Vznik NMR signálu a jeho další osud.

Vznik NMR signálu a jeho další osud.

NMR ecitace Zdrojem energie pro ecitaci jader je oscilující elektromagnetické záření s frekvencí w o generované střídavým proudem : B = C * cos (w o t) z z b b M o M o B B i i B o Vsílač () Je-li frekvence RF pole B a precesního pohbu magnetizace M o stejná, je dosaženo tzv. rezonanční podmínk a sstém absorbuje energii. Vzájemnou interakcí RF pole B a magnetizace M o dojde k jejímu překlopení kolem tohoto pole B o úhel b, který odpovídá velikosti dodané energie a době jejího působení.

Návrat magnetizace M o zpět do rovnováh (detekce NMR signálu) Při absenci eterního mag. pole B se M bude snažit přejít zpět na M o (rovnováha) obnovením původní distribuce populací N a / N b. Tento jev se nazývá relaace. z z M rovnováha... M o w Oscilace vektoru M vtváří fluktující magnetické pole, které generuje elektrický proud v přijímací cívce: z M w Přijímací cívka (-) NMR signál

FID (pokračování) V reálném vzorku eistuje mnoho spinových sstémů o různých frekvencí, většinou rozdílných od nosné frekvence B. Z tohoto důvodu získáme mnoho odezev, které mají různou periodu a rozdílnou rchlost zániku. Takováto kombinace signálů vzorku se nazývá Free Induction Deca (FID): I = f (t) Abchom získali NMR spektrum, musíme provést tzv. Fourierovu transformaci: I = f ( )

Průběh signálu v přijímací cívce (-): I = C * cos (w o t) I t

Free Induction Deca (FID) Z důvodu relaace NMR odezv jednotlivých jader zanikají. Tento zánik probíhá eponenciálně a získáme tak signál, který je superpozicí cosinové a eponenciální funkce. M w = w o čas čas M w w - w o <> 0 čas http://www.drcmr.dk/blochsimulator/

FT 0 Zatímco pozice signálu je dána chemickým posunem, jeho tvar určuje relaace. Je charakterizován tzv. Lorentzovou křivkou, kde je šířka signálu v polovině jeho maimální intenzit a nazývá se pološířka signálu. chemický posun w w w ref ref 6. 0 [ppm] pološířka signálu R 2 T 2 [Hz]

Algoritmus zpracování FIDu a získání NMR spekter Nasnímání dat Digitální filtrování (apodizace) Doplnění FIDu nulami(zero filling) Fourierova transformace Fázování spektra Referencování spektra

Zpracování dat digitální filtrování Nní máme signál v počítači. První operací při zpracování je tzv. digitální filtrování, nebo-li násobení FIDu vhodnou matematickou funkcí. Jak M zaniká, obsahuje čím dál více šumu: Kvalitní signál Většinou šum Jednoduše vnásobíme FID funkcí, která potlačí šum:

Digitální filtrování (pokračování) V takovémto případě se jedná o eponenciální funkci: F(t) = * e - ( LB * t ) nebo F(t) = * e - ( t / t ) Parametr LB se nazývá umělé rozšíření čár (line broadening). LB Použijeme-li parametr LB s opačným znaménkem, eponenciála roste, šum je zvýrazněn a dojde k zúžení signálu (zlepší se rozlišení). Eistuje celá řada dalších funkcí pro různé účel.

Zlepšení citlivosti nebo rozlišení Na následující FID bla aplikována eponenciální funkce s LB kladným a potom záporným a bl sledován efekt jak na FID, tak po FT na spektrum: LB = 5.0 Hz LB = -.0 Hz FT 5 Hz Hz FT

Doplnění FIDu nulami (zero-filling) Důležitý parametr je velikost dat (v datových bodech). Platí jednoduchý vztah, čím více datových bodů, tím je lepší digitální rozlišení (pokud to umožňuje povaha vzorku). Digitální rozlišení je definováno jako počet Hz na jeden datový bod: DR = SW / SI SW šířka spektra (Hz) SI velikost dat (bodech) Takže pro šířku spektra 5 KHz a FID snímaný do 6K, máme digitální rozlišení 0.305 Hz/bod. Pokud je spektrální šířka (SW) velká a počet bodů paměti (SI) malý, digitální rozlišení bude také malé a dojde ke ztrátě informace. Jedním z řešení je zvětšit SI, což znamená větší objem dat a delší eperimentální čas. Toto je kritické zejména pro multidimensionální NMR eperiment. Druhým řešením je doplnění eperimentálních bodů nulami, tzv. zero filling na konci FIDu.

Zero-filling (pokračování) Touto operací zvýšíme počet bodů paměti a tím i digitální rozlišení výsledného spektra. Nelze použít pokud máme špatně vzorkovaná data na začátku! 8K data 8K zero-fill 8K FID 6K FID

D Zero-filling (pokračování) 2D

Fourierova transformace a tvar signálu Matematická operace pomocí níž lze převést informaci ze závislosti na čase na závislost na frekvenci. f( ) = f(t) e -i2 t dt - Fourierova transformace eponenciálně klesající sinusovk (FIDu) f tr i2 t e e dt ( R 0 2 2 ( ) i2 ) e ( t * R 2 ) FT 0

Další příklad FT některých funkcí. cos( 2 * t ) FT 2 2 sin( 2 * t ) FT 2 2

Fázování spekter offset nezfázované offset správně zfázované

Fázování NMR spekter Jedna z velmi důležitých operací při zpracování NMR spekter je nastavit správné fáze všech signálů. Co je příčinou toho, že různé odezv v jednom spektru mají tzv. rozdílnou fázi? Fázový posun 0. řádu: Je způsoben rozdílnou fází mezi vsílačem a přijímačem. z M o M B w Přijímací cívka (-) w

Fázování NMR spekter z M o M B w Přijímací cívka (-) w Fáze signálu je směsí reálné (cosinové) a imaginární složk. I = C * cos (w o t) I = C * sin (w o t)

Fázování NMR spekter Fázový posun. řádu: K tomuto fázovému posunu dochází vlivem tzv. mrtvého času měřící sond, kd různé signál mají různou úhlovou rchlost (frekvenci), čímž dojde k různému posunu snímání jejich odezv. Jejich cosinové signál jsou navzájem z fázově posunuté. t w I t Mrtvý čas měřící sond je doba potřebná k přeměně vsílací cívk v přijímač

Fázování NMR spekter Rozdíl mezi fázovým posunem 0. a. řádu je v jejich závislosti na frekvenci příslušného signálu. Zatímco fázový posun 0. řádu je stejný pro všechn bod ve spektru, (nezávisí na frekvenci signálu), fázový posun. řádu lineárně vzrůstá se vzdáleností od nosné frekvence (závisí na frekvenci signálu). Chceme, ab výsledek blo spektrum se signál v čistě absorpčním tvaru. Provedeme fázovou korekci 0. řádu (stejnou pro všechn bod spektra) a poté korekci. řádu (korekce lineárně roste se vzdáleností od nosné frekvence). S(w) = S(w) + [ f o + f (w) ] * S(w) f o fázová korekce 0. řádu f fázová korekce. řádu

Základní NMR eperiment- pulsní sekvence Nejjednodušší pulsní sekvence, kterou se měří běžné H spektrum, obecněji jakékoliv jádro. Vektorově: z z M o 90 M puls detekce Schématick: 90 90 n Tzv. fáze pulsu udává směr odkud je aplikováno RF pole. Vektor makroskopické magnetizace se okolo této os otáčí. Puls se označují 90 nebo 90, což znamená 90 o z os () v rotující soustavě souřadnic.

Pulsní sekvence relaační perioda vývojová perioda mrtvý čas 90-90 - akvizice dat t rel t t D Každá pulsní sekvence je kombinací RF pulsů a časových prodlev mezi nimi. Prodlev jsou tři tp. Na začátku každého eperimentu je tzv. relaační perioda/prodleva, která zabezpečuje relaaci spinového Sstému po předchozí ecitaci, to znamená, že každý další sken začíná ze stejného výchozího stavu. Prodlev mezi puls jsou důležité pro vývoj spinového sstému- vývoj vhodného tpu magnetizace, její přenos Na jiné jádro, atd. Prodleva mezi posledním pulsem a začátkem akvizice dat je tzv. mrtvý čas měřící sond, což je doba nezbtná pro přeměnu RF cívk vsílače na přijímač.

Puls rozdělujeme na nespecifické (ecitují celé spektrum - jejich délka je řádově mikrosekund) a specifické (ecitují část spektra nebo jen jednotlivé signál délka řádově desítk až stovk milisekund). Radiofrekvenční puls. Radiofrekvenční puls je kombinací cosinové (frekvence w o ) a krokové funkce. * = t p Toto je časový průběh. Chceme-li vidět, jaké frekvence puls pokrývá provedeme FT: FT Výsledkem je signál se středem w o, který pokrývá široký rozsah frekvencí oběma směr, tzv. šířku pásma (band width). Šířka pásma je nepřímo úměrná délce pulsu f / t, tj. čím je puls kratší, tím má větší frekvenční rozsah a naopak. w o

Délka pulsu a sklápěcí úhel Sklápěcí úhel q t je úhel vchýlení makroskopické magnetizace z rovnovážného stavu do rovin <>. Závisí na velikosti RF pole B, době jeho působení t p a gromagnetické konstantě měřeného jádra. z z q t M o t p B M q t = * t p * B Takto definujeme tzv. šířku (délku) pulsu, což je doba, za kterou dosáhneme otočení vektoru magnetizace o / 4, / 2,... Každý puls je ted charakterizován třemi parametr: - frekvence (na která jádra působí) - výkon (určuje šířku ecitovaného pásma v Hz) - dobu trvání (charakterizuje sklápěcí úhel)

3 C spektra ( H dekaplink) H pravděpodobnost výsktu H - H ~00% pravděpodobnost výsktu H 3 C ~ % 3 C pravděpodobnost výsktu 3 C 3 C ~ 0,0% pravděpodobnost výsktu 3 C H ~ 00% 3 C spektrum dominantní nepřímá spin-spinová interakce J HC ~ 20-70 Hz 3 C spektrum s širokopásmovým protonovým dekaplinkem

3 C spektra ( H dekaplink) bez H dekaplinku ab 3 C bb H J (Hz) H aa 3 C ba I s H dekaplinkem ab 3 C bb H H ba aa 3 C I Schematick: 3 C: H: { H}

Spinové echo Mějme následující pulsní sekvenci: 90 80 (or ) t t Analýzu začneme po 90 pulsu: z rozfázování t t 80 refokusace

Spinové echo (pokračování) z detekce Zanedbáme-li vliv T 2 relaace dostaneme na konci stejný signál (pouze s opačným znaménkem) jako na začátku. Protože dojde k sfázování všech signálů ve spektru, tato sekvence umožňuje získat signál v absorpčním tvaru bez nutnosti aplikovat fázovou korekci. řádu. Spinové echo se vužívá pro měření spin-spinového relaačního času T 2 Spinové echo je stavebním kamenem mnoha důležitých NMR eperimentů. http://www.drcmr.dk/blochsimulator/

Spinové echo a heteronukleární interakce Nní modifikujme trochu naší pulsní sekvenci pro měření spinového echa tak, že obsahuje H dekapling: 90 80 (or ) 3 C: t t H: { H} Uvažujme nejprve CH sstém. Po / 2 pulsu se bude 3 C M vvíjet pod vlivem J-interakce. Jinými slov, každý vektor bude označen jedním ze stavů H, a to a a b: z - 2 J / 2 (a) t f (b) f = * t * J. + 2 J / 2

Spinové echo a heteronukleární interakce puls z os převrátí jednotlivé vektor a ihned poté začneme dekaplovat H. Dojde k jejich zastavení (nevvíjejí se) a ke kolapsu v jeden: J πj t D =/J -πj wt; J. J 80 deg puls detekce

Pro různé hodnot t D bude signál vpadat následovně: t = / 2J t = / J t pro skupinu CH 2 bude situace následující 2J 2πJ t =/J -2πJ

wt; 2 J. 2 J 80 deg puls detekce Pro různé hodnot t D bude signál vpadat následovně: t = / 2J t t D = / J Signál se mění s cosinem t, je nulový pro / 2J a násobk t a maimální/minimální pro / J násobk

Analogick pro CH 3 : J 3J 3πJ πj t =/J -3πJ - πj wt; 3 J. 3 J 80 deg puls detekce t = / 2J t = / J t

Attached Proton Test (APT) Za předpokladu, že CH interakční konstant jsou podobné a hodnota t D je nastavena na / J, získáme následující výsledek: O H 2 3 5 4 6 7 H O 6 4 50 00 50 0 ppm 2,3 5 7 Eperiment se jmenuje attached proton test (APT) a lze jej vužít pro rozlišení C, CH, CH 2, a CH 3.

Přenos polarizace Uvažujme dva proton, které jsou v interakci a mají velmi rozdílný chemický posun. Označíme je I a S, abchom dodrželi konvenci a označíme přebtek populace jednoho stavu nad druhým: ab 2 I S 4 bb S I aa 3 ba,3 2,4 I,2 3,4 S Nní ozáříme selektivně (měkký puls ) jen jednu čáru (jeden přechod). Dojde k vrovnání populací obou stavů a příslušná čára zmizí ze spektra. ab 2 I S 4 bb S I aa 3 ba,3 I 2,4,2 S 3,4

Přenos polarizace. SPT and SPI Protože jsme změnili populace jednotlivých spinových stavů, dojde ke změně intenzit příslušných čar ve spektru. Přenesli jsme polarizaci (magnetizaci) z jednoho spinu na druhý. Toto se nazývá selektivní přenos polarizace (selective polarization transfer, SPT). Eistuje varianta tohoto eperimentu: 90 80 s První puls je selektivní puls. Invertuje populace pouze jednoho spinu: 3,4 ab 2 I S 4 bb S I aa 3 ba 2,4,2,3 Takovýto eperiment se nazývá selektivní inverze populace (selective population inversion, SPI).

Heteronukleární přenos polarizace Z praktického hlediska má heteronukleární přenos polarizace mnohem větší význam než homonukleární varianta. Vužití pro navýšení intenzit málo citlivých jader! ab 2 3 C 4 bb H,2 3,4 H aa 3 C 3 ba,3 2,4 3 C H Pracujeme-li s kombinací jader 3 C a H, musíme brát v úvahu jejich vzájemný poměr gromagnetických konstant ku 4.

Heteronukleární přenos polarizace - SPT Nní ozáříme selektivně přechod,2 a získáme následující rozdělení populací: ab 2 3 C 4 bb H 2,4 3,4 H aa 3 C 3 ba,3,2 3 C H Došlo k trojnásobnému navýšení intenzit jednoho z 3 C přechodů. V absolutní hodnotě (sečteme-li příspěvk obou čar) se jedná o dvojnásobné navýšení intenzit 3 C signálu. celkové navýšení = - + +3 2

Heteronukleární přenos polarizace - SPI Nní proveďme stejnou analýzu pro SPI. Jestliže selektivně vměníme (obrátíme) populace stavů a 2, dostaneme: ab 2 3 C 4 bb H 2,4 3,4 H aa 3 C 3 ba,2 Pro pořádek. Začínali jsme s 3 C signálem takovéto intenzit: 3 C H,3 2,4,3 3 C Manipulací polarizace protonů jsme dospěli k čtřnásobnému navýšení 3 C signálu. Pochopitelně uvažujeme opět obě čár jak kladnou, tak i zápornou: celkové navýšení = -3 + +5 2

Přenos polarizace s neselektivními puls Použijeme-li dva / 2 puls vzájemně fázově posunuté o 90 o a oddělené periodou t D = / 2J CH, dosáhneme převrácení vektoru a. 90-90 - t = / 2J CH t z z a b J CH / 2 t = / 2J b a z z b b a 90 - a

Neselektivní přenos polarizace - INEPT Pokud rozšíříme sekvenci o heteronukleární spinové echo (odstranění rozdílu chemických posunů jednotlivých H) dostaneme pulsní sekvenci, která se nazýva INEPT (Insensitive Nuclei Enhancement b Polarization Transfer). Je to důležitý stavební blok mnoha pulsních sekvencí. Je používána pro navýšení citlivosti jader s nízkým jako např. 3 C a 5 N. Vpadá následovně: 90 80 90 H: t t 80 90 X: Velikost zvýšení citlivosti je úměrná poměru gromagnetických konstant spinu ecitovaného a spinu snímaného E / A. Pro 3 C ~ 4, pro 5 N ~ 0.

Neselektivní přenos polarizace - DEPT Pulsní sekvence DEPT se používá pro editaci 3 C spekter (Distorsionless Enhancement b Polarization Transfer). Také vužívá přenos polarizace. 90 80 θ H: t t 80 90 X:

O CH 3 -C-CH-CH 2 -OH d a Editace spekter - DEPT c CH 3 e b DEPT-35 DEPT-90 DEPT-45 APT a b c d e 3 C-spektrum 220 200 80 60 40 20 00 80 60 40 20 0 [ppm]

O CH 3 -C-CH-CH 2 -OH d a Editace spekter - DEPT c CH 3 e b (DEPT-45) + (DEPT-35) (DEPT-90) CH 3 (DEPT-45) - (DEPT-35) CH 2 DEPT-90 CH DEPT-45 All a b c d e 3 C-spektrum 220 200 80 60 40 20 00 80 60 40 20 0 [ppm]