9. HETEROGENNÍ KATALÝZA

9. HETEROGENNÍ KATALÝZA Úloha 9-1 Kinetiá analýza enzymové reae... 2 Úloha 9-2 Kinetiá analýza enzymové reae... 2 Úloha 9-3 Kinetiá analýza enzymové reae... 3 Úloha 9-4 Kinetiá analýza enzymové reae... 3 Úloha 9-5 Kinetiá analýza enzymové reae... 3 Úloha 9-6 Výpočet stupně přeměny enzymové reae... 4 Úloha 9-7 Výpočet přeměny enzymové reae... 4 Úloha 9-8 Výpočet onentrae enzymu... 4 Úloha 9-9 Výpočet molární ativity enzymu z integrálníh dat... 4 Úloha 9-10 Výpočet molární ativity enzymu z integrálníh dat... 5 Úloha 9-11 Výpočet molární ativity enzymu z integrálníh dat... 5 Úloha 9-12 Kinetiá analýza enzymové reae integrální data... 5 Úloha 9-13 Kinetia enzymové reae... 6 Úloha 9-14 nhibie enzymovýh reaí - plně aompetitivní inhibie... 6 Úloha 9-15 nhibie enzymovýh reaí smíšená inhibie... 7 Úloha 9-16 nhibie enzymovýh reaí částečně ompetitivní inhibie... 8 Úloha 9-17 nhibie enzymovýh reaí plně ompetitivní inhibie... 9 Úloha 9-18 nhibie enzymovýh reaí plně neompetitivní inhibie... 11 Úloha 9-19 nhibie enzymovýh reaí částečně neompetitivní inhibie... 12 Úloha 9-20 Diagnostia inhibovanýh enzymovýh reaí... 13 Úloha 9-21 Diagnostia inhibovanýh enzymovýh reaí... 13 Úloha 9-22 Diagnostia inhibovanýh enzymovýh reaí... 14 Úloha 9-23 Diagnostia inhibovanýh enzymovýh reaí... 14 Úloha 9-24 Diagnostia inhibovanýh enzymovýh reaí... 15 Úloha 9-25 Diagnostia inhibovanýh enzymovýh reaí... 16 9. Enzymové reae 1

Úloha 9-1 Kinetiá analýza enzymové reae Hodnoty počáteční ryhlosti enzymatié reae 1 E + + E 2 P + E stanovené při různýh onentraíh substrátu, jsou uvedeny v následujíí tabule: 1 10 8 υ 0 10 8 υ 0 mol dm 3 mol dm 3 s 1 mol dm 3 mol dm 3 s 1 0,0003 0,822 0,012 12,6 0,0005 1,33 0,051 17,6 0,001 2,50 0,074 18,3 0,005 8,33 0,092 18,6 (a) tanovte onstanty rovnie Mihaelise a Mentenové. (b) Ja dlouho bude trvat, než zreaguje 25 % substrátu, jehož počáteční onentrae byla (i) 1,3510 7 mol dm 3, (ii) 1,35 mol dm 3, (iii) 1,3510 3 mol dm 3? Výslede: (a) K M = 7,010210 3 mol dm 3, υ max = 2,000210 7 mol dm 3 s 1 (b) (i) 2,8 h, (ii) 468,7 h, (iii) 3,2694 h Úloha 9-2 Kinetiá analýza enzymové reae Kinetiá studie syntézy vyházejíí z yseliny valerové a pentanolu, atalyzované PEG lipasou, prováděná za onstantní onentrae enzymu ( E0 = 0,45 mg m 3, M E = 250 000 g mol 1 ) a onstantní onentrae pentanolu (0,75 mol dm 3 ), posytla tuto závislost počáteční ryhlosti υ 0 na onentrai yseliny valerové (substrátu ) 10 4 υ 0 10 4 υ 0 mol dm 3 mol dm 3 min 1 mol dm 3 mol dm 3 min 1 0,042 1,80 0,370 6,30 0,083 2,95 0,550 7,11 0,126 3,73 0,760 7,65 0,167 4,50 1,000 7,92 0,238 5,36 1,300 8,06 (a) Nareslete saturační řivu (b) tanovte K M (mol dm 3 ), υ max (mol dm 3 s 1 ) a atalytiou ativitu lipasy (s 1 ). Výslede: (a) aturační řiva: závislost υ 0 na (b) K M = 0,17564 mol dm 3 υ max = 9,253910 6 mol dm 3 min 1 = 1,542310 5 mol dm 3 s 1 2 = 8,568 s 1 10 4 υ0 10 8 6 4 2 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 9. Enzymové reae 2

Úloha 9-3 Kinetiá analýza enzymové reae Působení pepsinu na ethylester 1-arboxy-1-glutamyltyrosinu bylo sledováno při teplotě 38 C a ph = 4. Reae, terá představuje hydrolýzu peptidové vazby, byla provedena s omerčním pepsinem v onentrai 4,710 5 mol dm 3 (molární hmotnost 35500 g mol 1 ). Reae byla sledována titraí uvolněné yseliny. Hodnoty počáteční ryhlosti při různýh onentraíh substrátu jsou uvedeny v následujíí tabule. tanovte hodnoty Mihaelisovy onstanty K M a maximální ryhlosti υ max. 10 8 υ 0 10 8 υ 0 mmol dm 3 mol dm 3 s 1 mmol dm 3 mol dm 3 s 1 0,30 2,40 4,00 10,5 0,77 4,88 6,15 11,6 1,52 7,24 8,00 12,1 2,46 8,94 10,34 12,6 Výslede: K M = 1,502710 3 mol dm 3, υ max = 1,441310 7 mol dm 3 s 1 Úloha 9-4 Kinetiá analýza enzymové reae Při stejnýh podmínáh jao v předházejíím příladu (38 C ph = 4) bylo sledováno působení pepsinu na 1-arboxy-1-glutamyltyrosin: 10 8 υ 0 10 8 υ 0 mmol dm 3 mol dm 3 s 1 mmol dm 3 mol dm 3 s 1 0,25 1,16 4,5 6,64 0,62 2,43 8,0 7,55 1,60 4,42 12,4 8,06 2,70 5,60 15,6 8,27 (a) tanovte hodnoty inetiýh parametrů K M a υ max pro tento případ. (b) Vypočítejte, oli proent původně přítomného 1-arboxy-1-glutamyltyrosinu se přemění za 10 hodin, je-li jeho počáteční onentrae 0,8 mol dm 3. Výslede: (a) K M = 1,72810 3 mol dm 3, υ max = 9,188410 8 mol dm 3 s 1, (b) α = 4,13510 3 Úloha 9-5 Kinetiá analýza enzymové reae Enzymatiá hydrolýza jisté optiy ativní láty (substrátu) byla sledována měřením počáteční ryhlosti při různýh onentraíh substrátu. Ryhlost byla měřena ryhlostí změny údaje polarimetru. Byla zísána tato data: 10 6 υ 0 10 6 υ 0 mol dm 3 mol dm 3 s 1 mol dm 3 mol dm 3 s 1 0,0052 0,608 0,15 5,02 0,012 1,26 0,53 6,18 0,041 2,97 1,32 6,54 0,079 4,07 1,67 6,59 tanovte z těhto dat Mihaelisovu onstantu K M pro omplex enzym-substrát a hodnotu maximální ryhlosti υ max. Výslede: K M = 0,0529 mol dm 3, υ max = 6,810 6 mol dm 3 s 1 9. Enzymové reae 3

Úloha 9-6 Výpočet stupně přeměny enzymové reae Vypočítejte, jaého stupně přeměny dosáhnete po 2 hodináh od přidání enzymu roztou optiy ativní láty (viz předhozí úloha), provádíte-li reai (a) v oblasti nízýh onentraí, při 0 = 1,210 5 mol dm 3, (b) v oblasti vysoýh onentraí, při 0 = 1,5 mol dm 3. Výslede: (a) α = 0,6035, (b) α = 0,03265 Úloha 9-7 Výpočet přeměny enzymové reae Působení ribosafosfátisomerasy na D-ribosa-5-fosfát (substrát) bylo sledováno při teplotě 37 C a ph = 7,6. Mihaelisova onstanta má hodnotu K M = 2,710 3 mol dm 3, maximální ryhlost υ max = 3,610 7 mol dm 3 s 1. Koli substrátu se přemění za jednu hodinu, měla-li výhozí onentrae hodnotu 1,810 3 mol dm 3? Výslede: 4,73.10 4 mol dm 3 ; 26,275 % Úloha 9-8 Výpočet onentrae enzymu Při teplotě 0 C, dy je desativae trypsinu zanedbatelná, bylo sledováno trávení aseinu (substrát) trypsinem s roztoy aseinu o onentrai 1,5210 4 mol dm 3, jejihž ph bylo pufrem yselina boritá-boritan sodný udržováno na hodnotě 7,6. Pro Mihaelisovu onstantu byla nalezena hodnota K M = 710 4 mol dm 3. Při prvém pousu lesla onentrae aseinu po 35 minutáh na 80 % původní hodnoty, při druhém pousu se stejnou počáteční onentraí aseinu, avša s jinou onentraí enzymu, se za 24 minut po přidání enzymu do roztou aseinu přeměnilo 30 % aseinu. Jaý byl poměr onentraí enzymu při prvém a druhém pousu? Výslede: E0 (1)/ E0 (2) = 0,4333 Úloha 9-9 Výpočet molární ativity enzymu z integrálníh dat Pro Mihaelisovu onstantu ribonuleasy z hovězího panreasu byla při jejím působení na 3',5'thimidin (substrát) o počáteční onentrai 2 mol dm 3 při 25 C a ph = 7 zjištěna hodnota K M = 0,0014 mol dm 3. Byl sledován úbyte onentrae substrátu s časem při dvou různýh onentraíh enzymu:. E0 = 4,510 7 mol dm 3. E0 = 1,910 6 mol dm 3 τ / h α τ / min α 1 0,121 8 0,0685 2,5 0,308 15 0,128 6 0,729 38 0,324 8 0,972 69 0,586 Časová závislost stupně přeměny α je lineární. tanovte molární ativitu ribonuleasy. Výslede: 2 = 150 s 1 9. Enzymové reae 4

Úloha 9-10 Výpočet molární ativity enzymu z integrálníh dat Při studiu rozladu močoviny působením ureasy při teplotě 35 C CO(NH 2 ) 2 + 2 H 2 O = (NH 4 ) 2 CO 3 byl sledován vliv onentrae enzymu. K 10 m 3 roztou, terý obsahoval 0,00165 molu močoviny, bylo přidáváno 1 až 5 m 3 roztou ureasy (podle pousu) a množství vody, potřebné doplnění vzoru na objem 15 m 3. V 1 m 3 roztou ureasy bylo obsaženo 3,6 mg ureasy (M = 480 g mol 1 ). Reae byla přerušována po vhodně volené době přidáním přebytu 0,1 M HCl. Tím se enzym zničil a množství HCl, zbylé po neutralizai uhličitanu amonného, vytvořeného rozladem močoviny, bylo stanoveno titraí 0,1 M hydroxidem. Byla zjištěna tato data: τ /min relativní množství enzymu rozložená močovina / % 80,0 1 51,2 40,0 2 52,0 26,6 3 52,6 20,0 4 53,2 16,0 5 53,3 Množství enzymu je uváděno relativně množství enzymu přidanému při prvém pousu. Jaá je molární ativita ureasy? Mihaelisova onstanta má hodnotu K M = 0,04 mol dm 3. Výslede: 2 = 36,458 s 1 Úloha 9-11 Výpočet molární ativity enzymu z integrálníh dat Pro enzymovou reai probíhajíí podle shematu 1 E + + E 2 E + P1 + P 2 1 byla z počátečníh reačníh ryhlostí vyhodnoena Mihaelisova onstanta K M = 214 mmol dm 3. Při sledování časové závislosti onentrae substrátu bylo zjištěno, že po 1 hodině lesla jeho onentrae z počáteční hodnoty 3 µg m 3 (M = 150 g mol 1 ) na 40 % původní hodnoty. Konentrae enzymu, terý uvažovanou reae atalyzuje, byla při tomto pousu 2,1710 6 mol dm 3. Jaá je molární ativita tohoto enzymu? Výslede: 2 = 25,1 s 1 Úloha 9-12 Kinetiá analýza enzymové reae integrální data Při působení hymotrypsinu, zísaného z hovězího panreasu, na aetyl-l-tyrosinethylester (substrát ) byla při 25 C a ph = 7,8 zjištěna tato časová závislost oamžité onentrae substrátu: τ τ min mol dm 3 min mol dm 3 0 2,010 4 24,3 1,210 4 5,2 1,810 4 32,5 1,010 4 10,9 1,610 4 42,3 8,010 5 17,2 1,410 4 tanovte inetié parametry K M a υ max této enzymové reae. Výslede: K M = 7,121910 4 mol dm 3, υ max = 1,826310 5 mol dm 3 s 1 9. Enzymové reae 5

Úloha 9-13 Kinetia enzymové reae Karbonanhydrasa - enzym, podílejíí se na ustavování rovnováhy CO 2 + H 2 O = H 2 CO 3 se vyznačuje vysoou hodnotou molární ativity, 2 = 610 5 µmol substrátu (CO 2 ) na µmol enzymu za seundu. Mihaelisova onstanta má hodnotu K M = 0,0084 mol dm 3. Jaé množství enzymu (M = 30000 g mol 1 ) je zapotřebí, aby za 100 s zreagovalo 30 % substrátu, jehož počáteční onentrae byla 13 mmol dm 3? Výslede: E0 = 3,448 µg dm 3 Úloha 9-14 nhibie enzymovýh reaí - plně aompetitivní inhibie Pro plně aompetitivní inhibii probíhajíí podle shematu 1+ 2 E + E 1 + E + P 5+ 5 navrhněte rovnii popisujíí závislost ryhlosti této inhibované reae na onentrai substrátu a inhibitoru a převeďte ryhlostní rovnii do nejčastěji používanýh linearizovanýh tvarů (Lineweavera a Bura, Hanese, Eadiea). Předpoládejte, že mezi substrátem, enzymem a inhibitorem se ryhle ustavuje rovnováha. Z hodnot počátečníh ryhlostí, naměřenýh pro plně aompetitivní inhibii při různýh onentraíh substrátu a inhibitoru, uvedenýh v následujíí tabule, zjistěte hodnotu disoiační onstanty omplexu E K, a hodnoty onstant K M a υ max v závislosti na onentrai inhibitoru. Nareslete Dixonův graf a graf podle Huntera a Downse. E υ i /(mol dm 3 s 1 ) mol dm 3 = 0 = 0,008 = 0,018 = 0,030 = 0,045 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 0,0008 5,26310 5 4,24210 5 3,41510 5 2,76710 5 2,23610 5 0,0050 1,56310 4 9,11510 5 6,00010 5 4,24810 5 3,11410 5 0,0125 2,01610 4 1,04910 4 6,56010 5 4,52510 5 3,26010 5 0,0250 2,23210 4 1,10510 4 6,77210 5 4,62510 5 3,31110 5 2 E0 K K Výslede: υi =, KM = KM, υmax = υmax K + K + KM + 1 + K 1 1 K Lineweaver a Bure: M 1 K + KM 1 = + = + υi υmax υmax υmax K υ max úse směrnie K Hanes: M 1 KM K + = + = + υi υmax υmax υ max υmax K úse směrnie υ Eadie: i K K υi υi = υmax KM = υmax KM K + K + úse směrnie 9. Enzymové reae 6

Kinetié parametry (pro /(mol dm 3 )): 6 3 2,110 KM /(mol dm ) =, 3 710 + Dixonův graf: rovnoběžné přímy se stejnou směrnií: 6 3 1 1, 75 10 υmax /(mol dm s ) = 3 710 + 1 1 M 1 1 K = υ υ + + υ K i max max úse směrnie Graf Huntera a Downse: jedna hyperbola pro všehny onentrae inhibitoru: 6 υi K K M 2,110 = + K 3 = + 710 υ υ i Úloha 9-15 nhibie enzymovýh reaí smíšená inhibie Příladem typiy smíšené inhibie je případ, dy v systému dohází těmto dílčím reaím: E + 1+ E 2 1 P + E K = E + E + E + 1 3+ 3 3 E 3+ E 3+ E 3 K = K = K = Od plně neompetitivní inhibie se toto shema liší v tom, že platí K K = = α > 1 K K Najděte výraz pro ryhlost inhibované reae a pro níže uvedená experimentální data stanovte hodnoty všeh inetiýh onstant. Nareslete Dixonův graf a graf podle Huntera a Downse. 10 5 υ i / ( mol dm 3 s 1 ) mol dm 3 = 0 = 0,005 = 0,012 = 0,017 = 0,025 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 0,008 4,870 2,804 1,759 1,389 1,040 0,025 6,140 3,588 2,268 1,796 1,347 0,050 6,542 3,840 2,433 1,929 1,448 0,080 6,707 3,944 2,502 1,984 1,490 1+ 3 3+ 4 4+ 5 5+ Výslede: K υi = 2E0, K + / α K + KM + K + / α K K υmax + = υmax K + /, KM = KM α K / + α υ max = 710 5 mol dm 3 s 1, K M = 0,0035 mol dm 3, K = 0,006 mol dm 3, α = 1,2, K = 0,0072 mol dm 3, K = 0,0042 mol dm 3 9. Enzymové reae 7

7 3 1 5,04 10 υmax /(mol dm s ) = 3 7,2 10 +, K 610 3 3 3 M /(mol dm ) 4,2 10 + = 3 7,2 10 + (pro / mol dm 3 ) 1 1 K Lineweaver a Bur: M 1 K + / α KM K + 1 = + = + υi υmax υmax υmax K υmax K úse směrnie Hanes: M M υi υmax υmax υmax K υmax K úse směrnie K 1 K K + K + / = + = + α υi K K + υi Eadie: υi = υmax KM = υmax KM K + / α K + / α úse směrnie Dixonův graf: svaze sbíhavýh příme 1 KM + 1 KM = υ i υmax + + υmax K α υmax K úse směrnie Graf podle Huntera a Downse - nelineární průběh: υi K ( KM + ) = υ υ K + / α i M Úloha 9-16 nhibie enzymovýh reaí částečně ompetitivní inhibie Odvoďte (a) výraz pro ryhlost plně ompetitivní reae, probíhajíí podle shematu 1+ 2 E + + 1 E E + P 3+ 3 E (b) linearizované tvary ryhlostní rovnie podle (i) Hanese, (ii) Lineweavera a Bura, (iii) Eadiea, () Pro data uvedená v následujíí tabule vypočítejte inetié parametry υ max, K M a K uvažované inhibované reae υ i / ( mol dm 3 s 1 ) mol dm 3 = 0 = 0,005 = 0,012 = 0,032 = 0,084 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 0,014 1,71810 6 1,65410 6 1,57110 6 1,37510 6 1,03810 6 0,038 3,82810 6 3,71010 6 3,55510 6 3,17810 6 2,49010 6 0,124 7,60910 6 7,46410 6 7,26910 6 6,76610 6 5,73310 6 0,340 1,05310 5 1,04310 5 1,02810 5 9,90410 6 9,03510 6 (d) Zonstruujte Dixonův graf a graf podle Huntera a Downse. 9. Enzymové reae 8

2E0 Výslede: (a) υi =, KM 1+ + K (b) Linearizované tvary: 1 1 K Lineweaver a Bur: M 1 1 KM K + 1 = + = + υi υmax υmax υ max υmax K Hanes: úse směrnie K 1 K K 1 = + = + + υ υ υ υ K υ M M i max max max max úse směrnie υi K + υ Eadie: υi υmax KM i = = υ max KM K úse směrnie () υmax = υmax = 1,35010 5 mol dm 3 s 1 K M = 0,0960633 mol dm 3, K = 0,1121 mol dm 3 K K + M = KM = 0,09606 + 0,85694 K 1 1 M M (d) Dixonův graf - svaze sbíhavýh příme: 1 K K = υi υ + max + υmax K úse směrnie Graf podle Huntera a Downse - svaze sbíhavýh příme: υi K = K + υ υi KM úse směrnie Úloha 9-17 nhibie enzymovýh reaí plně ompetitivní inhibie Pro jistou enzymovou reai bylo navrženo shema 1+ 2 E + E E + P + 1 + 2 = 6 3+ 3 5+ 5 4+ 6 E + E E + P 4 teré popisuje částečně ompetitivní inhibii. (a) Odvoďte vztah pro ryhlost této inhibované reae a porovnejte výrazy pro zdánlivé onstanty a υ s KM a υ max neinhibované reae K M max (b) Odvoďte linerizované výrazy (i) podle Lineweavera a Bura, (ii) podle Hanese, (iii) podle Eadiea. () Z hodnot počátečníh ryhlostí, naměřenýh při různýh onentraíh substrátu a inhibitoru, stanovte hodnoty onstant v ryhlostní rovnii. (d) estrojte graf (i) podle Dixona, (ii) podle Huntera a Downse. Ja rozlišíme plně ompetitivní inhibii od částečně ompetitivní? 9. Enzymové reae 9

10 5 υ i / (mol dm 3 s 1 ) mol dm 3 = 0 = 0,013 = 0,027 = 0,075 = 0,109 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 0,012 5,778 4,841 4,785 4,749 4,733 0,090 6,393 6,216 6,204 6,195 6,192 0,260 6,463 6,399 6,394 6,391 6,390 0,380 6,474 6,430 6,427 6,425 6,424 Výslede: 2 E0 (a) υi = K + KM + / + K α (b) Linearizae: (i) Lineweaver a Bur:, υmax = 2 E0 = υmax, K M M + K = K K + α 1 1 KM 1 1 KM K + 1 = + = + υi υmax υmax υ max υmax K + / α úse směrnie / K (ii) Hanes: M 1 KM K + 1 = + = + υi υmax υmax υmax K + / α υ max úse směrnie (iii) Eadie υi K + υ υi υmax KM i = = υ max KM K + / α úse směrnie () υ max = υ max = 6,50010 5 mol dm 3 s 1, K M = 1,499110 3 mol dm 3 K = 6,752810 4 mol dm 3, α = 3,014 K = 2,035110 3 mol dm 3 K = 4,517910 3 mol dm 3 (K = K M ) K 4 3 6,7528 10 + M = 4,518310 3 2,0353 10 + (d) (i) Dixonův graf je nelineární- tím lze rozlišit částečně ompetitivní inhibii od inhibie plné, jejíž Dixonův graf je lineární (viz Úloha 9-16) 1 1 KM 1 K + = + υ υ υ K + / α i max max (ii) Graf podle Huntera a Downse - je lineární, svaze sbíhajííh se příme υi ( α K + ) ( α K + ) = + υ υi ( α 1) KM ( α 1) úse směrnie 9. Enzymové reae 10

Úloha 9-18 nhibie enzymovýh reaí plně neompetitivní inhibie Enzymová reae probíhá za přítomnosti inhibitoru podle následujíího shématu: 1+ 2 E + E + 1 + E + P 3+ 3 4+ 5+ 5 E + E 4 (a) Odvoďte vztah pro ryhlost inhibované reae. Ja ovlivňuje tato plně neompetitivní inhibie hodnoty parametrů K M a υ max v porovnání s neinhibovanou enzymatiou reaí? (b) Odvoďte linearizované tvary ryhlostní rovnie podle (i) Lineweavera a Bura, (ii) Hanese, (iii) Eadiea a vypočítejte hodnoty inetiýh parametrů K M, υ max, K M, υ max a K. () Pomoí závislostí podle (i) Dixona, (ii) Huntera a Downse uažte ja lze rozlišit plnou a částečnou ompetitivní inhibii. υ i / ( mol dm 3 s 1 ) = 0 = 0,01 = 0,02 = 0,03 = 0,04 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 0,026 4,51410 7 2,13810 7 1,40110 7 1,04210 7 8,29110 8 0,108 1,45910 6 6,91310 7 4,52910 7 3,36810 7 2,68110 7 0,340 2,82410 6 1,33810 6 8,76410 7 6,51710 7 5,18710 7 0,570 3,42510 6 1,62310 6 1,06310 6 7,90510 7 6,29210 7 Výslede: (a) υ i K 2E0 υ max K + = = K + K + M M K =, υmax = υmax K +, KM KM (b) Linearizae 1 1 K (i) Lineweavera a Bura: M 1 K + KM K + 1 = + = + υi υmax υmax υmax K υmax K úse směrnie K (ii) Hanese M 1 KM K + K + = + = + υi υmax υmax υmax K υmax K úse směrnie υ (iii) Eadiea i K υ υi υmax KM i = = υmax KM K + úse směrnie υ max = 510 6 mol dm 3 s 1, K M = 0,262 mol dm 3, K = 9 10 3 mol dm 3 9 3 1 4,5 10 υmax /(mol dm s ) = 3 910 + 1 1 KM 1 KM ()(i) Dixonův graf je lineární: = 1 1 υi υ + max + + υmax K úse směrnie υi (ii) Graf podle Huntera a Downse = K - jediná příma pro všehny onentrae υ υi inhibitoru. 9. Enzymové reae 11

Úloha 9-19 nhibie enzymovýh reaí částečně neompetitivní inhibie O jisté enzymové reai se předpoládá, že probíhá podle shématu 1+ 2 E + E E + P + 1 + 3+ 3 4+ 5+ 5 6 E + E E + P 4 teré popisuje částečně neompetitivní inhibii. Vyjádřete (a) ryhlost reae jao funi onentrae substrátu a inhibitoru, (b) nejčastěji používané linearizované tvary ryhlostní rovnie () Z dat uvedenýh v následujíí tabule vypočítejte inetié parametry inhibované i neinhibované reae υ i / ( mol dm 3 s 1 ) mol dm 3 = 0 = 0,0053 = 0,012 = 0,025 = 0,060 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 0,025 7,05410 6 6,00810 6 5,44210 6 4,97910 6 4,60010 6 0,110 2,29410 5 1,95410 5 1,77010 5 1,62010 5 1,49610 5 0,250 3,64810 5 3,10710 5 2,81410 5 2,57510 5 2,37910 5 0,550 4,88310 5 4,15910 5 3,76610 5 3,44610 5 3,18410 5 (d) estrojte grafy podle Dixona a podle Huntera a Downse. K + β 2 E0 Výslede: (a) υi = K + KM + (b) Linearizae podle 1 1 K (i) Lineweavera a Bura: M 1 1 K + KM K + 1 = + = + υi υmax υmax υmax K + β υmax K + β úse směrnie K (ii) Hanese M 1 KM K + 1 K + = + = + υi υmax υmax υmax K + β υmax K + β úse směrnie υ (iii) Eadiea i K + β υi υi = υmax KM = υmax KM K + úse směrnie () υ max = 6,810 5 mol dm 3 s 1, K M = 0,216 mol dm 3, K = 0,009 mol dm 3, β = 0,6 7 5 6,12 10 + 4,0810 max = 3 910 + υ 1 ( KM + ) ( K + ) (d) (i) Dixonův graf je nelineární: = υ υ ( K + β ) i max υi K + β (ii) Graf podle Huntera a Downse = υ υ β i 1 - soustava rovnoběžnýh příme 9. Enzymové reae 12

Úloha 9-20 Diagnostia inhibovanýh enzymovýh reaí Při syntéze purinů byl sledován vliv azaserinu, terý má inhibiční účiny: 0,005 0,008 0,012 0,018 0,022 0,035 0,048 0,060 10 6 υ 1,000 1,429 1,875 2,368 2,620 3,182 3,530 3,750 10 6 υ i = 0,004 = 0,012 = 0,03 = 0,05 0,937 1,344 1,772 2,250 2,493 3,045 3,390 3,609 0,831 1,200 1,594 2,040 2,271 2,802 3,138 3,355 0,662 0,968 1,300 1,690 1,894 2,377 2,690 2,900 0,540 0,797 1,080 1,418 1,600 2,034 2,324 2,516 υ je počáteční ryhlost neinhibované enzymové reae (mol dm 3 s 1 ), υ i počáteční ryhlost enzymové reae za přítomnosti inhibitoru (mol dm 3 s 1 ), onentrae substrátu (mol dm 3 ), onentrae inhibitoru (mol dm 3 ). Posuďte harater inhibičního účinu azaserinu, najděte rovnii popisujíí závislost počáteční ryhlosti na onentrai substrátu a inhibitoru a stanovte hodnoty onstant. υmax K Výslede: míšená inhibie: υi = K + α K + KM + K + / α υ max = 510-6 mol dm 3 s 1 ; K M = 0,02 mol dm 3 ; K = 0,051 mol dm 3, α = 3 Úloha 9-21 Diagnostia inhibovanýh enzymovýh reaí Působení enzymu arginasy na substrát argirin bylo při teplotě 37 C a ph 8,4 sledováno jedna za přítomnosti, jedna za nepřítomnosti norvalinu, terý má inhibiční účine. Výsledy byly vyjádřeny poměrem hodnot ryhlostí υ/υ i (v nepřítomnosti inhibitoru υ, za přítomnosti inhibitoru υ i ) pro různé onentrae inhibitoru a substrátu: (argirin) mol dm 3 0,0223 0,0667 0,0445 (norvalin) mol dm 3 0,0890 0,0445 0,0178 0,0334 0,0179 0,0083 0,0890 0,0445 0,0178 υ/υ i 3,67 2,34 1,53 2,03 1,54 1,25 3,74 2,36 1,54 Na záladě těhto dat posuďte, zda norvalin má plně ompetitivní nebo neompetitivní účine a stanovte inhibiční onstantu (onstanty). Výslede: Plně neompetitivní, υ = = K υ υ υ/υ i i i 1 = 0,033 mol dm 3 9. Enzymové reae 13

Úloha 9-22 Diagnostia inhibovanýh enzymovýh reaí nhibie působení arginasy na argirin, vyvolaná přítomností ornithinu byla sledována při teplotě 37 C a ph 8,4 měřením počátečníh reačníh ryhlostí při různýh onentraíh argirinu a inhibitoru. Poměr počáteční ryhlosti v nepřítomnosti inhibitoru (υ) a v přítomnosti inhibitoru (υ i ) je uveden ve třetím sloupi následujíí tabuly: (argirin) (ornithin) υ/υ i mol dm 3 mol dm 3 0,0223 0,0890 0,0445 0,0223 0,0111 9,1 5 2,9 1,89 (argirin) (ornithin) υ/υ i mol dm 3 mol dm 3 0,0667 0,0667 0,0334 0,0167 0,00834 3,44 2,17 1,61 1,30 0,0297 0,0445 0,0297 0,0148 0,0074 0,0445 0,0223 0,0111 3,06 1,98 1,47 3,33 2,18 1,57 0,089 0,0890 0,0445 0,0223 0,0111 0,00556 3,42 2,20 1,63 1,31 1,16 Rozhodněte, zda se jedná o plně ompetitivní nebo plně neompetitivní inhibii a stanovte hodnoty disoiačníh onstant pro systém arginasa-argirin (K M ) a arginasa-ornithin (K ). Výslede: Graf podle Dixona je přímový pro oba případy. Plně ompetitivní a plně neompetitivní je možno odlišit závislostí podle Huntera a Downse výraz υ i /( υ υ i ) je lineárně závislý na, inhibie je plně ompetitivní: υ K υ υ υ/υ K i = = K + i i 1 M (pro plně neompetitivní inhibii nezávisí na onentrai inhibitoru ani na onentrai substrátu) K = 3,65110 3 mol dm 3 K M = 0,01009 mol dm 3 Úloha 9-23 Diagnostia inhibovanýh enzymovýh reaí Analýzou inetiýh dat zísanýh sledováním enzymatiého působení hexainasy (M = 380 g mol 1 ) na substrát při onentrai enzymu 4,75 mg dm 3 byla zjištěna pro Mihaelisovu onstantu hodnota K M = 0,0035 mol dm 3, pro moleulární ativitu enzymu hodnota 2 = 250 s 1. Z hodnot počátečníh reačníh ryhlostí naměřenýh za přítomnosti gluosa-6-fosfátu (viz tabula) určete povahu inhibičníh účinů gluosa-6-fosfátu, sestavte rovnii pro závislost ryhlosti inhibované reae na onentrai substrátu a inhibitoru a stanovte hodnoty onstant této rovnie. Porovnejte průběh saturační řivy neinhibované a inhibované reae. 9. Enzymové reae 14

10 6 υ i / (mol dm 3 s 1 ) mol dm 3 = 2,510 4 = 6,810 4 = 210 3 = 710 3 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 mol dm 3 0,0003 0,0015 0,0027 0,0039 0,0043 0,0058 0,0090 0,0120 0,227 0,863 1,253 1,517 1,587 1,795 2,072 2,228 0,210 0,800 1,160 1,404 1,468 1,660 1,917 2,062 0,192 0,729 1,058 1,280 1,340 1,516 1,750 1,882 0,179 0,682 0,990 1,198 1,253 1,417 1,636 1,760 Výslede: Průběh saturačníh řive odpovídá buď neompetitivní inhibii (obr. 9.8a) nebo inhibii smíšené (obr. 9.10a). Dixonův graf má hyperboliý průběh inhibie je částečně neompetitivní. K = 710 4 mol dm 3, β = 0,7 Úloha 9-24 Diagnostia inhibovanýh enzymovýh reaí Byl zoumán vliv různýh inhibitorů na enzymové působení dehydrogenasy na pyrohroznan. Pro neinhibovanou reai byly zjištěny onstanty K M = 0,01 mol dm 3 a υ max = 2,510 5 mol dm 3 s 1. Všehny tři testované inhibitory mají aompetitivní účiny. Při onentrai pyrohroznanu 0,02 mol dm 3 byly zísány tyto hodnoty počátečníh ryhlostí enzymové reae (v mol dm 3 s 1 ): 10 5 υ i mol dm 3 inhibitor A inhibitor B inhibitor C 0,003 0,010 0,022 0,035 0,060 1,515 1,250 0,961 0,769 0,556 1,375 1,053 0,839 0,739 0,652 1,626 1,538 1,400 1,290 1,111 Na záladě těhto dat rozhodněte, jde-li o inhibii plnou nebo částečnou a v případě plné inhibie stanovte hodnoty inhibičníh onstant K. Výslede: Dixonův graf je lineární v případě inhibitorů A a C, hyperboliý u inhibitoru B. 3 A: plná inhibie, K = 0,02 mol dm B: částečná inhibie, 3 C: plná inhibie, K = 0,08 mol dm 9. Enzymové reae 15

Úloha 9-25 Diagnostia inhibovanýh enzymovýh reaí Působení lysozymu (molární hmotnost 14300 g/mol, moleulární ativita 2 = 0,5 s 1 ) v onentrai 0,858 mg m 3 na substrát bez přítomnosti inhibitoru je haraterizováno Mihaelisovou onstantou K M = 0,085 mol dm 3. Pro tutéž enzymovou reai byly v přítomnosti inhibitoru naměřeny hodnoty počátečníh reačníh ryhlostí υ i [mol dm 3 s 1 ] při různýh onentraíh substrátu (v mol dm 3 ) a inhibitoru v (mol dm 3 ): 10 6 υ i 10 6 υ i 0,007 0,005 0,01 0,05 0,09 0,15 2,102 1,954 1,334 1,082 0,898 0,075 0,005 0,01 0,05 0,09 0,15 13,400 12,824 9,983 8,588 7,458 0,03 0,005 0,01 0,05 0,09 0,15 7,323 6,900 4,990 4,147 3,506 0,12 0,005 0,01 0,05 0,09 0,15 16,909 16,330 13,314 11,726 10,385 Zjistěte, jaý typ inhibie tento inhibitor vyvolává, navrhněte ryhlostní rovnii a stanovte hodnoty inhibičníh onstant. Výslede: částečně ompetitivní inhibie υmax υi = K + KM + K + / α K + KM = KM K + α /, υ max = υ max = 310 5 mol dm 3 s 1 K = 0,042 mol dm 3, α = 5 /( mol dm 3 ) K M ) υ max /(mol dm 3 s 1 ) 0 0,08500 3,000010 5 0,005 0,09290 2,999910 5 0,01 0,10048 3,000510 5 0,05 0,15044 3,000710 5 0,09 0,18721 3,002210 5 0,15 0,22719 3,004910 5 9. Enzymové reae 16