Stanovení PNH klonů průtokovou cytometrií Iuri Marinov, ÚHKT, Praha Motolský minikurz - Praha, 2015
Přežití (%) Paroxysmální noční hemoglobinurie (PNH)- vzácné onemocnění s život ohrožujícími komplikacemi 100 Přežití po stanovení diagnózy (1) 2-6 případů/milion/ročně (3) Úmrtnost do 5 let: 35% (1) Výskyt u všech věkových skupin (med=30 let) (4,5) 80 60 40 Kontrolní skupina (věk / pohlaví) Nízká kvalita života (1,6) 20 Nemocní s PNH Progrese onemocnění (1,2) 0 0 5 10 15 20 25 Roky (1) Hillmen P et al. NEJM 1995; 333:1253-8; (2) Parker C et al. Blood 2005;106(12):3699-709; (3) Hill A et al. Blood 2006;108:985; (4) Moyo VM et al. BJH 2004;126:133-38; (5) Nishimura J et al. Med 2004;83:193 207; (6) Socié G et al. Lancet 1996;348:573-7; (7) Peffault de Latour R et al. Blood 2008;112(8):3099-106.
PNH- patofyziologie Somatická mutace v genu pig-a, který kóduje protein nezbytný pro iniciální fázi syntézy GPI-kotvy 1,2 Částečný nebo kompletní deficit GPI-kotvených proteinů CD59 GPI kotva CD55 1. McKeage K. Drugs. 2011;71(17):2327-2345. Adapté de : Johnson RJ et al. J Clin Pathol: Mol Pathol. 2002;55:145-152. 2. Brodsky R. Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria. dans : Hematology - Basic Principles and Practices. 4th ed. R Hoffman; EJ Benz; S Shattil et al. eds. Philadelphie, PA: Elsevier Churchill Livingstone; 2005;419-427.
PNH- patogeneze Absence povrchových antigenů CD55 a CD59 vede k deficitu inhibičních systémů aktivovaného komplementu
Expanze PNH klonu 1 1 etapa Somatická mutace v genu PIG-A 2 etapa Imunitní ataka proti GPI kotveným proteinům 3 etapa Selekce, růst, expanze PNH klonu 1. Adaptováno od Inoue N et al. Int J Hematol. 2003;77:107-112.
Chronická hemolýza hlavní příčina klinických komplikací a úmrtnosti Trombóza Renální insuficience Plicní hypertenze Vliv na celkové přežití Aktivace komplementu Mezenteriální trombóza Dyspnoe Dysfagie Volný hemoglobin/anémie NO (oxid dusnatý) Únava Hemoglobinurie Nevýkonnost Vliv na kvalitu života 1. International PNH Interest Group. Blood. 2005;106:3699-3709. 2. Brodsky R. Hematology - Basic Principles and Practices. 4th ed. 2005;419-427. 3. Rother RP et al. JAMA. 2005;293:1653-1662. 4. Socie G et al. Lancet. 1996;348:573-577. 5. Hill A et al. Br J Haematol. 2007;137:181-192. 6. Lee JW et al. Hematologica. 2010;95(s2): Abstract #505 and 506. 7. Hill A et al. Br J Haematol. 2010; May;149(3):414-425. 8. Hillmen P et al. Am J Hematol. 2010;85: 553-559.
Proč provádět PNH screening 35% pacientů umírá v rámci 5 let i přes podpůrnou terapii Časný záchyt ovlivňuje terapeutickou strategii a úspěšnost léčby u PNH s aplazií kostní dřeně Přítomnost PNH klonů u PNH s aplazií KD předpovídá odpověď na imunosupresivní terapii Může dojit k nárůstu malých PNH klonů V současné době existuje efektivní terapie (1) Hillmen P et al. NEJM 1995; 333:1253-8; (2) Sugimori C et al. Blood 2006;107:1306-1314
Průtoková cytometrie - časová osa Od r. 1990 - implementace FCM Od r. 1996 - metoda volby pro stanovení PNH klonů Od r. 2010 - ICCS guidelines Od r. 2012 - Practical guidelines: podklad pro standardizaci Od r. 2013 - Harmonizace a Standardizace Od r. 2014 - Nové techniky
Validace PNH vyšetření Pre-analytické požadavky - požadavky na vzorek (odběr, skladování, doprava ) - požadavky na reagencie (selekce klonů, titrace MoAb, výběr vhodných kontrol) Analytické požadavky - linearita a preciznost hodnot relativní fluorescence - rozlišení slabě positivních populací - reprodukovatelnost výsledků měření - reprodukovatelnost výsledků v čase a sérii v jednotlivých a mezi jednotlivými laboratořemi (harmonizace, standardizace) Post-analytické požadavky - přesnost: porovnávání k očekávaným výsledkům - specifičnost: série měření ve vztahu k referenční metodě - citlivost: schopnost odlišit abnormální populaci od normálních populací - opakovatelnost (v sérii) mezilehlá preciznost (mezi sériemi) - odhad nejistoty výsledků měření (alespoň formou mezilehlé preciznosti)
Pre-analytické požadavky- požadavky na vzorek Materiál Antikoagulační činidlo Množství Stabilita vzorku Skladování Periferní krev EDTA nebo heparin 1-3 ml 7 dní pro Ery, 48 h pro Leuko 4 o C po 24 h Lyzační činidlo Ery - neprovádí Komerční lyzační roztok, NH4Cl Cílové populace Ery Granulocty Monocyty pro konfirmaci Lymfocyty nevyšetřujeme 1. Borowitz et al.;cytometry 2010;178B;211-230. 2. Sutherland et al. ;Cytometry 2012; 82B;195-208. 3. Marinov et al.;cytometry 2013;84B;229-236.. 4. Sutherland et al. Cytometry 2014:. 5. Marinov et al.;ijlh:2014 accepted
Doporučené reagencie pro analýzu PNH Ery 2 barevný test: CD235a-FITC / CD59-PE CD235a optimální pro gate na Ery CD235a způsobuje agregaci Ery (nutná titrace) FITC je preferovaný fluorochrom CD59 vykazuje lepší signal:noise poměr PE je preferovaný fluorochrom pro CD59 CD55 se nedoporučuje - slabá intenzita signálu (nízká epitopová denzita) - špatné rozlišení PNH Erytrocytů typu II a III 1. Borowitz et al.;cytometry 2010;178B;211-230. 2. Sutherland et al. ;Cytometry 2012; 82B;195-208.
Doporučené reagencie pro analýzu PNH Leuko Reagencie Buňky 1 2 3 4 5 6 4 barevný G FLAER CD24 CD15 CD45 4 barevný M FLAER CD14 CD64 (33) CD45 4 barevný G+M FLAER CD24 CD14 CD33 5 barevný G+M FLAER CD24 CD14 CD15 CD45 5 barevný G+M FLAER CD24 CD14 CD15 CD64/33 5 barevný G+M FLAER CD157 CD15 CD45 CD64 6 barevný G+M FLAER CD24 CD14 CD15 CD45 CD64 6 barevný G+M FLAER CD24 CD14 CD15 CD45 CD33 GPI- reagencie Reagencie na gate 1. Borowitz et al.;cytometry 2010;178B;211-230. 2. Sutherland et al. ;Cytometry 2012; 82B;195-208.
Doporučené klony pro PNH Leuko Cílová populace Ery Leuko MP / Fluorochrom (BD/BC) Význam Becton Dickinson Beckman Coulter CD59 (PE/PE) GPI-kotvený MEM-43 OV9A2 CD235a (FITC/FITC) CD15 (APC/PC5) CD15 (efluor450) Gate na Ery KC16 JC159 MEM-43 OV9A2 KC16 JC159 Gate na Gr H198 80H5 Gate na Gr MMA MMA FLAER GPI-kotvený NA NA CD24 (PE/PE) GPI-kotvený SN3 ML5 CD64 (APC/PC5) SN3 ALB9 Gate na Mo 10.1 22 CD14 (PE/PE) GPI-kotvený 61D3 MφP9 61D3 RMO52 CD157 (PE/PE) GPI-kotvený SY11B5 SY11B5 CD45 (PerCP- Cy5.5/PC7 Vyloučení debris 2D1 J33 Sutherland et al.; Cytometry; 2012; 82B:195-208
Pre-analytické požadavky- požadavky na reagencie Titrace monoklonálních protilátek Snížení množství Sériové ředění
Analytické požadavky Linearita a preciznost hodnot relativní fluorescence Rozlišení slabě positivních populací Reprodukovatelnost výsledků měření Reprodukovatelnost výsledků v čase a sérii v jednotlivých a mezi jednotlivými laboratořemi
Analytické požadavky Plně automatizovaný proces pro digitální přístroje: Baseline setting (1-2 krát do roka, kdykoliv po údržbě): 10-15 min - kontrola linearity - kontrola citlivosti - nastavení PMT voltage - nastavení optického pozadí - optimalizace elektronického šumu - nastavení cílových hodnot fluorescenční intenzity pro optimální rozlišení - nastavení časové prodlevy laserů (BD přístroje) Performance check (denně): 5 min - stanovuje a koriguje odchylky od základního (baseline) nastavení
Analytické požadavky Nastavení pro specifickou aplikaci (application setting): - area scaling (korekce hodnot pro FS-area a FS-height ) - optimalizace PMT signálů - digitální korekce spektrálního přísvitu PNH- kontrola nastavení cytometru na lymfocytech B-ly PNH Ly Ba T-ly
Post analytické požadavky Přesnost - shoda mezi průměrnými hodnotami získanými z velkého počtu měření a příslušnou referenční hodnotou - není aplikovatelná pro FCM testy (chybí referenční materiál) Specifičnost - analytická specifičnost (MP) - klinická specifičnost: testování série vzorků a hodnocení abnormality ve srovnání s příslušnou referenční metodou (série měření ve vztahu k referenční metodě) Citlivost - schopnost odlišit abnormální populaci od normálních populací - diluční testy 1. Barnett et al.; Cytometry 2013; 84B; 309-314 1. Wood et al.;cytometry 2013;84B;315-323
Post analytické požadavky Nepřesnost 1,2 - opakovatelnost: > 5 vzorků připravit a 3 krát změřit v jednom pracovním cyklu. CV <10% (<20% pro populace < 0.1%) - mezilehlá preciznost: > 5 vzorků 3 krát připravit a 3 krát změřit v samostatných pracovních cyklech (restart a re-kalibrace přístroje). CV <10% (<20% pro populace < 0.1%) Účast v cyklech EKK a/nebo MLP 3 1. Barnett et al.;cytometry 2013; 84B; 309-314 2. Wood et al.;cytometry 2013;84B;315-323., 3. Marinov et al.;cytometry 2013;84B;229-236.
Post analytické požadavky Hlášení výsledků - velikost PNH klonů v Ery, Gr a Mo populacích - vždy uvádět aktuální citlivost vyšetření (LOD) - používat správnou terminologii > 1% PNH clone 0.1-1% Minor PNH clone 0.1% Rare cells with GPI deficiency
PNH Ery: 2 barevný test Periferní krev (EDTA) vždy ředit 1:100 50-100 µl výchozího ředění na test Přidáváme příslušné množství titrovaných CD59-PE a CD235a-FITC Inkubujeme ve tmě při pokojové teplotě cca 20 minut Nutno promýt v PBS Nastavení objemu na 0.5-1ml (PBS) Důkladně protřepat!!! (< 2% agregátů) Akvizice na průtokovém cytometru
PNH Ery- ruční nastavení cytometru Nastavení Light scatter and PMT Optimalizace FS a SS neznačených Ery v Log : Log scatter plotu Gate na singlety Vynulovat kompenzační nastavení Nastavit PMT pro FL-1 a FL-2 pro optimální zobrazení Ery
PNH Ery- ruční nastavení cytometru Akvizice CD59 značených Ery a nastavit FL1 Fl2 kompenzace Akvizice CD235 značených Ery a nastavit FL2 FL1 kompenzace
PNH Ery- ruční nastavení cytometru Akvizice CD235a a CD59 značených Ery a stanovit umístění normálních Ery ( typ I) Akvizice vyšetřovaného vzorku
PNH Ery- automatické nastavení cytometru Korekce signálů pro FS-area a FS-height Nastavení PMT (> 2,5 rsd z baseline) Digitální kompenzace spektrálního přísvitu
PNH Ery Nefiltrované PBS!!!
PNH Ery Poorly stained normal RBC Courtesy of A. Illingworth Hodnocení z dot plot, z histogramu méně přínosné
PNH Ery-výkonnostní charakteristiky Clone size PNH clone N* Min. Max. Mean SD CV (%) >20% RBC II+III 3/10 33.2/32.3 33.6/33.6 33.5/32.8 0.2/0.4 0.5/1.2 1-20% RBC II+III 3/10 11.8/2.5 11.8/3 11.8/2.8 0.1/0.1 0.6/5.3 <1% RBC II+ III 3/10 0.4/0.4 0.4/0.4 0.4/0.4 0.0/0.0 4.1/6.1 * Opakovatelnost v sérii / mezilehlá preciznost Marinov et al.;clin HemLab Med, 2013; 51: 2133-2139 Marinov et al.;clinlab, 2014;60:;217-224.
PNH Ery-mezilaboratorní opakovatelnost v sérii PNH Ery type III (big clone)-precision analysis PNH Ery type III (small clone)-precision analysis PNH Ery type III (minor clone)-precision analysis 53 52 51 50 49 48 47 46 45 44 43 Ref. center 1 2 3 4 14 13 12 11 10 9 8 Ref. center 1 2 3 4 0.75 0.70 0.65 0.60 0.55 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 Ref. center 1 2 3 4 > 20% Ref. center 1 2 3 4 1. 46,87 47,85 47,71 49,28 49,84 2. 46,38 48,37 47,70 48,65 48,58 3. 47,02 48,14 47,38 48,71 47,76 Mean 46,76 48,12 47,60 48,88 48,73 SD 0,27 0,21 0,15 0,28 0,86 CV 0,58 0,44 0,32 0,58 1,76 5%- 20% Ref. center 1 2 3 4 1. 10,10 11,16 10,45 11,48 9,91 2. 9,96 10,77 10,59 11,72 9,95 3. 10,24 10,86 10,39 11,45 10,44 Mean 10,10 10,93 10,48 11,55 10,10 SD 0,11 0,17 0,08 0,12 0,24 CV 1,13 1,53 0,80 1,05 0,24 < 1% Ref. center 1 2 3 4 1. 0,44 0,37 0,40 0,48 0,40 2. 0,39 0,39 0,41 0,49 0,42 3. 0,42 0,47 0,42 0,44 0,38 Mean 0,42 0,41 0,41 0,47 0,40 SD 0,02 0,04 0,01 0,02 0,02 CV 4,93 10,54 1,99 4,60 4,08 Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B; 229-236
PNH Ery-mezilaboratorní mezilehlá preciznost PNH Ery type III (big clone)- reproducibility 60 PNH Ery type III (minor clone)-reproducibility 0.8 55 50 0.6 0.4 45 40 0.2 35 Ref. center 1 2 3 4 0.0 Ref. center 1 2 3 4 > 20% Ref. 1 2 3 4 1. 46,12 48,56 49,06 51,34 48,85 2. 47,64 47,96 48,58 50,71 48,95 3. 48,10 48,61 47,66 49,98 49,49 4. 47,58 47,93 46,95 50,65 48,97 5. 46,73 47,76 46,86 50,42 49,27 Mean 47,23 48,16 47,82 50,62 49,11 SD 0,71 0,35 0,87 0,44 0,24 CV 1,51 0,73 1,83 0,87 0,48 Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B; 229-236 5%- 20% Ref. 1 2 3 4 1. 10,27 11,59 11,01 10,97 10,59 2. 10,69 11,27 10,88 12,49 10,76 3. 10,67 11,07 10,83 11,50 10,86 4. 10,11 11,34 10,97 11,44 10,99 5. 9,97 11,12 10,49 11,30 10,86 Mean 10,34 11,28 10,84 11,54 10,81 SD 0,29 0,18 0,18 0,51 0,13 CV 2,82 1,63 1,70 4,41 1,23 < 1% Ref. 1 2 3 4 1. 0,45 0,42 0,44 0,47 0,46 2. 0,42 0,44 0,44 0,44 0,46 3. 0,48 0,42 0,45 0,50 0,43 4. 0,44 0,44 0,45 0,48 0,40 5. 0,39 0,38 0,41 0,43 0,36 Mean 0,44 0,42 0,44 0,46 0,42 SD 0,03 0,02 0,01 0,03 0,04 CV 6,90 5,22 3,36 5,55 9,04
PNH Ery- lineární regrese 60 50 40 30 20 10 0 60 50 40 30 20 10 0 Ref. center vs center 1 (RBC) y = 1,0227x R² = 0,9999 0 10 20 30 40 50 60 Pearson r: 1.0000 Pearson r: 1.0000 Ref. center vs center 3 (RBC) y = 1,0387x R² = 0,9997 0 10 20 30 40 50 60 Pearson r: 0.9999 Pearson r: 1.0000 Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B; 229-236 60 50 40 30 20 10 0 60 50 40 30 20 10 0 Ref. center vs center 2 (RBC) y = 1,0092x R² = 1 0 10 20 30 40 50 60 Ref. center vs center 4 (RBC) y = 1,0157x R² = 1 0 10 20 30 40 50 60
PNH Ery- Bland Altmann Wilcoxon rank test: P= 0,08 (> 0.05) Wilcoxon rank test: P= 0,06 (> 0.05) Wilcoxon rank test: P= 0,053 (> 0.05) Wilcoxon rank test: P= 0,15 (> 0.05) Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B; 229-236
PNH Leuko 50-100 µl periferní krev (EDTA) Příslušné množství titrovaných MP Inkubace ve tmě a pokojové teplotě 30 minut Lyzace erytrocytů (Immunoprep, Optilyse, FACS Lyse, NH4Cl..) 1 promytí v PBA Nastavení objemu na 0.5-1ml (PBA) Akvizice na průtokovém cytometru
PNH Leuko 4 barevný protokol Beckman Coulter Gr FLAER-Alexa Fluor 488 CD24-PE (SN3,ALB9) CD15-PC5 (80H5) CD45-PC7 (J33) Mo FLAER-Alexa Fluor 488 CD14-PE (61D3,RMO52) CD64-PC5 (22) CD45-PC7 (J33) Becton Dickinson Gr FLAER-Alexa Fluor 488 CD24-PE (SN3,ML5) CD15-APC (H198) CD45-PerCP-C5.5 (2D1) Mo FLAER-Alexa Fluor 488 CD14-PE (61D3,MφP9) CD64-APC (10.1) CD45-PerCP-C5.5 (2D1) Sutherland et al.; Cytometry; 2012; 82B:195-208
PNH Leuko - manuální nastavení Nastavení PMT signálů 1. Gr + GPI + MP na gate: umístění normálních Gr cytometru (4 barevný test) 2. Gr + MP na gate: umístění PNH Gr 3. Akvizice vyšetřovacího vzorku
PNH Leuko-nastavení cytometru ( 5 barev) Application settings Korekce hodnot pro FS-Area a FS-Height (area scaling)
PNH Leuko analýza - nastavení cytometru ( 5 colors) Nastavení optimálních PMT signálů (>2,5 rsd z nastavení baseline)
PNH Leuko analýza - nastavení cytometru ( 5 colors) Digitální kompenzace spektrálního přísvitu
Zobrazení PNH Granulocytů
Zobrazení PNH Monocytů
PNH Leuko -výkonnostní charakteristiky (4 barevný test) Clone size PNH clone Protocol N Min. Max. Mean SD CV (%) > 20% 1-20% Gr Mo Gr Mo < 1% Gr 4-color 3/10 99.4/98.2 99.5/99 99.4/98.5 0.1/0.3 0.1/0.3 5-color 3/10 99.4/98.9 99.4/99.2 99.4/99.1 0.01/0.1 0.01/0.1 6-color 3/10 99.5/98.4 99.6/98.7 99.5/98.5 0.03/0.1 0.03/0.1 4-color 3/10 99.5/99.3 99.8/99.6 99.6/99.5 0.1/0.1 0.1/0.1 5-color 3/10 99.3/99.3 99.5/99.5 99.4/99.4 0.1/0.1 0.1/0.1 6-color 3/10 99.4/98.8 99.9/99.1 99.8/99 0.3/ 0.2 0.3/0.2 4-color 3/10 12.5/11.7 12.8/12.9 12.7/12.2 0.1/0.4 0.9/3.6 5-color 3/10 12.3/12.2 12.4/12.5 12.3/12.4 0.1/0.2 0.7/1.7 6-color 3/10 12.5/11.8 12.7/12.3 12.6/12 0.1/0.2 0.8/1.5 4-color 3/10 9.9/15.3 10.5/16.7 10.1/15.9 0.3/.1 2.6/3.1 5-color 3/10 9.6/15.7 10.4/21.4 10.1/17.7 0.4/1.9 3.9/10.9 6-color 3/10 10.1/15.4 10.3/2 10.2/18.4 0.1/2.1 0.9/11.6 4-color 3/10 0.5/0.5 0.5/0.6 0.5/0.5 0.0/0.0 2.6/3.1 5-color 3/10 0.5/0.5 0.5/0.5 0.5/0.5 0/0.02 1/2.9 6-color 3/10 0.5/0.5 0.5/0.5 0.5/0.5 0/0.01 0.9/2.9 Marinov et al.;clin HemLab Med, 2013; 51: 2133-2139 Marinov et al.;clinlab, 2014;60:;217-224.
Lineární regrese Bland Altmann (Gra) Marinov et al.;clin HemLab Med, 2013; 51: 2133-2139 Marinov et al.;clinlab, 2014;60:;217-224.
Lineární regrese Bland Altmann (Mo) Marinov et al.;clin HemLab Med, 2013; 51: 2133-2139 Marinov et al.;clinlab, 2014;60:;217-224.
PNH Gr: mezilaboratorní opakovatelnost v sérii PNH Gr (big clone)-precision analysis PNH Gr (small clone)-precision analysis PNH Gr (minor clone)-precision analysis 103 102 101 100 99 98 97 96 95 94 93 Ref. center 1 2 3 4 9 8 7 6 5 Ref. center 1 2 3 4 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 Ref. center 1 2 3 4 > 20% Ref. center 1 2 3 4 1. 99,66 98,31 99,74 99,73 99,60 2. 99,64 98,64 99,72 99,65 99,63 3. 99,65 98,57 99,73 99,71 99,23 Mean 99,65 98,51 99,73 99,70 99,49 SD 0,01 0,14 0,01 0,03 0,18 CV 0,01 0,14 0,01 0,03 0,18 5%- 20% Ref. center 1 2 3 4 1. 6,73 6,56 6,53 6,32 8,10 2. 6,84 6,67 6,47 6,21 7,95 3. 6,76 6,85 6,69 6,29 7,79 Mean 6,78 6,69 6,56 6,27 7,95 SD 0,05 0,12 0,09 0,05 0,13 CV 0,69 1,79 1,41 0,74 1,59 < 1% Ref. center 1 2 3 4 1. 0,64 0,53 0,51 0,53 0,26 2. 0,64 0,51 0,72 0,58 0,22 3. 0,59 0,50 0,56 0,51 0,26 Mean 0,62 0,51 0,60 0,54 0,25 SD 0,02 0,01 0,09 0,03 0,02 CV 3,78 2,43 15,01 5,45 7,64 Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B; 229-236
PNH Mo: mezilaboratorní opakovatelnost v sérii 103 102 101 100 99 98 97 96 95 94 93 PNH Mo (big clone)-precision analysis Ref. center 1 2 3 4 > 20% Ref. center 1 2 3 4 1. 99,65 95,29 99,27 98,95 99,28 2. 99,66 96,41 99,06 98,18 99,33 3. 99,70 95,77 99,22 98,35 99,54 Mean 99,67 95,82 99,18 98,49 99,38 SD 0,02 0,46 0,09 0,33 0,11 CV 0,02 0,48 0,09 0,34 0,11 PNH Mo (small clone)-precision analysis 12 11 10 9 8 7 6 Ref. center 1 2 3 4 5%- 20% Ref. center 1 2 3 4 1. 8,89 8,42 9,64 8,44 9,77 2. 8,91 8,72 10,10 8,58 8,98 3. 8,90 9,32 9,80 8,55 9,01 Mean 8,90 8,82 9,85 8,52 9,25 SD 0,01 0,37 0,19 0,06 0,37 CV 0,09 4,24 1,94 0,71 3,95 PNH Mo (minor clone)-precision analysis 1.45 1.20 0.95 0.70 0.45 0.20 Ref. center 1 2 3 4 < 1% Ref. center 1 2 3 4 1. 0,70 0,79 0,88 0,93 1,24 2. 0,65 0,81 1,01 0,93 1,23 3. 0,73 0,78 1,24 0,97 1,12 Mean 0,69 0,79 1,04 0,94 1,20 SD 0,03 0, 01 0,15 0,02 0,05 CV 4,76 1, 57 14,27 2,00 4,54 Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B; 229-236
PNH Gr: mezilaboratorní mezilehlá preciznost PNH Gr (big clone)-reproducibility PNH Gr (small clone)-reproducibility PNH Gr (minor clone) - reproducibility 102 10 101 9 1.00 100 99 98 97 8 7 6 5 4 0.75 0.50 0.25 96 3 0.00 Ref. center 1 2 3 4 Ref. center 1 2 3 4 Ref. center 1 2 3 4 > 20% Ref. 1 2 3 4 1. 99,67 99,22 99,76 99,63 99,65 2. 99,71 98,74 99,70 99,25 99,69 3. 99,72 98,97 99,73 99,45 99,66 4. 99,74 98,87 99,67 99,34 99,70 5. 99,76 98,35 99,78 99,54 99,68 Mean 99,72 98,83 99,73 99,44 99,68 SD 0,03 0,29 0,04 0,14 0,02 CV 0,03 0,29 0,04 0,14 0,02 Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B; 229-236 5%- 20% Ref. 1 2 3 4 1. 6,58 6,23 6,23 5,30 7,78 2. 6,35 6,86 6,28 5,63 7,90 3. 6,47 6,84 6,29 5,41 8,19 4. 6,41 6,59 6,17 5,99 8,23 5. 6,61 6,63 6,71 6,06 8,15 Mean 6,48 6,63 6,34 5,68 8,05 SD 0,10 0,23 0,19 0,53 0,18 CV 1,52 3,43 3,03 5,34 2,20 < 1% Ref. 1 2 3 4 1. 0,56 0,46 0,63 0,49 0,26 2. 0,66 0,54 0,55 0,54 0,23 3. 0,67 0,44 0,63 0,53 0,24 4. 0,59 0,48 0,53 0,55 0,19 5. 0,67 0,49 0,57 0,52 0,25 Mean 0,63 0,48 0,58 0,53 0,23 SD 0,05 0,03 0,04 0,02 0,02 CV 7,31 6,99 7,08 3,91 10,33
PNH Mo: mezilaboratorní mezilehlá preciznost PNH Mo (big clone)- reproducibility PNH Mo (small clone) - reproducibility PNH Mo (minor clone) - reproducibility 103 102 101 100 99 98 97 96 95 94 93 11 9 7 5 1.7 1.2 0.7 0.2 Ref. center 1 2 3 4 Ref. center 1 2 3 4 Ref. center 1 2 3 4 > 20% Ref. 1 2 3 4 1. 99,58 96,31 99,09 98,86 99,57 2. 99,64 95,23 99,36 98,12 99,56 3. 99,55 96,35 99,16 98,28 99,56 4. 99,50 95,61 99,34 98,39 99,45 5. 99,64 96,05 99,00 98,28 99,68 Mean 99,58 95,91 99,19 98,39 99,56 SD 0,05 0,43 0,14 0,25 0,07 CV 0,05 0,45 0,14 0,25 0,07 Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B; 229-236 5%- 20% Ref. 1 2 3 4 1. 7,75 9,29 9,97 8,84 9,19 2. 8,10 8,04 10,42 8,22 9,03 3. 9,10 8,49 9,85 8,59 8,67 4. 8,45 9,09 10,39 8,01 8,48 5. 8,86 9,08 9,95 7,96 8,65 Mean 8,45 8,80 10,12 8,32 8,80 SD 0,49 0,46 0,24 0,34 0,26 CV 5,80 5,27 2,37 4,09 2,90 < 1% Ref. 1 2 3 4 1. 0,79 0,83 1,05 0,93 1,14 2. 0,85 0,80 0,74 1,15 1,16 3. 0,82 1,02 0,97 0,93 1,61 4. 0,89 0,57 0,93 0,96 1,14 5. 0,92 0,79 0,80 0,84 1,11 Mean 0,85 0,8 0,90 0,96 1,23 SD 0,05 0,14 0,11 0,10 0,19 CV 5,47 17,83 12,59 10,63 15,40
NH Leuko- mezilaboratorní lineární regrese 120 100 80 Ref. center vs center 1 (WBC) y = 0,9755x R² = 0,9996 120 100 80 Ref. center vs center 2 (WBC) y = 0,9984x R² = 0,9999 60 60 40 40 20 20 0 0 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 Pearson r: 0.9998 Pearson r: 1.0000 120 100 80 60 40 20 0 Ref. center vs center 3 (WBC) y = 0,9933x R² = 0,9999 0 20 40 60 80 100 120 Pearson r: 0.9999 Pearson r: 1.0000 120 100 80 60 40 20 0 Ref. center vs center 4 (WBC) y = 0,9975x R² = 0,9999 0 20 40 60 80 100 120 Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B; 229-236
PNH Leuko-Bland Altmann Wilcoxon rank test: P= 0,56 (> 0.05) Wilcoxon rank test: P= 0,56 (> 0.05) Wilcoxon rank test: P= 0,21 (> 0.05) Wilcoxon rank test: P= 1,0 (> 0.05) Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B; 229-236
PNH Leuko 6 barevný test Beckman Coulter platform v průběhu validace Becton Dickinson platform Gr+ Mo FLAER- Alexa 488 CD24-PE (SN3) CD15-APC (H198) CD14-PerCP-C5.5 (61D3) CD64-PC7 (10.10 CD45-APC-H7 (2D1) Marinov et al.;clin HemLab Med, 2013; 51: 2133-2139 Marinov et al.;clinlab, 2014;60:;217-224.
PNH Leuko -výkonnostní charakteristiky (6 barevný test) Clone size PNH clone Protocol N Min. Max. Mean SD CV (%) > 20% 1-20% Gr Mo Gr Mo < 1% Gr 4-color 3/10 99.4/98.2 99.5/99 99.4/98.5 0.1/0.3 0.1/0.3 5-color 3/10 99.4/98.9 99.4/99.2 99.4/99.1 0.01/0.1 0.01/0.1 6-color 3/10 99.5/98.4 99.6/98.7 99.5/98.5 0.03/0.1 0.03/0.1 4-color 3/10 99.5/99.3 99.8/99.6 99.6/99.5 0.1/0.1 0.1/0.1 5-color 3/10 99.3/99.3 99.5/99.5 99.4/99.4 0.1/0.1 0.1/0.1 6-color 3/10 99.4/98.8 99.9/99.1 99.8/99 0.3/ 0.2 0.3/0.2 4-color 3/10 12.5/11.7 12.8/12.9 12.7/12.2 0.1/0.4 0.9/3.6 5-color 3/10 12.3/12.2 12.4/12.5 12.3/12.4 0.1/0.2 0.7/1.7 6-color 3/10 12.5/11.8 12.7/12.3 12.6/12 0.1/0.2 0.8/1.5 4-color 3/10 9.9/15.3 10.5/16.7 10.1/15.9 0.3/.1 2.6/3.1 5-color 3/10 9.6/15.7 10.4/21.4 10.1/17.7 0.4/1.9 3.9/10.9 6-color 3/10 10.1/15.4 10.3/2 10.2/18.4 0.1/2.1 0.9/11.6 4-color 3/10 0.5/0.5 0.5/0.6 0.5/0.5 0.0/0.0 2.6/3.1 5-color 3/10 0.5/0.5 0.5/0.5 0.5/0.5 0/0.02 1/2.9 6-color 3/10 0.5/0.5 0.5/0.5 0.5/0.5 0/0.01 0.9/2.9 Marinov et al.;clin HemLab Med, 2013; 51: 2133-2139 Marinov et al.;clinlab, 2014;60:;217-224.
PNH Leuko 6 barevný protokol
PNH Leuko 5 barevný protokol (CD157) Beckman Coulter platform Gr+ Mo FLAER-Alexa Fluor 488 CD157-PE (SY11B5) CD15-PC5 (80H5) CD64-ECD (22) CD45 PC7 (J33) Becton Dickinson platform Gr+ Mo FLAER-Alexa Fluor 488 CD157-PE (SY11B5) CD15-APC (H198) CD64-PC7 (10.1) CD45 PerCP-C5.5 (2D1) Sutherland et al.:cytometry; 2013 Marinov et al.;ijlh, 2014
PNH Leuko 5 barevný protokol
PNH Leuko-výkonnostní charakteristiky (5 barevný test) Clone size > 20% 1-20% PNH clone Gr Mo Gr Mo Protocol N Min. Max. Mean SD CV (%) 5-color 3/3 51.3/97.7 52.4/97.9 51.8/97.8 0.5/0.1 0.9/0.1 6-color 3/3 51.5/97.6 51.7/97.8 51.6/97.7 0.1/0.1 0.2/0.1 5-color 3/3 73.5/90.3 74.1/91.4 73.7/90.9 0.3/0.4 0.7/0.7 6-color 3/3 74.6/95.4 75.4/96.2 74.7/95.4 0.5/0.7 0.7/0.7 5-color 3/3 7.4/16.4 7.8/16.6 7.6/16.5 0.2/0.1 2.4/0.7 6-color 3/3 6.9/14.8 6.9/15.4 18.9/15.1 0/0.3 0.3/1.6 5-color 3/3 18.4/32.6 19.4/34.5 18.9/33.6 0.4/0.7 2.3/2.6 6-color 3/3 18.8/25.2 18.9/36.5 18.8/36 0.1/0.6 0.3/1.6 5-color 3/3 0.3/0.2 0.3/0.2 0.3/0.2 0/0 3/3.7 < 1% Gr 6-color 3/3 0.3/0.2 0.3/0.2 0.3/0.2 0/0 5.8/4 Mo 5-color 3/3 0.8/0.5 0.9/0.5 0.8/0.5 0/0 8.1/4.8 6-color 3/3 0.8/0.6 0.9/0.7 0.8/0.6 0/0 5.4/3.2 Marinov et al.;ijlh, 2014
% p o s it iv e % p o s it iv e % p o s it iv e PNH Leuko- opakovatelnost v sérii (5 barevný test) (a ) (b ) In t r a - a s s a y p r e c is io n - m e d iu m c lo n e (c ) In t r a - a s s a y p r e c is io n - m in o r c lo n e In t r a - a s s a y p r e c is io n - b ig c lo n e 8 0 3 0 5. 0 7 0 2 0 2. 5 6 0 0. 0 5 0 1 0-2. 5 4 0 G r-5 c G r-6 c M o -5 c M o -6 c P o p u la t io n - p r o t o c o l 0 G r-5 c G r-6 c M o -5 c M o -6 c P o p u la t io n - p r o t o c o l -5. 0 G r-5 c G r-6 c M o -5 c M o -6 c P o p u la t io n - p r o t o c o l VC 5c: 0.88%-0.20% VC 6c: 0.42%-0.72% VC 5c: 2.40%-0.31% VC 6c: 2.29%-0.28% VC 5c: 3.02%-5.83% VC 6c: 8.14%-5.41% Marinov et al.;ijlh, 2014
% p o s it iv e % p o s it iv e % p o s it iv e PNH Leuko: mezilehlá preciznost (5 barevný test) (d ) In t e r - a s s a y p r e c is io n - b ig c lo n e (e ) In t e r - a s s a y p r e c is io n - m e d iu m c lo n e 1 0 0 5 0 (f) 5. 0 In t e r - a s s a y p r e c is io n - m in o r c lo n e 9 0 4 0 3 0 2. 5 8 0 2 0 0. 0 1 0-2. 5 7 0 G r-5 c G r-6 c M o -5 c M o -6 c P o p u la t io n - p r o t o c o l 0 G r-5 c G r-6 c M o -5 c M o -6 c P o p u la t io n - p r o t o c o l -5. 0 G r-5 c G r-6 c M o -5 c M o -6 c P o p u la t io n - p r o t o c o l VC 5c: 0.09%-0.08% VC 6c: 0.49%-0.72% VC 5c: 0.71%-1.63% VC 6c: 2.15%-1.55% VC 5c: 3.71%-4.04% VC 6c: 4.80%-3.19% Marinov et al.;ijlh, 2014
PNH Leuko: lineární regrese (5 barevný test) (a) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 5c vs. 6c (Granulocytes) y = 1.0045x r² = 0.9995 0 20 40 60 80 100 (b) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 5c vs. 6c (Monocytes) y = 0.997x r² = 0.9986 0 20 40 60 80 100 Pearson r: 0.99 Pearson r: 0.99 Marinov et al.;ijlh, 2014
D i f f e r e n c e i n r e s u lt s D i f f e r e n c e i n r e s u lt s PNH Leuko: Bland Altmann (5 barevný test) (c ) 5. 0 M e a n b ia s : 0.3 9 (d ) 5. 0 M e a n b ia s : 0.8 2 2. 5 2. 5 0. 0 0 5 0 1 0 0 0. 0 0 5 0 1 0 0-2. 5-2. 5-5. 0 M e a n o f r e s u lt s ( 5 c v s. 6 c ) ( G r a n u lo c y t e s ) -5. 0 M e a n o f r e s u lt s ( 5 c v s. 6 c ) ( M o n o c y t e s ) Wilcoxon rank test: P= 0.23 (> 0.05) Wilcoxon rank test: P=0.08 (> 0.05) Marinov et al.;ijlh, 2014
CD24-Granulocytes CD24-Granulocytes CD14-Granulocytes CD24-Granulocytes CD24-Granulocytes Monitorování minoritních PNH klonů (AA) Září 2008 Prosinec 2008 Březen 2009 Květen 2009 FLAER-GPI Anchor Marker FLAER-GPI Anchor Marker FLAER-GPI Anchor Marker FLAER-GPI Anchor Marker Gr. klon: 3.8% Gr klon : 7.6% Gr klon : 14.2% Gr klon : 23.3% Ery klon : 0.8% Ery klon : 1.6% Ery klon : 1.8% Ery klon : 2.4% CD59 GPI Anchor Protein CD59 GPI Anchor Protein CD59 GPI Anchor Protein CD59 GPI Anchor Protein 3 months 6 months 9 měsíců Vývoj PNH klonu v průběhu jednoho roku Source- Dahl-Chase Diagnostic Services.