce s různými lterntivními postupy může ýt pro nše chovtele v doě změn klimtu zvýšení rizikovosti neúspěchu při reprodukci význmnou ekonomickou výhodnou oproti okolním zemím. Všechny důležité líhně v ČR štiku vytírjí, to jk pro potřey chovu v rynících, tk pro potřey exportu do okolních evropských zemí. Prolémem při smotném výtěru je nízká úroveň oplozenosti způsoená především nedosttkem spermtu, šptnou kvlitou spermtu kontminovného močí (Alvi kol., 2009; Linhrt kol., 2011; Hulák kol., 2008), či šptným způsoem použití testikulárního spermtu. Sperm štiky je vždy kontminováno močí, což má vliv n jeho kvlitu. Při výtěru ovykle získáváme mlý ojem spermtu nízké kvlity. Ryáři prolému s kvntitou spermtu kontmincí močí předcházejí použitím tzv. testikulárního spermtu, které získjí z vypreprovných testes zitých mlíčáků. Vypreprovné testes se zví krve přes uhelon či nylonovou punčochu vymčkjí přímo n vytřené jikry. Vymčkná suspenze z testes oshuje velmi vriilní ojem spermií n různé úrovni zrlosti s poškozeným ičíkem, to vlivem mechnického "psírování". Rodin kol. (2008) tuto skutečnost zjistili u testikulárního spermtu okoun říčního. Proto úroveň oplozenosti, či úroveň dosžení očních odů je u štik velmi vriilní, pohyující se od 10 do 80 %. Líhňři většinou dávjí tento fenomén do souvislosti s přezráváním jikernček, le my se domníváme, že vedle této skutečnosti je ve velké míře způsoen použitím nedosttečného kvnt spermií, nekvlitního spermtu spermtu o nízké zrlosti (Alvi kol., 2008). Zrlost znmená, že spermie jsou po morfologické či strukturní stránce zcel v pořádku mjí vysokou oplozovcí schopnost, což většinou souvisí s pohylivostí spermií. Rovněž jsme u jiného druhu, to jeseterů (Dzyu kol., 2014) s popisem v metodice (Dzyu kol., 2014) zjistili, že testikulární spermie se vůec ve vodě nepohyují pro jejich udoucí ktivci je nutná velmi krátkodoá přítomnost moči. Domnívli jsme se, že pro dozrání testikulárního spermtu jsou nutné hodiny, le n příkldu jeseter postčují minuty. Rozdíl mezi oěm druhy je orovský z pohledu zrání spermií. U jeseterů odoně si i u osttních chrupvčitých ry je testikulární sperm uchováváno přímo v těle smce společně s močí (moč ředí testikulární sperm) v řádech hodin či dnů má pozitivní vliv n zrlost spermtu. U štiky dochází pouze ke krátkodoé kontminci močí přímo při výtěru v místě močopohlvní ppily, to podoně jko u osttních kostntých ry. Moč v koncentrovné podoě má negtivní vliv n sperm štiky. N zákldě znlostí u jeseterů jsme se snžili u štiky: 1) Optimlizovt metodu získání funkčních testikulárních spermií s ičíky. 2) Njít vhodný testikulární roztok, který zezpečí co nejrychlejší dozrání spermií k co nejlepšímu použití. 3) Proprcovt celou technologii výtěru od získání spermií ž po optimální ktivci gmet. Proztím vyvíjená technologie neyl nikde pulikován tudíž ni dostupná. Seznm použité litertury v technologii: Alvi, S.M.H., Rodin, M., Viveiros, A.T.M., Cosson, J., Gel, D., Boryshpolets, S., Linhrt, O., 2009. Effects of osmollity on sperm morphology, motility nd flgellr wve prmeters in Northern pike (Esox lucius L.). Theriogenology 72: 32 43. 6

Dzyu, B., Cosson, J., Boryshpolets, S., Bondrenko, O., Dzyu, V., Prokopchuk, G., Gzo, I., Rodin, M., Linhrt, O., 2014. In vitro sperm mturtion in sterlet, Acipenser ruthenus. Reproductive Biology 14: 160 163. Dzyu, B., Boryshpolets, S., Cosson, J., Rodin, M., Pšeničk, M., Linhrt, O., Prášková, E., Dzyu, V., Fedorov, P., 2014. Použití testikulárního spermtu jeseterovitých ry. Edice Metodik, FROV JU, Vodňny, č. 151, 14 s. Hulk, M., Rodin, M., Alvi, S.M.H., Linhrt, O., 2008. Evlution of semen nd urine of pike (Esox lucius L.): Ionic compositions nd osmollity of the seminl plsm nd sperm volume, density nd motility. Cyium 32(2): 189 190. Linhrt, O., Rodin, M., Boryshpolets, S., 2011. Hodnocení čerstvého spermtu ry. Edice Metodik, 2011, FROV JU, Vodňny, č. 114, 19 s. Rodin, M., Policr, T., Linhrt, O., Rouget, C., 2008. Sperm motility nd fertilizing ility of frozen-thwed spermtozo of mles (XY) nd neomles (XX) of perch (Perc fluvitilis). Journl of Applied Ichthyology 24: 438 442. 7

v roce 3. Mteriál metodik Díky velkému úsilí oou zúčstněných prtnerů projektu zejmén díky změstnncům ryí líhně Ryářství Nové Hrdy, s.r.o. (orázek 1) jsme mohli uskutečnit poměrně rozsáhlou experimentální činnost, která se soustředil do jrní sezóny 2014 s vyhodnocováním v průěhu roku 2014 doplněním některých technologických detilů v jrní sezóně 2015. K experimentům jsme využili lortorní zázemí Lortoře fyziologie reprodukce Jihočeského výzkumného centr kvkultury iodiverzity hydrocenóz (CENAKVA) FROV JU. Orázek 1: Orgnizce experimentů (foto před ryí líhní Ryářství Nové Hrdy, s.r.o.) 3.1. Mlíčáci, zákldní ukztele spermtu testikulárního spermtu V průěhu oou výtěrových sezón od konce únor ž do konce dun jsme celkem od 28 dozrálých mlíčáků oderli sperm testikulární sperm (průměrná délk 512 cm, průměrná hmotnost 1281 g). Mlíčáci po odlovu z ryníků jk v Nových Hrdech, tk ve Vodňnech yli drženi odděleně od jikrnček v průtočných exteriérových zénech o ojemu 6 m 3 využíváni k experimentům po dou několik týdnů. Teploty vody v zénech se pohyovly od 7 do 15 C, osádk yl extenzivní ez krmných ry s minimem kyslíku n úrovni nd 7 mg.l -1 O2. Spermice neyl stimulován hormonálně. Oděr spermtu: Po pečlivém osušení mlíčák jsme odsávli sperm plstovou injekční stříkčkou o ojemu 5 ml přímo z povrchu urogenitální ppily při součsné lehké msáži 8

řišní krjiny mlíčák. Stříkčky po oznčení jsme uložili do oxu n led (0 2 C) snžili jsme se vyvrovt oděru spermtu s močí či fekáliemi. Vyjmutí testes: Mlíčák jsme usmrtili úderem do hlvy následným přetnutím žerních olouků, čímž jsme dosáhli částečného vykrvení. Ryu jsme znovu osušili, nůžkmi otevřeli tělní dutinu uvolnili vyjmuli testes, tk ychom je pokud možno nepoškodili (orázek 2). Orázek 2: Oděr testes u mlíčák štiky. Vlevo v provozních podmínkách vprvo v lortoři. Vypreprovné testes jsme osušili od krve uchovávli v chldu v Petriho misce či v misce (n ledu) podoně jko oderné sperm. Moč: U celkem 5 jedinců se nám podřilo odert i moč z močového měchýře k zjištění osmotické koncentrce v mosmol.kg -1. Hodnocení ojemu koncentrce spermií: Ojem vytřeného spermtu spolu s ojemem testikulárního spermtu koncentrcí spermií, včetně osmotické koncentrce jsme vyhodnotili podle metodiky Linhrt kol. (2011) s tím, že hodnoty u koncentrce spermií jsou uvedeny v 10 9 spermií osmotická koncentrce v mosmol.kg -1. Osmotická koncentrce u spermtu testikulárního spermtu yl měřen v plzmě po jejich odstředění. 3.2. Hodnocení motility spermií, rychlosti pohyu spermií fertility Motilit spermií yl odhdován v procentech podle metodiky Linhrt kol. (2011). Pro vyšší preciznost jsme v některých přípdech zznmenávli pohy spermií n DVD následně nlyzovli v počítči s vyhodnocením pohylivosti spermií v procentech (%) jejich rychlosti v µm.s -1. Pohy spermií jsme pozorovli mikroskopicky v otevřené kpce ez použití krycího skl. N čisté podložní sklo n stolku mikroskopu jsme kápli pomocí mikropipety 50 µl ktivčního medi s 0,1 % BSA k zmezení dheze spermií n podložní sklo. V rozprostřené kpce n podložním skle jsme ktivovli mlé množství spermtu. Preprční špičku jsme nmočili do spermtu/testikulárního spermtu lehkým ťuknutím jehlou přenesli do kpky vzorek spermtu. Jehlu jsme ihned otřeli optrně s ní zmíchli sperm v kpce n podložním sklíčku. Preprát jsme zsunuli pod ojektiv připrveného mikroskopu pozorovli, či přípdně nhrávli n video pohy spermií. Ovykle jsme kždý experiment opkovli 3x pro sttistické vyhodnocení. 9

Fertilit spermií Oplozovcí schopnost spermtu jsme ověřovli jednoduchým iologickým testem fertility do stádi 8 16 lstomer, to v Petriho miskách. Do mlých umělohmotných nádoek o ojemu 50 ml jsme dli 5 g jiker, přidli přesně určené množství spermií n úrovni 200 tisíc spermií n jednu jikru či sperm určeného ojemu mikropipetou s vnitřním pístem. Dále jsme směs jiker spermtu ktivovli 5 ml vody či ktivčním roztokem po dou 2 min. ručně míchli rotcí n stole. Následně jsme vše přenesli zhru po 100 jikrách do Petriho misek inkuovli při teplotách lízkých teplotám v líhni. 3.3. Experiment 1: Ověření dvou způsoů extrkce testikulárního spermtu z testes Po oděru spermtu u 6 mlíčáků do injekčních stříkček jsme mlíčáky usmrtili vyjmuli testes. Testes jsme osušili, odstrnili veškerou krev, zvážili rozdělili párový orgán n dv díly do dvou Petriho misek. V prvním přípdě jsme testes vložili do uhelonové síťky o velikosti ok 300 µm vymčkáním jsme získli testikulární sperm, které jsme oderli do zkumvky uložili n led. V druhém přípdě jsme testes v Petriho misce rozstříhli n droné kousky, překryli víčkem Petriho misky uložili n led do polystyrénové krice. Zhru po hodině došlo k utomtickému uvolnění dozrálého testikulárního spermtu ze svodných knálků testes do Petriho misky. Testikulární sperm jsme odsáli z Petriho misky ve zkumvce uložili n led. Evidentně velký ojem testikulárního spermtu vzhledem k dhesi zůstl n kouscích tkáně stěnách v Petriho misce. Následně jsme ověřili mikroskopicky, do jké míry máme v suspenzi testikulárního spermtu spermie s ičíkem ez ičíku. Testikulární sperm jsme nředili 1:100000 zznmenli n DVD pro vyhodnocení. Rovněž tk jsme zznmenli procento pohylivých spermií rychlost pohylivých spermií vyhodnotili nlýzou orzu (viz část 3.2). 3.4. Experiment 2: Ověření vhodného testikulárního roztoku Vyvíjený testikulární roztok nemá při inkuci testikulárního spermtu způsoovt pohy spermií (lespoň ne dlouhodoě), le v následné fázi po nředění má zlepšit pohylivost fertilitu testikulárních spermií. Víme tké, že spermie štiky jsou regulovány osmoticky (Alvi kol., 2009) není zde efekt regulce velmi nízkou úrovní drslíku jko v přípdě lososovitých jeseterovitých ry. K vývoji roztoků ylo využito roztoků NCl, KCl, MgCl, CCl2, dále cukrózy, glukózy jejich vzájemné komince. Optimální osmotické hodnoty yly dále testovány s pufrem tris- HCl o ph 7 8. K testovným roztokům yl dále přidán PBS (Phosphte uffered sline, fosfátový pufr), ěžně dostupný v peletách firmou Sigm o ph 7,4. Celkem jsme testovli okolo 120 různých komincí testikulárních roztoků. Jednotlivé testikulární roztoky jsme npipetovli v ojemu 990 µl roztoku do mikrozkumvky typu Eppendorf (eppendorfky), přidli 10 µl testikulárního spermtu (ředění 1:100) získného z rozstříhných testes od 5 mlíčáků, jemně protřepli uložili n led. Jko kontrol ylo použito zásoní testikulární sperm npipetovné v ojemu 200 µl do eppendorfky ktivovné vodou, viz část 3.2. Neředěné testikulární sperm po celou dou pokusu vykzovlo velmi dorou úroveň pohylivosti spermií, proto jsme celý první den mohli kontinuálně experimentovt. 10

Následně jsme ověřovli mikroskopicky pohylivost, to v několik úrovních: 1) Ověřili jsme, zd testikulární roztok nezpůsoil pohy spermií. N podložní sklo jsme dli 49,9 µl testovného roztoku přidli 0,1µl suspenze testikulárního spermtu s testikulárním roztokem, překryli krycím sklem ověřili, jk se spermie chovjí v roztoku. Pokud se spermie nepohyovly, či se pohyovly jen krátkodoě, ověřovli jsme dále uchovtelnost jejich pohyu. 2) Testovli jsme uchovtelnost pohyu spermií v ktivčním roztoku. N podložní sklo jsme dli 49,9 µl vody přidli 0,1 µl suspenze testikulárního spermtu s testikulárním roztokem odhdli pohylivost spermií ihned po ktivci. Uchovtelnost yl testován v čse 0, dále po 10 minutách, 1, 3, 24 72 hodinách. V přípdě vysokého stupně pohylivosti jsme pro vyhodnocení opkovli test ovykle 3krát. 3.5. Experiment 3: Testování testikulárního roztoku v kominci s ktivčním roztokem Tdy jsme vycházeli z nšich zkušeností u jiných druhů ry, že nejvhodnějším roztokem pro vlstní ktivci ude vhodné použít 5 10x násoně ředěné roztoky pro testikulární sperm. Použili jsme roztoky: 1) 22 mm NCl+5 mm tris, ph 8; 2) 44 mm NCl+ 5mM tris, ph 8; 3) nemodifikovný PBS ředěný 10x 4) nemodifikovný PBS ředěný 5x (složení PBS: 137 mm NCl; 2,7 mm KCl; 10 mm N2HPO4; 1,8 mm KH2PO4); 5) jko kontrolu jsme použili vodu. Vše jsme testovli se dvěm testikulárními roztoky, to Modifikovný PBS s 257 mm NCl NCl 220 mm + 20 mm trisu, ph 8. Jko kontrolu jsme použili testikulární sperm ez ředění. Jednotlivé testikulární roztoky jsem npipetovli v ojemu 990 µl roztoku do eppendorfek, přidli 10 µl testikulárního spermtu (ředění 1:100) získného z rozstříhných testes od 3 mlíčáků, jemně protřepli uložili n led. Jko kontrol ylo použito zásoní testikulární sperm npipetovné v ojemu 200 µl do eppendorfky ktivovné vodou, viz část 3.2. Testování ktivity spermií jsme prováděli následovně: N podložní sklo jsme dli 49,9 µl ktivčního roztoku přidli 0,1 µl suspenze testikulárního spermtu s testikulárním roztokem odhdli pohylivost spermií ihned po ktivci. Procento pohylivosti ylo testováno v čse 0, dále po 1 5 minutách uchování spermtu. Testování jsme ovykle opkovli 3krát. 3.6. Experiment 4: Ověření výtěžnosti testikulárního spermtu propočet stndrdizce osemenění z hledisk počtu spermií n jednu jikru Po získání více či méně vhodného testikulárního roztoku jsme ověřili, zd výtěžnost testikulárního spermtu metodou rozstříhání testes n droné kousky přinese spoň přiližně podonou výtěžnost testikulárního spermtu jko v přípdě metody vymčkání/psírování přes uhelon. K experimentu jsme použili testes od 4 mlíčáků. Testes jko párový orgán jsme 11

rozdělili do dvou misek s tím, že v první Petriho misce jsme testes rozstříhli n droné kousky druhou Petriho misku jsme ponechli volně zkryli víčkem uložili n led 0 2 o C po dou 2 hodin. Po dvou hodinách jsme opláchli Petriho misku v 50 ml testikulárního roztoku, to tk, y se do misky dostlo všechno testikulární sperm, včetně tkání. V druhém přípdě jsme při psírování testes přes uhelon omývli uhelon v misce s testikulárním roztokem opět v ojemu 50 ml n závěr jsme v něm opláchli misku rovněž prsty experimentátor. V oou přípdech jsme se snžili dostt sperm do testikulárního roztoku. Následně jsme zjistili koncentrci spermtu při znlosti ojemu jsme vypočítli celkový počet získných spermií. 3.7. Experiment 5: Testování oplozenosti s doplněním v poloprovozním pokusu Celkově yl proprcován technik využití testikulárního spermtu z pohledu ktivity spermií, kterou jsme se snžili potvrdit z hledisk oplozenosti do stádi rýhování, to 8 16 uněk. K experimentu jsme využili směsi jiker od 3 jikernček s následující procedurou. Sperm jsme vytřeli od 3 mlíčáků, smísili uchovávli v ledničce (motilit odhdnut n úrovni 45 %), následně jsme seprovli testikulární sperm z testes, v misce rozstříhli (motilit odhdnut n úrovni 70 75 %) smísili s testovným testikulárním roztokem vždy 1 minutu před osemeněním jiker. Šlo o testikulární roztok modifikovný PBS s 217, 237 257 mm NCl. Směs jiker (5g), jsme dli do mlé polyetylenové nádoky přidli vždy odoné množství spermtu či testikulárního spermtu (200 tisíc spermií n jednu jikru), tk ychom testovli vliv roztoků, ne vliv počtu spermií n jednu jikru. N jikry jsme podle výpočtu pipetovli 12 µl vytřeného spermtu, 5 µl testikulárního spermtu 50 µl testikulárního spermtu s testikulárním roztokem (5 µl testikulárního spermtu s 45 µl testikulárního roztoku). Uvedené hodnoty počtu spermií n jednu jikru jsou či y měly ýt ovyklé pro prxi. Aktivční roztok, to 10x ředěný PBS neo vod z líhně yly opět použity v ojemu 5 ml. Následně jsme inkuovli jikry v Petriho miskách do rozrýhování 8 16 lstomer zjistili procentuální oplozenost. Poloprovozní pokus yl změřen n testování nvrženého postupu s tím, že v kždé vrintě jsme použili 2 kg jiker od několik jikernček, promíchli rozdělili n 4 díly po 500 g jiker, vyhodnotili oplozenost podle rozrýhování v 8 16 lstomer odhdovli oplozenost těsně před očními ody. Odoně jko v předchozí vrintě jsme použili zhru odoná kvnt spermií s limitovným počtem spermií (200 tisíc spermií n jednu jikru) k zvýrznění rozdílů ve výsledcích: 1) N 500 g jiker jsme použili 1 ml vytřeného spermtu s ktivcí vodou 0,5 l. 2) N 500 g jiker jsme použili 0,4 ml testikulárního spermtu s ktivcí vodou 0,5 l. 3) N 500 g jiker jsme použili 0,4 ml testikulárního spermtu s ktivcí 0,5 l modifikovným PBS 10x ředěným. 4) N 500 g jiker jsme přidli 3,6 ml testikulárního modifikovného PBS roztoku s 257 mm NCl 0,4 ml testikulárního spermtu. Testikulární roztok jsme nejprve smíchli s testikulárním spermtem zmíchli do jiker po uplynutí 1 minuty ihned přidli 0,5 l ktivčního roztoku (modifikovný PBS 10x ředěný). Z jednotlivých experimentálních vzorků yly odděleny jikry k inkuci v miskách s opkováním 3x. Osttní jikry yly odlepkovány metodou používnou n líhni Ryářství Nové Hrdy, s.r.o., nszeny do inkučních lhví. Po vylíhnutí yl plůdek dále nszen do 12

ryníků sloven ve stádiu rychleného plůdku z důvodu porovnání přežití ry z klsického experimentálního výtěru. Orázek 3: Výtěr jikernček štiky n líhni Ryářství Nové Hrdy, s.r.o. 3.8. Sttistické hodnocení Všechny fktory yly vždy měřeny třikrát, to procento pohylivých spermií, rychlost pohyu spermií, oplozovcí schopnost v doě rýhování či v očních odech. Před sttistickým srovnáním yl vždy prověřen test normlity podle Person homogenity (Bretletův test) dt yl přípdně log-trnsformován. Dt yl srovnán dvoufktoriální nlýzou vrince ANOVA se zjištěním rozdílů s prvděpodoností vyšší než 95 %. Všechny údje v tulkách grfech jsou oznčeny lfeticky s tím, že rozdílný lfetický údj vyjdřuje skutečnost, že hodnoty jsou odlišné se spolehlivostí vyšší než 95 %. 13

4. Výsledky diskuse Kždou část výsledků jsme popsli tk, jk jsme postupně vytvářeli ověřovli technologii. Část výsledků je vždy zkončen jednoduchým závěrem. 4.1. Mlíčáci, zákldní ukztele spermtu testikulárního spermtu Zákldní ukztele o mlíčácích, ojemu spermtu, hmotnosti testes, ojemu moči, koncentrci spermií spermtu testikulárního spermtu, osmotické koncentrci spermiální testikulární plzmy, včetně odhdovné motility spermtu jsou shrnuty v tulce č. 1. Je ptrné ve srovnání s údji pulikovnými Hulákem kol. (2008), že jsme použili o něco menší mlíčáky, kteří dosáhli ovyklého GSI testes. Všechny testes měly ělvé zrvení s viditelným spermtem, což svědčilo o optimální zrlosti. Ojem moči u několik jedinců yl velmi mlý, což se projevilo v poměrně nízké kontminci vytřeného spermtu. Docel čsto se doshuje minimálních hodnot osmotické koncentrce u vytřeného spermtu n úrovni 200 mosmol.kg - 1, jk uvádějí Hulák kol. (2008). My jsme ovšem nměřili nejnižší hodnotu n úrovni 232 mosmol.kg -1, což dokumentuje velmi nízké znečištění močí, která nopk ovykle vykázl o něco vyšší osmollitu n úrovni 77 mosmol.kg -1. N druhé strně testikulární sperm vykázlo stilní osmollitu s nejnižší úrovní osmollity lízké nejvyšší úrovni osmollity vytřeného spermtu. Hodnot ukzuje n skutečnost, že jsme při disekci testes nekontminovli vše měřili rychle po oděru. Koncentrce testikulárního spermtu yl o něco vyšší, než uvádějí Hulák kol. (2008) neo Alvi kol. (2009), což ylo způsoeno tím, že jsme usmrcovli pouze mlíčáky, kteří spoň částečně spermiovli. Pohylivost spermií u vytřeného spermtu yl nízká, le v relci s literárními údji. Nopk testikulární sperm vykázlo optimální pohylivost. V oou přípdech jsme k ktivci využívli vodu z líhně. Hodnoty jsme někdy nměřili pouze u několik jedinců, což ylo způsoeno změřením experimentů, technickým prolémy při jednotlivých experimentech, tké tím, že v přípdě získání mlého ojemu jsme neyli schopni dále vyhodnotit dlší ukztele. Tulk 1: Souhrnná tulk prmetrů mlíčáků použitých k experimentům Prmetr Počet (n) Průměr Směrodtná odchylk Celková délk (mm) 28 512 48 Hmotnost (g) 28 1281 305 Hmotnost testes (g) 28 28 5 GSI 28 2,1 0,6 Ojem spermtu (ml) 28 1 0,5 Ojem moči (ml) 5 0,2 0,1 Osmollit moči (mosmol.kg -1 ) 5 77 3 Osmollit spermtu (mosmol.kg -1 ) 12 288 16 Osmollit testikulárního spermtu (mosmol.kg -1 ) 19 332 19 Koncentrce spermtu (10 9.ml -1 ) 22 14 4 Koncentrce testikulárního spermtu (10 9.ml -1 ) 22 38 7 Pohylivost spermií spermtu (%) 22 45 12 Pohylivost spermií testikulárního spermtu (%) 22 72 6 14

4.1.1. Závěr Zákldní ukztele o mlíčácích, ojemu spermtu, hmotnosti testes, ojemu moči, koncentrce spermií vytřeného spermtu testikulárního spermtu, osmotické koncentrci spermiální testikulární plzmy, včetně odhdovné motility spermtu nevyočují z průměru, které yly v minulosti pulikovány. Znmená to, že nše výsledky nemohly ýt zkresleny nějkým nevhodnou sezonní změnou, šptným výěrem mlíčáků či nevhodným přechováváním mlíčáků před experimentem. 4.2. Experiment 1: Ověření dvou způsoů extrkce testikulárního spermtu z testes Úroveň je vyjádřen grficky, kdy metod nstříhání zezpečil tkřk 80 % neporušenost spermií (orázek 4), oproti metodě, kdy se testes vymčklo/přepsírovlo přes uhelon (orázek 5 6), s 55 % spermií ez přítomností ičíku. N druhé strně ze záznmů ylo pouhým okem viditelné, že u metody přepsírování měly spermie ičík, le mnohdy výrzně krtší. Nepřítomnost či zkrácení ičíku se projevilo v průkzném snížení procent pohylivých spermií (orázek 7), to velmi výrzně z 62 % n 47 %, přičemž se zkrátil i do pohyu spermií, viz pohy spermií po 45 s (orázek 7), kdy u psírovcí metody již tkřk neyl zznmenán pohy spermií. Tto skutečnost se odrzil i v rychlosti pohyu spermií, to okmžitě po nstrtování pohyu, kdy jsou spermie nejrychlejší, viz orázek 8. Rychlost pohyu spermií vždy odráží pouze rychlost pohylivých spermií. Její snížení mohlo ýt ovlivněno zkrácením či porušením ičíku neo přítomností spermií s nedokončenou stvou ičíku. Rovněž je známo, že krtší ičík může zkrátit dou pohyu spermií. Jde o fenomén spotřey energie smodestrukce ičíku v hypotonickém prostředí. Od zčátku pohyu ustává pohy ičíku od konce ičíku k hlvičce, čili čím je ičík krtší, tím se může zkrcovt do pohyu. Orázek 4: Vlevo stříhání testes v Petriho misce. Vprvo testikulární sperm z rozstříhných testes po dvou hodinách uchování n ledu. 4.2.1. Závěr Metod rozstříhání testes s postupným uvolněním testikulárního spermtu poskytuje lepší, kvlitnější dozrálé testikulární sperm s neporušeným ičíkem, s vyšším procentem pohylivých spermií spermií s vyšší rychlostí. Nedosttkem je nižší výtěžnost získného spermtu. 15

Orázek 5: Vlevo umístění testes n uhelon. Vprvo mčkání/psírování testes přes uhelon s jímáním do eppendorfky. Rozstříhání testes Vymčkání testes přes uhelon Procento spermií s ičíkem 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 Mlíčáci Orázek 6: Vliv rozstříhání či vymčkání testes n procento spermií s ičíkem (průměrná hodnot se směrodtnou odchylkou souoru). Rozdílný lfetický údj v grfu vyjdřuje skutečnost, že hodnoty jsou odlišné se spolehlivostí vyšší než 95 %. 16

Procento pohylivých spermií 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Rozstříhání testes Vymčkání testes přes uhelon Vytřené sperm 15 sec 30 sec 45 sec Čs po ktivci spermií (s) Orázek 7: Vliv rozstříhání či vymčkání testes ve srovnání s vytřeným spermtem n procento pohylivosti spermií (průměrná hodnot se směrodtnou odchylkou souoru). Rozdílný lfetický údj v grfu vyjdřuje skutečnost, že hodnoty jsou odlišné se spolehlivostí vyšší než 95 %. Rychlost pohyu spermi (µm/s) 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Rozstříhání testes Vymčkání testes přes uhelon Vytřené sperm 15sec 30 sec 45 sec Čs po ktivci spermií (s) Orázek 8: Vliv rozstříhání či vymčkání testes ve srovnání s vytřeným spermtem n rychlost pohylivosti spermií (průměrná hodnot se směrodtnou odchylkou průměru). Rozdílný lfetický údj v grfu vyjdřuje skutečnost, že hodnoty jsou odlišné se spolehlivostí vyšší než 95 %. 17

4.3. Experiment 2: Ověření vhodného testikulárního roztoku Celkem jsme ověřili zhru n 120 komincí různých roztoků s využitím NCl, KCl, CCl2, MgCl2, N2HPO4, KH2PO4, cukrózy, glukózy, včetně lncování ph n úroveň ph 7 8, z kterých uvádíme ty nejlepší v tulce č. 2, včetně odhdu procent pohylivých spermií. Ty nejúspěšnější testikulární roztoky vykázly v čse nul po 10 minutách stejné či vyšší hodnoty než kontrol čili neředěné testikulární sperm. Mezi ty testikulární roztoky se zvýšenou motilitou spermií ptřily komince 220 mm NCl + 20 mm tris, ph 7 8 dále modifikovný fosfátový pufr (PBS) se zvýšenou úrovní NCl, oshující finálně 217, 237 neo 257 mm NCl + 2,7 mm KCl + 10 mm N2HPO4 + 1,8 mm KH2PO4. Po hodině uchování došlo k rpidnímu snížení pohylivosti po třech hodinách jsme vykázli pouze ojedinělý pohy. Po 24 72 hodinách jsme zznmenli pohy spermií pouze u kontroly testikulárního spermtu neředěného (Tulk 2). Tulk 2: Nejúspěšnější testikulární roztoky v mm (milimolech) jejich vliv n motilitu spermií po uchování 0 min, 10 min, 1 h, 3 h, 24 h 72 h Složení roztoku v mm Do uchování s odhdem procent pohylivých spermií 0 min 10 min 1 h 3 h 24 h 72 h NCl 275 mm 75 80 60 70 10 15 0 0 0 NCl 300 mm 75 85 60 65 10 15 0 0 0 NCl 250 mm+10 mm KCl 80 85 60 65 10 15 0 0 0 NCl 275 mm+10 mm KCl 75 80 60 70 15 20 0 0 0 NCl 300 mm+10 mm KCl 75 80 65 70 15 25 0 0 0 NCl 220 mm+20 mm trisu, ph 7 75 85 65 75 10 15 0 0 0 NCl 220 mm+20 mm trisu, ph 8 80 85 70 20 25 0 0 0 NCl 240 mm+20 mm trisu, ph 7 75 85 60 65 10 20 0 0 0 NCl 240 mm+20 mm trisu, ph 8 75 85 65 70 10 0 0 0 KCl 300 mm 65 75 40 50 0 0 0 0 Modifikovný PBS s 217 mm 80 85 80 20 25 0 5 0 0 NCl Modifikovný PBS s 237 mm 85 90 85 90 30 35 10 15 0 0 NCl Modifikovný PBS s 257 mm 85 90 80 85 20 25 5 10 0 0 NCl Kontrol vytřené sperm 40 50 40 50 40 50 40 50 10 20 0 Kontrol testikulární sperm 70 75 75v80 75 80 70 75 70 75 45 55 4.3.1. Závěr Některé komince testikulárních roztoků měly pozitivní efekt n zlepšení úrovně motility po 10 minutách uchování. N druhé strně žádný roztok nevykázl možnost dlouhodoého uchování spermtu. Velmi dorou uchovtelnost po dou 72 hodin vykázlo testikulární sperm ez ředění. Nopk velmi šptnou uchovtelnost vykázlo vytřené sperm. 18

4.4. Experiment 3: Testování testikulárního roztoku v kominci s ktivčním roztokem Výsledky uvedené v tulce 3 jsně svědčí o vhodnosti modifikovných PBS roztoků, to oou dvou, ve srovnání s roztoky, které oshují NCl tris. Tké v přípdě testikulárních roztoků je viditelné vhodnější použití komince modifikovného PBS jko testikulárního roztoku rovněž PBS jko ktivčního roztoku. U neředěného spermtu testikulárním roztokem je viditelné, že ktivční roztok měl pozitivní vliv n ktivci testikulárního spermtu. Dále jsme zjistili, že 1 5minutové uchování v testikulárním roztoku má sttisticky průkzně pozitivní vliv n motilitu spermií, viz žluté hodnoty, oproti čsu 0 či 10minutovému uchování. 4.4.1. Závěr V testu se osvědčil komince použití testikulárního roztoku (Modifikovný PBS s 257 mm NCl) s ktivčním roztokem (nemodifikovný PBS ředěný 10x) s tím, že průkzně do krátkého přechování v imoilizčním roztoku po dou 1 5 minut pomohl zlepšit motilitu spermií. Tulk 3: Testování ktivčního roztoku ve vzě n testikulární roztok jejich vliv n motilitu spermií po uchování 0 min, 1 min, 5 min 10 min. Rozdílný lfetický údj v tulce u hodnot čsu s vyznčením modrých žlutých výsledků vyjdřuje skutečnost, že hodnoty jsou odlišné se spolehlivostí vyšší než 95 %. Aktivční roztok v mm 22 mm NCl+5 mm trisu, ph 8 22 mm NCl+5 mm trisu, ph 8 22 mm NCl+5 mm trisu, ph 8 44 mm NCl+ 5mM trisu, ph 8 44 mm NCl+ 5mM trisu, ph 8 44 mm NCl+5 mm trisu, ph 8 nemodifikovný PBS ředěný 10x nemodifikovný PBS ředěný 10x nemodifikovný PBS ředěný 10x vod z líhně vod z líhně Vod z líhně Testikulární roztok v mm Modifikovný PBS s 257 mm NCl NCl 220 mm+20 mm trisu, ph 8 Testikulární sperm neředěné Modifikovný PBS s 257 mm NCl NCl 220 mm+20 mm trisu, ph 8 Testikulární sperm neředěné Modifikovný PBS s 257 mm NCl NCl 220 mm+20 mm trisu, ph 8 Testikulární sperm neředěné Modifikovný PBS s 257 mm NCl NCl 220 mm+20 mm trisu, ph 8 Testikulární sperm neředěné Do uchování s odhdem procent pohylivých spermií 0 min 1 min 5 min 10 min 70 75 75 80 80 65 70 60 65 75 70 75 65 60 70 60 70 60 70 60 70 70 75 70 75 75 80 60 65 65 70 70 75 70 75 60 70 60 70 60 70 60 70 60 70 80 85 90 85 90 75 85 65 70 80 75 80 70 75 75 80 75 80 75 80 75 80 70 75 75 80 75 80 75 70 65 75 75 70 75 60 70 70 75 70 75 70 75 70 19

4.5. Experiment 4: Ověření výtěžnosti testikulárního spermtu propočet stndrdizce osemenění z hledisk počtu spermií n jednu jikru Celkem se nám podřilo od 4 mlíčáků při rozdělení testes n polovinu získt v prvním přípdě, tzn. z rozstříhných testes 335.10 9 spermií, v druhém přípdě při vymčkání testes přes uhelon 483.10 9 spermií. Pochopitelně výtěžnost z rozstřihných testes je nižší. Jde ovšem vesměs o spermie, které po krátkodoém smíchání s testikulárním roztokem vykzují dleko lepší prmetry pohyu. Tké se u nich nchází zhru o 25 30 % více spermií s ičíkem než u metody vymčkání. Oecně y mělo postčovt při kvlitním spermtu v řádu 0,0002.10 9 spermií n 1 jikru (tedy 200 tisíc spermií n 1 jikru). Pokud ychom všechny testes od 4 mlíčáků zprcovli metodou rozstříhání, potom výtěžnost n úrovni dvojnásoku tedy 670.10 9 spermií y měl postčovt zhru n 22 kg jiker (pokud počítáme, že v 1 g suchých jiker je 150 jiker). Pokud vezeme v úvhu odoný propočet pro vytřené sperm, potom ychom museli při průměrných hodnotách 1 ml spermtu n mlíčák průměrné koncentrci 14.10 9 spermií vytřít n 22 kg jiker 48 spermijujících mlíčáků, což jsme v prxi ž n výjimky nezznmenli. 4.5.1. Závěr Z jednoduchého propočtu je jsné, že pokud vytřeme větší kvnt jiker, nikdy nám neude stčit sperm od vytřených mlíčáků. Proto doporučujeme i při ěžných výtěrech zít 3 spermijující mlíčáky, to vždy n 20 kg jiker. Následně vyjmout testes, vložit do misky, rozstřiht n velmi droné kousky, misku zkrýt skleněnou či plstovou deskou (ne hdrem) ideálně uložit n šupinkový led s vodou neo dát do ledničky, která má mximálně 4 o C ponecht lespoň po dou 2 hodin při nízké teplotě. 4.6. Experiment 5: Testování oplozenosti s doplněním v poloprovozním pokusu V prvním experimentu jsme sttisticky porovnávli vliv dvou ktivčních médií, to vody neo ktivčního roztoku (10x ředěný roztok PBS; orázek 9). Jednoznčně průkzně se projevil zlepšený vliv ktivčního roztoku n oplozenost, to ve všech přípdech. Tké se průkzně projevil lepší oplozenost při použití testikulárního spermtu ve srovnání se spermtem vytřeným. Jko nejlepší komince se jsně ukázlo použití testikulárního spermtu inkuovného po dou jedné minuty v testikulárním roztoku, to modifikovném PBS s 237 neo 257 mm NCl. Nutno poznment, že jsme při výěru jiker měli šťstnou ruku použili kvlitní jikry, yť se to n první pohled při srovnání výsledků u vytřeného spermtu s vodou k ktivci (30 40 % oplozenosti) nemusí zdát. V poloprovozním experimentu (orázek 10) jsme použili ěžný vzorek jiker z líhně v závěru výtěrové sezóny v Nových Hrdech. Zvýšení oplozenosti v doě rýhování i v očních odech ylo dosženo díky použití testikulárního spermtu. Dleko mrkntnější zvýšení oplozenosti se projevilo použitím 10x ředěného ktivčního roztoku PBS. Testikulární roztok rovněž přinesl efekt, který ovšem sttisticky neyl potvrzen ve stádiu očních odů. U plůdku z experimentálního normálního výtěru neyl zjištěn rozdíl. 20

90 80 c c Procento oplozenosti 70 60 50 40 30 20 10 c d d VS TS TS+PBS217 TS+PBS237 TS+PBS257 0 Vod z líhně Aktivční roztok PBS 10x ředěný Orázek 9: Procento oplozenosti jiker ve stádiu 8 16 lstomer (VS vytřené sperm; TS testikulární sperm; TS+PBS217 testikulární sperm s testikulárním roztokem modifikovným PBS s 217 mm NCl; TS+PBS237 testikulární sperm s testikulárním roztokem modifikovným PBS s 237 mm NCl; TS+PBS257 testikulární sperm s testikulárním roztokem modifikovným PBS s 257 mm NCl). Rozdílný lfetický údj v grfu vyjdřuje skutečnost, že hodnoty jsou odlišné se spolehlivostí vyšší než 95 %. 80 70 60 c d c Procento 50 40 30 c VS+vod TS+vod TS+AR TS+TR+AR 20 10 0 Oplozenost Oční ody Orázek 10: Poloprovozní pokus s oplozeností jiker ve stádiu 8 16 lstomer v očních odech (VS+vod vytřené sperm ktivovné vodou; TS+vod testikulární sperm 21

ktivovné vodou; TS+AR testikulární sperm ktivovné 10x ředěným PBS; TS+TR+AS testikulární sperm s testikulárním roztokem modifikovným PBS s 257 mm NCl s ktivcí 10x ředěným PBS). Rozdílný lfetický údj v grfu vyjdřuje skutečnost, že hodnoty jsou odlišné se spolehlivostí vyšší než 95 %. 4.6.1. Závěr V prktickém pokusu se jednoznčně průkzně zlepšil výsledek oplozenosti při použití testikulárního spermtu ve srovnání s vytřeným spermtem. Dále 10x ředěný ktivční roztok PBS ve srovnání s vodou jednoznčně zlepšil výsledky oplozenosti jiker předpokládáme i líhnivost, což vyplývá z výsledků získných v očních odech. V přípdě použití testikulárního roztoku došlo k zlepšení jen částečně. 22

5. Závěr Splnili jsme vlstní zdání, to vývoj technologie uchování testikulárního spermtu štiky oecné, včetně doprcování technologie použití, která je následující: Při výtěru štiky oecné k zlepšení výsledku v oplozenosti musíme vždy používt testikulární sperm, to i v přípdě, že se nám zdá, že máme k výtěru dosttek spermtu. Oecně je sperm štiky většinou nekvlitní s nízkou pohylivostí. Doporučujeme n 10 kg jiker vytřít sperm 10 20 mlíčáků k tomu vždy přidt testikulární sperm z vypreprovných testes od 2 3 spermijujících mlíčáků. Preprci provádíme tk, že do mlé plstové či skleněné misky/kádinky přípdně s uzvírtelným víčkem o ojemu okolo 100 ml dáme testes od 2 3 mlíčáků, rozstříháme (rozšmelcujeme) n mlé kousky, přikryjeme či uzvřeme dáme n led či do ledničky (0 2 o C) minimálně n dvě hodiny mximálně n 2 dny. Nyní máme dvě možnosti jk provést osemenění ktivci spermií jiker: ) Bez použití testikulárního roztoku. Sperm z rozstříhných testes dáme do jiker. Z misky dostneme zylou část testikulárního spermtu tk, že částí jiker nplníme misku se spermtem překlopíme do zásoní mísy s jikrmi. Testikulární sperm zmícháme v jikrách přidáme ktivční roztok. Aktivční roztok PBS si uď smi připrvíme (jde o velmi levné chemikálie) neo je možné si jej ojednt npříkld u firmy Thermo Fisher Scientific či jiných firem v tletách, ty si rozpustit podle potřey. Nejlevnější vrint PBS vycházel v relci jedn tlet (24 Kč) pro příprvu 2 litrů ktivčního roztoku. Při rozpouštění tlet nepoužívejte destilovnou vodu, le vodu, kterou ěžně používáte k oplození. Aktivční roztok v poměru 1 l n 2 kg jiker vlijte do jiker zmíchejte. Při vlévání vody ještě promyjte misku s testikulárním spermtem. Jikry stále míchejte, lespoň 2 3 minuty. Následně odlepkujte jikry. ) S použitím testikulárního roztoku. Do spermtu z rozstříhných testes zmícháme 50 ml testikulárního roztoku. Testikulární roztok připrvíme tk, že rozpustíme jednu tletu PBS v 200 ml vody z líhně přidáme 1,4 g NCl. Do jedné minuty nlijeme testikulární sperm s testikulárním roztokem do jiker, velmi krátce ěhem 2 3 s promícháme zlijeme ktivčním roztokem (10x ředěným PBS, tedy 1 tlet do 2 l vody). Jikry stále mícháme po dou 2 3 minut následně odlepkujeme. Ve Vodňnech dne 31.5.2015 prof. Ing. Otomr Linhrt, DrSc. Řešitel projektu 23