Diagnostika retrovirů 2014

Transkript

1 Předmět: Bi 8360 Molekulární diagnostika mikroorganismů Diagnostika retrovirů 2014 Vladislava Růžičková

2 VI. Třída RNA-viry se zpětnou transkriptázou RT Alpharetrovirus Betaretrovirus Retroviridae Avian leucosis virus Mouse mammary tumour virus Gammaretrovirus Murine leukeamia virus Deltaretrovirus Bovine leukaemia virus Epsilonretrovirus Walleye dermal sarcoma virus Lentivirus Human immunodeficiency virus 1 Spumavirus Chimpanzee foamy virus

3 Historie výskytu a detekce HIV-1 FDA (US Food and Drug Administration)

4 Historie výskytu a detekce HIV

5 Centra pandemie HIV Botswana Jižní Afrika HIV z goril 2009 cirkulující rekombinantní formy např. A/B

6 Průběh patogeneze infekce HIV - AIDS

7 Diagnostika HIV- vyšetřovaný materiál Krev a plasma (sérum) i moč Test na přítomnost protilátek proti HIV antigenu (p24,...) RNA/DNA Standard v diagnostice HIV - sérologické metody Detekce p24 - ELISA testem (využití polyklonálních a nebo monoklonálních protilátek). Molekulární metody 1. průkaz vertikálního přenosu (z matky na dítě) 2. monitorování dávky viru u pacienta (během léčby). 3. molekulární epidemiologie výskytu typů kmenů HIV-1 Studium evoluce HIV oblast výzkumu

8 Sledované markery - proteiny HIV Gen Genový produkt Funkce gag Prekurzor 55-kDa Nukleokapsidové jaderné proteiny p24 Kapsidový protein p17 Matricový protein p9 Proteáza p7, p6 Vážou se přímo na RNA (NC) pol Prekurzor 160-kDa Enzymy p64, p51 Oba mají aktivitu zpětné transkriptázy, p64 má též RNázovou aktivitu p38 integráza env Prekurzor 160-kDa Glykoproteiny obalu gp120 Povrchový protein, váže se na CD4 gp41 Transmembránový protein obsahuje externí doménu potřebnou pro fúzi s cílovou buňkou

9 Odběr vzorků a kultivace retroviru HIV-1 viriony rychle odumírají Doporučené zpracování plasmy během 6 hodin po odběru. Minimalizace ztrát je při oddělení plasmy a buněk v separačních zkumavkách po okamžité centrifugaci a úchova při 4º C hod. nebo déle při -80º C Inkubace mononukleárních krevních buněk pacienta s buňkami HIVnegativního jedince. Supernatant ze směsného vzorku z kokultivace je testován na RT aktivitu anebo na přítomnost antigenu p24 (CA/gag). Pozitivní kultura je znovu testovaná po 1 měsíci. Kultivace je finančně a časově náročná- používá se pouze k výzkumným účelům, nikoliv v rutinní diagnostice HIV.

10 Sérologické metody Enzymoimunologické metody - ELISA HIV antigen HIV antigen přichycený k matrici sérum pacienta s anti HIV protilátka anti HU navázaná na enzym se připojí k anti HIV barevná reakce vyhodnocena spektrofotometricky. Verifikace pozit. výsledku Westernovým přenosem detekce gp160, gp41 a p24. přidání substrátu katalyzujícího přítomnost antihiv

11 Nepřímý imunoflurescenční test Pacientovo sérum reaguje s T-lymfocyty infikovanými HIV a s buňkami kontrolními neinfikovanými. Indikátorovým systémem je fluorochrom jamky na sklíčku T lymfocyt infikovaný HIV přidáno sérum pacienta s anti-hiv. inkubace 30 min/37 C promývání pufrem přidán FITC-navázaný na anti Hu Ig inkubace 30 min/37 C FITC je fluoresceinizothiokyanát promývání pufrem mikroskopická detekce

12 Westernový přenos (WB) gp160 gp120 p66 p55 p51 gp41 p31 p24 p17 přenos na nitrocelulózovou membránu elektroforetická separace směsi HIV antigenů nádobka se sérem pacienta (inkubace) nitrocelulózový filtrační papír s HIV antigeny (proužky neviditelné) HIV antigen konjugát HIV/antiHIV/enzym HIV protilátka HIV antigen inkubace proužku se substrátem odečet barevného signálu u pozitivního vzorku pacienta

13 Molekulární analýza genomu viru přímo - stanovení nukleotidového složení genomu nepřímo charakterizace genomu TYPIZACE A SUBTYPIZACE RNA viry jsou mnohem citlivější k mutacím než DNA viry. DŮVOD = RNA-polymerázy nemají 3-5 exonukleázovou aktivitu nemohou opravovat chyby vzniklé při replikaci.

14 MOLEKULÁRNĚ-BIOLOGICKÉ METODY v diagnostice HIV Techniky založené na detekci RNA/DNA 1. PCR amplifikace specifických sekvencí 2. Real-time PCR 3. RT-PCR pro RFLP analýzu RNA virů 4. Hybridizační metoda bdna (branched Chain DNA): 5. TMA (transcription-mediated amplification) NASBA (nucleic acid sequence-based amplification) 5. Sekvenování genomu lentiviru 6. Analýza pohyblivosti heteroduplexů (HMA)

15 Stanovení virové RNA v krvi Komerční metody detekce HIV_RNA (počet kopií/ 1 ml plasmy) založené na zpětné transkripci a PCR amplifikaci-konvenční real time (RT)-PCR, bdna a NASBA. Použití: monitorování HIV+ pacienta v průběhu onemocnění. Komerční kity RT-PCR Amplicor HIV-1 Monitor test (Roche), Versant/Quantiplex HIV-1 RNA, or bdna (Chiron/Siemens) NucliSens HIV-1 QT, or NASBA (biomérieux) Abbott RealTime HIV-1 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test

16 Nucleic Acid-Based HIV-1 Viral Load Assays (Published May 2006) Teri J. Liegler et al. University of California San Francisco, Gladstone Institute of Virology and Immunology Producer Assay Name Roche Diagnostics Amplicor HIV-1 Monitor Bayer HealthCare Amplification Target RT-PCR COBAS Amplicor HIV-1 Monitor RT-PCR COBAS AmpliPrep/COBAS Amplicor HIV-1 Monitor RT-PCR COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test RT-PCR branched Versant HIV-1 RNA (bdna) DNA biomerieux NucliSens HIV-1 QT NASBA NucliSens EasyQ HIV-1 NASBA Abbott LCx HIV RNA Quantitative competetive Laboratories Assay RT-PCR Abbott Laboratories RealTime HIV-1 Assay RT-PCR Real-time PCR Detection Target HIV-1 Method Region Subgroup Microwell capture, colorimetric gag Group M: A-H COBAS Amplicor Analyzer gag Group M: A-H COBAS Amplicor Analyzer gag Group M: A-H Real-time PCR (probe based) gag Group M: A-H Microwell capture, colorimetric pol Group M: A-H NucliSens Reader, ECL gag Group M: A-H Real-Time PCR (probe based) gag Group M: A-H Microparticle enzyme pol Group M: A-G immunoassay (integr) Group O pol (integr) Group M: A-G Group O ECL Electrochemiluminescence COBAS Comprehensive bioanalytical systems are robotics systems. NASBA = nucleic acid sequence based amplification ; RT PCR = reverse transcriptase and polymerase chain reaction

17 Real-time PCR - Technologie TaqMan využití pro kvantitativní analýzu cdna množství amplifikované cdna je detekováno intenzitou fluorescenčního záření v reálném čase během každého cyklu reakce metoda umožňuje rychlou detekci konkrétního genu a stanovení jeho množství ve vzorku

18 Zpětná transkripce (RT-PCR) a hybridizace The Roche Amplicor HIV-1 Monitor Version izolace RNA z krevní plazmy pacienta 2. RT- PCR 3. Amplifikace cdna 4. detekce - hodnocení RT+PCR biotin-dutpcdna a amplikony denaturace a hybridizace promytí a přidání konjugátu Avidin-HRP zastavení reakce substrát H 2 O 2 + TMB promytí Av-HRP Av-HRP Av-HRP odečet absorbance TMB-tetrametylbenzidin

19 Hybridizační metoda bdna (branched Chain DNA) Versant HIV-1 RNA Assay (Bayer,Tarrytown, NY) Princip metody využití řady hybridizací doplněné reakcí enzymu se substrátem 1. Izolace RNA HIV-1 z buněk krve pacienta 2. Hybridizace se specifickými sondami přichycenými k pevné matrici. 3. Hybridizace cílové sondy DNA k virové NK anebo k cdna amplikonům za vytvoření větvených bdna komplexů. 4. Hybridizace značené sondy k bdna 5. Inkubace po přidání enzymu (AP) s chemiluminiscenčním substrátem (dioxetan) 6. Měření chemiluminiscence.

20 Schéma metody (bdna) Versant HIV-1 RNA Assay (Bayer,Tarrytown, NY). RNA cílové sondy hybridizace bdna DNA provirová měření chemiluniniscence chemiluminescenční substrát dioxetan značené sondy

21 ANALÝZA POHYBLIVOSTI HETERODUPLEXŮ (HMA) Metoda: 1. PCR amplifikace cílové sekvence 2. Elektroforéza- separace PCR produktů 3. Hodnocení: vagarózovémgelu se směs nedenaturovaných heteroduplexů i homoduplexů pohybuje stejnou rychlostí a zastaví se v jedné pozici, v polyakrylamidovém gelu se heteroduplexy obsahující výdutě způsobené delecí nukleotidů pohybují pomaleji než homoduplexy homoduplex + heteroduplex heteroduplexy homoduplex

22 STANOVENÍ PŘÍBUZNOSTI KMENŮ HIV METODOU (HMA)

23 STANOVENÍ PŘÍBUZNOSTI KMENŮ HIV METODOU (HMA) Příbuznost jednotlivých kmenů se stanovuje na základě pohyblivosti heteroduplexů vyjádřené hodnotami od 0,1 do 0,9 (hodnota 1,0 odpovídá pohyblivosti homoduplexů). Hodnoty 0,1 až 0,9 vyjadřují poměr vzdálenosti amplikonu heteroduplexu ke vzdálenosti amplikonu homoduplexu v gelu od startu.

24 SEKVENCOVÁNÍ GENOMŮ Sangerova metoda s terminačními ddntp U RNA genomů se použitím RT musí nejprve přepsat do DNA a pak sekvenovat Začleňování fluorescenční značky Určování primární struktury - pořadí nukleotidů odhalení bodových mutací. Nejčastěji jsou to geny pro Ag epitopy povrchových proteinů. PCR + sekvenování - pro úseky (1 kb) sekvenováním genomu HIV se ukázaly odlišnosti v jednotlivých genech u viru od 1 pacienta. SEKVENCOVÁNÍ PCR PRODUKTU.

25 Příbuznost lentivirů dle sekvenční homologie v genech gag a env skupina pandemická výskyt v západní Africe

26 Eastern Europe and Central Asia Latin America North Africa and Middle East South and South-East Asia Western Europe Sub-Saharan Africa Abecasis et al. Retrovirology :7 doi: /

27 Struktura genomů rekombinantních forem HIV kmenů

28 Případy HIV- pozitivních v ČR HIV pozitivních/ AIDS/ úmrtí Měsíc/Rok - 10/ Měsíc/Rok - 09/ Měsíc/Rok - 10/ Měsíc/Rok - 10/ Měsíc/Rok - 8/