Univerzita Palackého v Olomouci. Bakalářská práce

Transkript

1 Univerzita Palackého v Olomouci Bakalářská práce Olomouc 2014 Václav Svoboda

2 Univerzita Palackého v Olomouci Přírodovědecká fakulta Katedra buněčné biologie a genetiky Charakterizace rekombinantní mapovací populace pro mapování genu/genů rezistence k padlí travnímu u pšenice T. monococcum L. Bakalářská práce Václav Svoboda Studijní program: Biologie Studijní obor: Molekulární a buněčná biologie Forma studia: Prezenční Olomouc 2014 Vedoucí práce: Mgr. Barbora Klocová

3 Prohlašuji, ţe bakalářskou práci jsem vypracoval samostatně pod vedením Mgr. Barbory Klocové a za pouţití citované literatury a elektronických zdrojů. V Olomouci Václav Svoboda

4 Souhrn Pšenice setá Triticum aestivum L. se řadí mezi celosvětově nejdůleţitější zemědělské plodiny. Podobně jako jiné zemědělské plodiny je napadána škálou chorob, které způsobují značné ztráty na úrodě. Mezi nejvýznamnější choroby patří padlí travní způsobené obligátně biotrofní parazitickou houbou Blumeria graminis (DC) Speer f.sp. tritici, ztráty na výnosu způsobené tímto parazitem mohou dosahovat aţ 30 %, proto je nutné šlechtit rezistentní odrůdy. Šlechtitelské úsilí značně komplikuje velikost a struktura genomu T. aestivum L. Proto se vyuţívá blízce příbuzných druhů s niţším stupněm ploidie. Jedním z vyuţívaných druhů pro subgenom A je pšenice jednozrnka T. monococcum L. Jednozrnka nebyla v minulosti intenzivně šlechtěna a stále vykazuje vysoký stupeň polymorfismu a jedná se tak o vhodný zdroj nových genů a alel, které mohou být vneseny do pšenice seté. Tématem teoretické části práce je pohled na T. monococcum L. jako na předmět zkoumání, na padlí travní, geny rezistence pšenice proti tomuto škůdci, přehled pouţívaných markerových technik v genetickém mapování pšenice a konstrukce mapovacích populací. Experimentální část práce se zabývá lokalizací oblasti zodpovědné za rezistenci k padlí travnímu.

5 Summary Bread wheat Triticum aestivum L. is one of the most important crops in the world. Like every crop, bread wheat is attacked by a range of pathogens which cause significant yield loss. One of the most devastating pathogen is Powdery Mildew which is caused by obligatory biotrophic fungus Blumeria graminis (DC) Speer f.sp. tritici, yield losses may reach up to 30 %. There is a need for breeding resistant cultivars. Breeding efforts are complicated by size and complexity of T. aestivum L. genome. This is a reason why close related species with a lower level of ploidy are used. One of the species used for A subgenome is Einkorn wheat T. monococcum L. Einkorn has never been intensively bred and it still keeps high level of polymorphism. So it is a sufficient source of new gene and alleles for the bread wheat. Theoretical part of this work is focused on T. monococcum L. as an object of interest, powdery mildew, resistance genes in wheat, an overview of marker techniques used in wheat genome mapping and construction of mapping populations. Experimental part of the work focused on localization of the region responsible to powdery mildew resistance.

6 Děkuji Mgr. Barboře Klocové za pomoc při vedení bakalářské práce. Mé poděkování patři téţ laborantkám ÚEB v Olomouci za spolupráci při získávání údajů pro výzkumnou část práce, dále prof. Ing. Jaroslavu Doleţelovi, DrSc. za vytvoření příjemného prostředí pro vypracování bakalářské práce. Tato práce byla podpořena Ministerstvem školství, mládeţe a tělovýchovy České Republiky a Evropským fondem pro regionální rozvoj (Operační program pro Výzkum a Vývoj pro Inovace No. ED0007/01/01, Ministerstvo školství, mládeţe a tělovýchovy České Republiky, grant No. LG12021)

7 Obsah 1 Úvod Cíle práce Současný stav řešené problematiky Pšenice Zástupci rodu TriticumL., evoluce polyploidních druhů, domestikace Původ T. monococcum L. a charakteristika Význam T. monococcum L. v moderním šlechtění pšenice Padlí Padlí travní Příznaky Ţivotní cyklus Geny rezistence Geny rezistence proti padlí travnímu u pšenice Mapování genů rezistence Genetické markery Molekulární markery DNA markery Mapovací populace F 2 populace (F 2 Populations) Rekombinantní inbrední linie (Recombinant Inbred Lines, RILs) Populace vzniklé zpětným kříţením (Backcross population, BC) Dihaploidní linie (Doubled Haploid Lines, DH) Materiál a metodika Biologický materiál Mapovací populace Vzorek padlí slouţící k inokulaci Přístrojové vybavení Chemikálie a roztoky... 33

8 4.3.1 Hodnocení fenotypu Izolace DNA z lyofilizovaného materiálu Agarózová elektroforéza Polymerázová řetězová reakce (PCR) Nedenaturující polyakrylamidová elektroforéza (PAGE) Metodika Pěstování mapovací populace Inokulace a hodnocení fenotypu Izolace DNA z lyofilizovaného materiálu Agarózová elektroforéza Polymerázová řetězová reakce Nedenaturující polyakrlyamidová elektroforéza Konstrukce genetické mapy Software Výsledky Molekulární markery Genetická mapa Fenotyp Diskuse Závěr Seznam zkratek Literatura... 47

9 1 Úvod Hexaploidní pšenice setá Triticum aestivum L. patří celosvětově mezi nejvýznamnější zemědělské plodiny a poptávka po ní rok od roku stoupá společně s neustále se zvětšující lidskou populací. Obrovský genom, který se skládá přibliţně z 80 % z repetitivní DNA a tří subgenomů (A, B, D) značně komplikuje šlechtění. Pozornost se tedy obrací na blízce příbuzné druhy s niţší ploidií, ty představují zdroje variability pro získávání odolnějších odrůd. Jedním z vyuţívaných druhů je pšenice jednozrnka Triticum monocccum L., blízce příbuzná donoru subgenomu A Triticum urartu Tum. Jednozrnka je jediný kulturní diploidní druh pšenice a vzhledem k tomu, ţe nebyl během posledních let intenzivně šlechtěn, si stále zachovává vysoký stupeň polymorfismu a je tak vhodný genetický rezervoár pro agronomicky významné znaky. Padlí travní, choroba způsobená obligátně biotrofní parazitickou houbou Blumeria graminis patří mezi nejvýznamnější patogeny napadající obiloviny. Padlí napadá všechny nadzemní části rostlin a můţe způsobovat značné ztráty na úrodě. Efektivní strategií boje proti padlí je pěstování odolných odrůd a/nebo aplikace fungicidů. Šlechtění odrůd s jednogenovou rezistencí však nepřináší dlouhodobé výsledky, houba je schopna ji překonat. Zvýšená aplikace fungicidů je pak kontraproduktivní a ve výsledku má na houbu stejný efekt, také má neblahý vliv na zdraví lidí i ţivotní prostředí. Cílem šlechtitelských programů je identifikovat geny odpovědné za rezistenci a vnést je do pšenice seté pro zlepšení jejích vlastností. Nezměrný přínos mají moderní metody molekulární biologie. 8

10 2 Cíle práce 1. Zpracování literární rešerše o T. monococcum L. jako objektu zkoumání. a. Genetické mapování u pšenice příprava mapovacích populací, nejčastěji pouţívané DNA markery, principy genetického mapování. b. Padlí travní a geny rezistence u pšenice. 2. Konstrukce genetické mapy nové mapovací populace T. monococcum L. za pouţití STS a SSR markerů 3. Lokalizace oblasti odpovědné za rezistenci k padlí travnímu u nové mapovací populace T. monococcum L. 9

11 3 Současný stav řešené problematiky 3.1 Pšenice Semena obilovin obecně jsou hlavním energetickým zdrojem lidstva. Pšenice je nejrozšířenější pěstovanou plodinou světa, představuje hlavní zdroj výţivy, krmiva a materiálu pro následné průmyslové vyuţití. Pšeničná semena vykazují vysokou energetickou i nutriční hodnotu, zásobní látkou je škrob a obsahují i nezanedbatelné mnoţství bílkovin. Další výhodou je jejich jednoduchá a moţná dlouhodobá skladovatelnost. Historie domestikace započala před více neţ lety a patří tak k prvním domestikovaným plodinám vůbec. Kolébka zemědělství se nachází ve východním Turecku v historické oblasti Úrodného půlměsíce (Harlan et Zohary, 1966). Místo se bezesporu můţe spojovat se zrodem moderního lidstva. Právě v této oblasti první lidé změnili svůj způsob ţivota lovců a sběračů na usedlý ţivot zemědělců (Diamond, 2004; Heun et al., 1997). Pšenice patří k obilovinám spolu s dalšími zemědělsky významnými plodinami, jako je kukuřice, rýţe, ječmen, ţito a další. Taxonomicky T. aestivum L. řadíme do tribu Triticeae, kde patří další významné rody jako Hordeum (ječmen), Aegilops a Secale (ţito). Pšenice setá a další hexaploidní, tetraploidní a diploidní pšenice patří do rodu Triticum L. (Goncharov, 2011; Matsuoka, 2011) Zástupci rodu Triticum L., evoluce polyploidních druhů, domestikace Do rodu Triticum L. řadíme plané, kulturní, diploidní, tetraploidní i hexaploidní druhy. Z diploidních (2n = 2x = 14) jsou nejvýznamnější T. monococcum L., T. boeoticum Boiss., T. urartu Thum. Z tetraploidních (2n = 4x = 28) pak například T. durum Desf. a T. turgidum L. Z hexaploidních (2n = 6x = 42) je to T. spelta L. a T. aestivum L. (Percival, 1921). 10

12 Prvním zemědělsky vyuţívaným druhem se před asi lety stala pšenice jednozrnka T. monococcum L. (2n = 2x = 14, A m A m ) a dodnes je jediným kulturním diploidním druhem pšenice na světě, dnes je však pěstována jen pro krmení dobytka (Percival, 1921). Do stejné oblasti a přibliţně i stejného období se datuje domestikace přirozeně se vyskytující tetraploidní pšenice T. durum Desf. (2n = 4x = 28, A u A u BB), ta vznikla hybridizací T. urartu Tum. (2n = 2x = 14, A u A u ) s donorem subgenomu B, před 0,5 3 miliony let (Dvořák et al., 1988; Dvořák et al., 1993). Tento donor je blízce příbuzný sekci Sitopsis a druhu Aegilops speltoides Tausch. (2n = 2x = 14; SS), (Alnaddaf et al., 2013). Následná hybridizace tetraploidní T. durum Desf s diploidní Ae. tauschii Coss. (2n = 2x = 14, DD) před lety dala vzniknout allohexaploidní pšenici seté T. aestivum L. (2n = 6x = 42, A u A u BBDD), která se záhy rozšířila z oblasti Kavkazu do dalších částí světa (Charmet, 2011). Její genom sestává ze tří subgenomů: A, B, D, které mají původ v relativně blízce příbuzných druzích. Díky tomu je zachována částečná homologie (homeologní chromozomy) a rostliny jsou fertilní (Devos et Gale, 1997). T. aestivum L. je dnes zdaleka nejrozšířenější a nejvýnosnější druh pšenice. Uvedené polyploidizační události velmi usnadnily domestikaci pšenice (viz obr. 1). Negativním důsledkem kaţdé domestikace je však ztráta velkého mnoţství potenciálně uţitečných genů a alel. Tato ztráta je způsobená šlechtěním pro úzkou škálu poţadovaných vlastností (Charmet, 2011). 11

13 Obr. 1:Evoluce genomů pšenice, ječmene a žita. Zelené šipky představují domestikační události, červené představují selekce, důsledkem kterých existují dnes známé odrůdy ţita, pšenice a ječmene. (Upraveno podle Feuillet et al., 2008) Původ T. monococcum L. a charakteristika Místo domestikace T. monococcum L. se nachází v severní části historické oblasti Úrodného půlměsíce na jihovýchodě Turecka v pohoří Karacadag. Zdejší druhy vykazují největší genetickou příbuznost s domestikovanou diploidní pšenicí i znaky divokých druhů (Heun et al., 1997). Pšenice jednozrnka (2n = 2x = 14), je nápadná svou výškou, můţe dorůstat 12

14 aţ 200 cm. Klas je dvouřadý, ačkoli by se dle názvu mělo vyskytovat pouze jedno semeno na obilku, v menší míře se setkáváme i s dvousemennými odrůdami (Hopf et Zohary, 2000). Obecně je jednozrnka poměrně homogenní druh a morfologická diverzita mezi jednotlivými odrůdami je malá (Percival, 1921). Planým (nejbliţším) příbuzným jednozrnky je T. boeoticum Boiss (viz obr. 2.). Mezi druhy nejsou morfologické rozdíly. Dokonce i struktura chromozomů je stejná, hybridi mezi těmito druhy nevykazují sníţenou fertilitu či jiné známky outbredního efektu. Rozdíly jsou však patrné ve strategii při šíření potenciálního potomstva, semen. Plané druhy mají rozpadavé, křehké klasy. Ty usnadňují šíření semen, které je ve volné přírodě zásadní pro přeţití druhu. Naopak pro člověka by tato strategie ţádné výhody neměla. Lidé si vybírali mutanty, kteří nevykazují tuto vlastnost a proto klasy T. monococcum L. uvolňují obilky aţ za působení tlaku (Hopf et Zohary, 2000). Plané a starobylé kulturní druhy jako je T. monococcum L. díky své vysoké úrovni polymorfismu představují rezervoár genetické diverzity, který můţe být vyuţit v moderních šlechtitelských programech pro zlepšení vlastností nejhojněji pěstované pšenice seté T. aestivum L. (Singh et al., 2007). Obr. 2: Klasy T. boeoticum L. a T. monococcum L. Rozpadavé klasy T. boeoticum G3116 (vlevo) nerozpadavé klasy T. monococcum DV92 (vpravo) 13

15 3.1.3 Význam T. monococcum L. v moderním šlechtění pšenice T. monococcum L. je ve šlechtitelských programech zabývajících se zlepšením genomu pšenice seté velmi nápomocno díky své blízké příbuznosti s jiným diploidním druhem T. urartu Tum., které přispělo A genomem do genomu allohexaploidní pšenice seté. Dále pak díky vysokému stupni polymorfismu, který je úzce spjat s faktem, ţe druh nebyl nikdy intenzivně šlechtěn. Nakonec také proto, ţe jde o jediný kulturní diploidní druh pšenice. Díky tomu, ţe má oproti pšenici seté jen jeden genom, jsou techniky molekulární biologie jako sekvenování a mapování genů snadněji proveditelné. Monococcum má i další významné vlastnosti, pro které je ceněno. Vykazuje vysokou odolnost vůči mrazům. Není náročné na půdu, dokáţe vyrůst v drsných podmínkách písčitých, kamenitých a vápencových oblastí, kde by jiné druhy pšenice nemohly vegetovat (Percival, 1921). Všechny tyto vlastnosti z něj činí vynikající nástroj pro šlechtění odolnějších odrůd pšenice (Singh et al., 2007). V dnešní době je však zorné pole zaměřeno spíše na rezistence vůči rozličným chorobám: rzi (Puccinia triticina Erikss), sněti, paličkovice nachová (Claviceps purpurea Fr.), nebo hlístice (Heterodera spp.) a především padlí travní (Blumeria graminis DC.). 3.2 Padlí Padlí (eng. Powdery Mildew) patří mezi nejrozšířenější houbové patogeny napadající všechny nadzemní části téměř známých druhů jednoděloţných i dvouděloţných krytosemenných rostlin (Braun et al., 2002). Na základě anatomie, morfologie vřecek a škály hostitelů rozeznáváme přibliţně 650 druhů (Braun et al., 2002). K ekonomicky významným hostitelům patří: obiloviny, réva vinná, ovocné stromy, chmel, okrasné druhy rostlin. Při vhodných podmínkách padlí způsobuje značné ztráty na úrodě (Glawe, 2008). Ochrany úrody můţe být dosaţeno, uţíváním fungicidů a/nebo pěstováním resistentních odrůd. Samotné fungicidy se nejeví jako vhodný nástroj boje proti padlí, jsou finančně náročné, rezidua představují moţnou hrozbu pro lidi, zvířata i ţivotní prostředí. Navíc aplikace fungicidů způsobuje indukci rezistence patogenu (Zhang et al., 2005). 14

16 V dnešní době silně intenzivního zemědělství má padlí velký význam (Häni et al., 1993). Způsobené ztráty na výnosu mohou být značné, % (Griffey et al., 1993; Leath et Bowen, 1989). Napadány jsou všechny druhy obilí s výjimkou kukuřice, přičemţ největší ztráty činí na pšenici a ječmenu. Ţito a oves jsou padlím infikovány jen zřídka (Häni et al., 1993). Kromě škod, které způsobuje padlí samotné, vytváří jeho přítomnost vstupní bránu pro další patogeny, jakými jsou například: paluška travní (Typhula incarnata), braničnatka plevová (Leptosphaeria nodorum), fuzariózy listů (Fusarium spp.) a mnoho dalších (Häni et al., 1993) Padlí travní Padlí travní je choroba způsobená obligátně biotrofní ektoparazitickou houbou Blumeria graminis (Syn. Erysiphe graminis), kterou řadíme do třídy Leotiomycetes, řádu Erysiphales. Patří tedy mezi patogenní houby s úzce vymezenou specializací a napadá pouze obiloviny (Marchal, 1902). Striktní specializace dala základ systému pro biologickou klasifikaci B. graminis (Bg), která rozlišuje osm forem (formae speciales, f.sp.) (Oku et al., 1985): B. graminis f.sp. hordei (Bgh) napadající ječmen f.sp.tritici (Bgt) napadající pšenici f.sp.secalis (ţito) f.sp.avenae (oves) a další čtyři formy napadající nekulturní druhy trav Studie však ukázaly, ţe rozsah hostitelských rostlin můţe být mnohem širší neţ jen obiloviny (Eshed et Wahl, 1970; Hardison, 1944; Hirata, 1966; Sheng et al., 1995). 15

17 3.2.2 Příznaky Příznaky napadení padlím se na rostlině začínají projevovat na přelomu jara a léta kdy probíhá šíření haploidních konidií a s nimi spojené infekce (Zhang et al., 2005). Padlí je na napadené rostlině okem rozpoznatelné (viz obr. 3), tvoří vatovité polštářky (kupky) převáţně na horní straně listu, jejichţ barva je zpočátku bílá a postupně přechází v šedou aţ hnědou (Häni et al., 1993). Později se vytváří povlaky šedohnědé barvy nesoucí černá kulovitá kleisthotecia o velikosti 0,15 0,30 mm v průměru (Ellis et Ellis, 1997). Pokud je list napaden silně, dochází ke ţloutnutí a předčasně umírá (Häni et al., 1993). Náchylnost pšenice je nejsilnější od počátku odnoţování aţ do mléčné zralosti, mladé listy vykazují větší náchylnost neţ listy starší. Oproti ječmeni je pšenice mnohem tolerantnější k časnému napadení. Naopak je citlivější k napadení praporcových listů a pluch. Při napadení klasů je často sníţena hmotnost tisíce zrn (Häni et al., 1993). Silné napadení padlím se dá očekávat po mírné zimě a při teplém a relativně suchém jarním počasí. Faktory, které podporují silnou produkci větrem šířených spor. Vysoká vzdušná vlhkost, nikoli déšť, střídání teplých a vlhkých dnů podporuje napadení. Vhodné jsou teploty mezi C. Při 20 C trvá inkubační doba jen 3 4 dny, tato teplota je optimální pro šíření infekce. Při 5 C se inkubační doba můţe protáhnout aţ na 14 dní. Vyšší teploty (kolem 25 C) nepodporují šíření a na listech vznikají jen ţluté aţ hnědé skvrny, podobně jako u rezistentních odrůd. Napadení můţe mít explozivní charakter, pro počátek epidemie postačí dvě generace spor, asi týden při optimálních podmínkách (Häni et al., 1993). 16

18 Obr. 3: Příznaky napadení na pšenici (T. monococcum L.) Životní cyklus Ţivotní strategie B. graminis nutně vyţaduje synchronizaci celého cyklu s ţivotním cyklem hostitelské rostliny (Jarvis et al., 2002), coţ značně omezuje kultivaci na médiích. I v případě, ţe je tato kultivace moţná, průběh ţivotního cyklu se v některých aspektech odlišuje od průběhu na přirozeném hostiteli (Both et al., 2005; Zhang et al., 2005). Podobně jako jiné parazitické houby i B. graminis vykazuje sloţitý a variabilní ţivotní cyklus. Můţe zahrnovat fázi pohlavní i nepohlavní nebo jen pohlavní, případně jen nepohlavní (Glawe, 2008). B. graminis je pleomorfní druh, produkuje morfologicky odlišné spory v závislosti na fázi ţivotního cyklu, jde o jednu z prvních hub, kde byla pleomorfie prokázána (de Bary, 1863; Tulasne et Tulasne, 1861). Nepohlavní cyklus (anamorfa) zahrnuje tvorbu konidioforů (viz obr. 4) a na nich větrem roznášených konidií způsobujících šíření epidemie (Zhang et al., 2005) i na kilometry vzdálená místa (Both et al., 2005). 17

19 Obr. 4: Nepohlavní cyklus B. graminis (upraveno podle Both et al., 2005) Během pohlavního cyklu (teleomorfa) se na starších listech tvoří uzavřené plodnice kleistothecia, které produkují pohlavní spory (askospory). Kleisthotecium nese 10 aţ 20 vřecek, v kaţdém se nachází 8 askospor (Ellis et Ellis, 1997). Pohlavím cyklem B. graminis přečkává nepříznivé podmínky prostředí: přezimování nebo vysoké teploty, období sucha kdy hostitel přeţívá v podobě semen (Zhang et al., 2005). 3.3 Geny rezistence Šlechtění odrůd nesoucích geny rezistence se ukázalo jako nejefektivnější nástroj boje proti virovým, bakteriálním, houbovým i ţivočišným patogenům. 18

20 Existují dva typy rezistence k padlí. První je jednogenová (vertikální) nebo rasově specifická rezistence (race specific resistance), která je sice efektivní, ale ne na všechny izoláty. Ve většině případů se projevuje jako hypersenzitivní reakce (hypersensitive response, HR) za kterou jsou odpovědné major R geny nazývané Pm (powdery mildew) geny a představují gene-for-gene interakci (Bennett, 1984; Chen et Chekowski, 1999; Hsam et Zeller, 2002). Geny vertikální rezistence jsou exprimovány v semenáčcích a během vegetativního cyklu pšenice. Vertikální rezistence byla silně vyuţívána ve šlechtitelských programech, avšak selekční tlak působící na padlí měl ve výsledku negativní efekt, kdy byla rezistence brzy překonána posílením virulentních genů (Alam et al., 2011). Po překonání vertikální rezistence Pm geny často přispívají do oligogenních a kvantitativních typů rezistence (Paillard et al., 2000). Vzhledem k riziku překonání rezistence je nutná efektivní strategie pro náhradu těch odrůd, které se jiţ nejeví jako efektivní (Wolf, 1984; Leath et Heun, 1990). Druhý typ rezistence je nazýván jako rezistence dospělých rostlin (Adult Plant Resistance, APR) a projevuje se pouze u dospělých rostlin, nikoli semenáčků. Můţe být identifikována u rostlin, kde došlo k překonání vertikální rezistence nebo tam kde nejsou známy Pm geny. APR je mnohem odolnější/trvanlivější neţ první zmíněná (Alam et al., 2011). Například odrůda pšenice Knox byl efektivní proti padlí během 20 let pěstování (Shaner, 1973), jiná odrůda pšenice Massey uvedla na trh firma Virginia Tech v roce 1981 a stále je efektivní (Starling et al., 1984) Geny rezistence proti padlí travnímu u pšenice V pšenici seté a příbuzných druzích bylo k roku 2013 na různých chromozomech identifikováno 45 lokusůs 72 geny/alelami resistence k padlí (viz tab. 1), (Ma et al., 2011; McIntosh et al., 2008; Luo et al., 2009; Li et al., 2009; Hua et al., 2009; He et al., 2009; Fu et al., 2013). Lokalizace Pm genů v genomu není nahodilá, formují klastry v genově bohatých oblastech genomu (gene-rich regions), (Gill et al., 1996). 19

21 Tab. 1: Powdery mildew geny Gen Synonyma Původ Chromozom Citace Pm1 T. monococcum 7AL Hsam et al., 1998 Pm2 T. aestivum/ae. Tauschii 5DS McIntosh et Baker, 1970 Pm3 T. aestivum 1AS Briggle,1966 Pm4 T. dicoccum 2AL The et al., 1979 Pm5 T. dicoccum 7BL Law et Wolfe, 1966 Pm6 T. timopheevii 2BL Jørgensen,1973 Pm7 S. cereale 4BS.4BL-2RL Friebe et al., 1994 Pm8 S. cereale 1RS.1BL Hsam et Zeller, 1997 Pm9 T. aestivum 7AL Hsam et al., 1998 Pm10 T. aestivum 1D Tosa et al., 1987 Pm11 T. aestivum 6BS Tosa et al., 1988 Pm12 Ae. speltoides 6BS-6SS.6SL Jia et al., 1996 Pm13 Ae. longissima 3BL.3SS-3S Ceoloni et al., DL.3SS-3S Pm14 T. aestivum 6BS Tosa et Sakai, 1990 Pm15 T. aestivum 7DS Tosa et Sakai, 1990 Pm16 T. dicoccoides 4A Reader et Miller, 1991 Pm17 S. cereale 1RS. 1AL Heun et al., 1990 Pm18 Pm1c T. monococcum 1A Hsam et al., 1998 Pm19 Ae. tauschii 7D Lutz et al., 1995 Pm20 S. cereale 6BS.6RL Friebe et al., 1994 Pm21 Haynaldia villosa 6VS. 6AL Chen et al., 1995 Pm22 Pm1e T. aestivum 7AL Singrun et al., 2003 Pm23 Pm4c T. aestivum 2AL McIntosh et al., 1998 Pm24 T. aestivum 1DS Huang et al., 2000 Pm25 T. boeoticum 1A Shi et al., 1998 Pm26 T. dicoccoides 2BS Rong et al., 2000 Pm27 T. timopheevii 6B-6G Jarve et al., 2000 Pm28 T. aestivum 1B Peusha et al., 2000 Pm29 A. ovata 7DL Zeller et al., 2002 Pm30 T. dicoccoides 5BS Liu et al., 2002 Pm31 T. dicoccoides 6AL Xie et al., 2003 Pm32 Ae. Speltoides 1BL. 1SS Hsam et al.,

22 Tab. 1 pokračování Pm33 T. carthlicum 2BL Zhu et al., 2005 Pm34 Ae. Tauschii 5DL Miranda et al., 2006 Pm35 Ae. Tauschii 5DL Miranda et al., 2006 Pm36 T. dicoccoides 5BL Blanco et al., 2008 Pm37 T. timopheevii 7AL Perugini et al., 2008 Pm38 T. aestivum 7DS Spielmeyer et al., 2005 Pm39 T. aestivum 1BL Spielmeyer et al., 2005 Pm40 Elytrigia intermedium 7BS Luo et al., 2009 Pm41 T. dicoccoides 3BL Li et al., 2009 Pm42 T. dicoccoides 2BS Hua et al., 2009 Pm43 Thinopyrum intermedium 2DL He et al., 2009 Pm44 T. aestivum 3AS Chen et al., 2011 Pm45 T. aestivum 6DS Ma et al., 2011 Mnoho Pm genů bylo do T. aestivum L. vneseno ancestrálními a jinými planými druhy ke kterým patří T. monocccum L. (AA), T. dicoccum (Schrank) Schuebl (AABB), T. timopheevi Zhuk. (AAGG) a další. Toto zjištění před více neţ 80 lety (Mains, 1933) odstartovalo hledání nových zdrojů Pm genů (Hsam et Zeller, 2002). T. monococcum L. s jistotou přispělo geny Pm1 na 7A chromozomu, Pm4 na 2A chromozomu, Pm25 na 1A chromozomu a recesivní gen Pm2026 na chromozomu 5A (Xu et al., 2008). Gen Pm25 se podařilo úspěšně vnést do genomu T. aestivum L. (Shi et al., 1998). Subgenom A v T. aestivum L. nese celkem 15Pm genů (viz tab. 1). Nedávno bylo také identifikováno v T. aestivum L. 7 Mlo genů, pojmenovaných TaMlo-1 7, Mlo jsou dobře známy z ječmene, výsledkem jejich exprese je hypersenzitivní reakce při napadení (Konishi et al., 2010). K hledání nových genů rezistence nám slouţí moderní metody molekulární biologie, jako jsou genetické markery, mapovací populace a genetické vazebné mapy. 21

23 3.4 Mapování genů rezistence Předpokladem pro mapování genů rezistence, ať uţ se jedná o jakéhokoliv patogena, je vyvinutí markeru, který bude v jeho těsné blízkosti, tedy v co nejsilnější vazbě. Takový marker pak můţe slouţit při selekci za pomocí markeru (MAS, Marker assisted selection) a tím značně usnadnit a urychlit šlechtění nových, odolnějších odrůd. K mapování genů rezistence potřebujeme genetickou vazebnou mapu. Tu sestrojíme díky genetickým markerům a mapovací populaci Genetické markery Značky neboli markery jsou specifická místa na chromozomu, která slouţí jako nástroje pro genomové analýzy. S jejich pomocí můţeme sledovat variabilitu jedinců jak v rámci populace, tak mezi populacemi nebo variabilitu mezidruhovou. Prvními markery v době klasické genetiky byly morfologické znaky popisující vnější projevy genu/ů (Kole et Abbott, 2008). Dnes s rozvojem metod molekulární biologie či metod biochemických se morfologické markery neuplatňují v takové míře jako dříve. Nejvíce uţívanými markery jsou molekulární, poskytují informace o polymorfismu přímo v molekule DNA nebo v proteinech které DNA kóduje Molekulární markery Molekulární markery poskytují informace o variabilitě organismu na úrovni molekul, nejčastěji DNA a různých druhů proteinů. Tyto markery nejsou ovlivněny prostředím a umoţňují rozpoznat od sebe jednotlivé alely. S jejich pomocí je studium ţivých organismů mnohem přesnější a důkladnější. Mezi molekulární markery patří biochemické a DNA markery (Kole et Abbott, 2008) DNA markery Genetické analýzy jsou v dnešní době běţnými nástroji k identifikaci genů, které kódují významné agronomické vlastnosti a především geny rezistencí k patogenům. 22

24 Pro pochopení genetiky a organizace rostlinných genomů byl příspěvek DNA markerů zásadní. K nejvýznamnějším přístupům pro získání významných informací o genomu patří techniky genetického mapování. Zjednodušeně se takto dá identifikovat gen kódující určitou vlastnost (Nguyen et Wu, 2005). Základem přirozeného polymorfismu organismů je jejich variabilita na úrovni DNA sekvencí vzniklá v průběhu evoluce. Molekulární DNA markery této přirozené variability vyuţívají. Rozvoj těchto metod však nebyl moţný aţ do 50. let minulého století, kdy byla rozluštěna primární struktura dvoušroubovice DNA (Watson et Crick, 1953). Od té doby bylo vyvinuto mnoţství typů DNA markerů ke stanovení variability v DNA sekvencích. Zavedení DNA metod vedlo k revoluci ve šlechtění rostlin, k rozvoji selekci za pomocí markeru (marker-assisted selection, MAS), která umoţňuje cílené šlechtění (Nguyen et Wu, 2005). Předpokladem pro vývoj DNA markeru je polymorfismus v sekvenci nukleotidů v rámci jednoho lokusu. Ke konstrukci genetických map se uţívá různých markerových systémů. Podle přístupu jakým se polymorfismus detekuje, se DNA markery rozdělují do dvou kategorií (Kole et Abbott, 2008): Techniky založené na hybridizaci Techniky založené na PCR Techniky založené na hybridizaci Techniky zaloţené na hybridizaci vyuţívají schopnosti denaturovaných jednovláknových DNA molekul vázat se na komplementární sekvence nukleotidů v jiném vláknu. Výsledkem je tvorba duplexů DNA DNA případně DNA RNA. K nejvýznamnějším patří: polymorfismus restrikčních fragmentů (restriction fragment length polymorphism, RFLP), (Botstein et al., 1980), hybridizace in situ (Gall et Pardue, 1969), DNA čipy (DNA microarrays) a DArT markery (Kilian et al., 2003). 23

25 DNA čipy (DNA microarrays) Významným technologickým pokrokem se stalo zavedení DNA čipů začátkem devadesátých let minulého století. Ukázaly značný potenciál vyuţitelný na mnoha polích molekulární biologie. DNA čipy umoţňují monitorovat aktivitu aţ desítek tisíc genů současně a detekovat tak obrovské mnoţství DNA sekvencí během jednoho experimentu. Ze začátku byly DNA čipy prováděny na sklíčku, dnes se pouţívají i jiné materiály jako je nylonová membrána, nitrocelulóza, zlato nebo křemíková destička. Metoda spočívá v hybridizaci, nejčastěji fluorescenčně značené cdna, genomických DNA fragmentů, PCR produktů, oligonukleotidů o délce bp s DNA fragmenty navázanými na čipu v daném pořadí. Hybridní molekuly jsou detekovány laserovou excitací, vyhodnocení provádí počítač na základě intenzity signálu (Weising et al., 2005). DNA čipy mají značný přínos pro naše chápání toho, jak probíhá genová exprese v buňce v reálném čase. Analýza genové exprese desítek tisíc DNA sekvencí souběţně reflektuje celý soubor buněčných transkriptů a má tak revoluční význam v pochopení buněčného transkriptomu (Ruan et al., 1998) Diversity Array technology, DArT Diversity Array Technology je vysokokapacitní markerový systém pro genomové analýzy za vyuţití technologie DNA čipů. Přístup poskytuje cenné informace o genomu studovaného organismu bez jakékoli předešlé znalosti DNA sekvence, navíc při potřebě minimálního mnoţství DNA. Poprvé byla DArT pouţita na genomu rýţe pro analýzu polymorfismu mezi vybranými odrůdami (Jaccoud et al., 2001). DArT markery pro T. monococcum L. a genetické mapy pomocí nich konstruované usnadňují lokalizaci genů, komparativní mapování, studium organizace genomu a evoluce mezi T.monococcum L. a dalšími obilovinami, především pak T. aestivum L. (Jing et al., 2009). 24

26 Techniky založené na PCR Zavedení polymerázové řetězové reakce (Mullis et al., 1986) mělo zásadní vliv na vývoj metod v molekulární biologii. PCR techniky překlenuly mnoho nedostatků RFLP a umoţnily vývoj široké škály molekulárních markerů, které také nazýváme molekulární markery druhé generace. Technika umoţňuje in vitro amplifikaci jakékoli DNA sekvence v obrovském počtu kopií. Mikrosatelitové markery (Simple Sequence Repeats, SSR) Simple sequence repeats" neboli mikrosatelity jsou krátké tandemové repetice, které se nachází roztroušeny v genomech všech eukaryot (Tautz et Renz, 1984). Jde o významný PCR markerový systém široce uţívaný v genetickém mapování, populační genetice, studiích genetické diverzity a v selekci za pomoci markeru (MAS), (Hearne et al., 1992; Zietkiewicz et al., 1994). Jejich mnoţství v genomu, vysoký polymorfismus, kodominantní charakter a moţnost rozlišení jednotlivých alel díky rozdílnému počtu opakování motivu z nich činí účinný nástroj molekulární biologie (Li et al. 2002). Mikrosatelitní tandemové repetice jsou krátké nukleotidové motivy o délce 1 6 bp. Často pak dinukleotidové (AT)n, (GC)n nebo trinukleotidové (ATT)n repetice nacházející se převáţně v nekódujících oblastech po celém genomu. Velikost zřídkakdy přesahuje 70 opakování (Dibet al., 1996; Dietrich et al., 1996; Li et al. 2002). Polymorfismus v počtu tandemových opakování je v převáţné míře způsoben sklouzáváním DNA polymerázy během replikace, k opětovnému nasednutí pak nemusí dojít přesně ve stejném místě, výsledkem je větší či menší počet opakování (Schlotterer et Tautz, 1992). PCR amplifikace SSR markerů probíhá z celkové genomické DNA. Dva specifické primery (17 22 nukleotidů) nasedají na hraniční sekvence v těsné blízkosti tandemové repetice. Ideální velikost produktu je bp (Kole et Abbott, 2008). V případě, ţe primery nejsou nijak značeny, je provedena analýza buď na agarózovém gelu o koncentraci < 3%, kde je rozlišovací schopnost asi 10 bp nebo gelu polyakrylamidovém, 25

27 ten má rozlišovací schopnost vyšší, aţ 1 bp (Wang et al., 2003). V obou případech se provádí barvení stříbrem nebo ethidium bromidem. V případě pouţití fluorescenčně značených primerů se provádí analýza produktu laserovou excitací na DNA sekvenátoru (Nguyen et Wu, 2005). Díky zmíněným vlastnostem jsou mikrosatelity velmi populární markerový systém. Vysoká reprodukovatelnost umoţňuje jejich uţití v různých laboratořích a provádění analýz s konzistentními výsledky (Saghai Maroof et al., 1994). Místo se sekvenční adresou (Sequence Tagged Site, STS) Místa se sekvenční adresou jsou krátké, jedinečné regiony o známé sekvenci jednoduše detekovatelné polymerázovou řetězovou reakcí (Saiki et al., 1988). Hlavní výhodou STS markerů je moţnost jejich distribuce mezi laboratořemi v podobě DNA databází coţ eliminuje nutnost transportu a uchovávání biologického materiálu (Williams et al., 1992). STS můţe být vyuţito např. pro detekci genů, ukotvování kontigů fyzických map (Palazzolo et al., 1991). STS markery kombinují jednoduchou proveditelnost RAPD (random amplified polymorphic DNA, náhodně amplifikovaná polymorfní DNA) markerů a specifitu SSR markerů, mohou mít dominantní, ale i kodominantní charakter (Perry et Bousquet, 1998). Jednonukleotidové polymorfismy (Single nucleotide polymorphism, SNP) Jako markery třetí generace jsou nazývány jednonukleotidové polymorfismy. Hojná přítomnost v celém genomu z nich činí vysoce efektivní přístup genetického mapování (Nguyen et Wu, 2005). Jednonuleotidové polymorfismy, změny v sekvenci DNA v jednom nukleotidu, zkráceně SNP reprezentují nejvýznamnější zdroj polymorfismu v genomech ţivých organismů, ačkoli jejich počty jsou v různých druzích (ale i jedincích jednoho druhu) značně variabilní (Agarwal et al., 2008). Stejně tak se různí i zastoupení v jednotlivých částech genomu (Weising et al., 2005). 26

28 Na molekulární úrovni SNP vznikají důsledkem tranzic a transverzí jednotlivých typů nukleotidů. Z definice mohou tedy SNP vykazovat jedno, dvou, tří a čtyřalelický polymorfismus. Nicméně tří a čtyřalelické se téměř nevyskytují a tak se někdy o SNP hovoří jako o bialelických markerech. S přihlédnutím k jejich počtu mohou být SNP markery detekovány pro kaţdý gen nebo v jeho těsné blízkosti, nejvíce jsou však zastoupeny v nekódujících oblastech. V oblastech kódujících můţe mít SNP synonymní charaktera nemá tak vliv na sekvenci aminokyselin, ale můţe ovlivňovat sestřih pre-mrna ústící ve fenotypové změny (Richard et Beckman, 1995) nebo charakter nesynonymní vedoucí ke změně v sekvenci aminokyselin kódovaného proteinu (Sunyaev et al., 1999). Značný potenciál tedy SNP skrývají v moţnosti detekování alelické formy genu a projevem fenotypu (Rafalski, 2002). Tyto tzv. diagnostické SNP mohou být asociovány s určitými agronomickými vlastnostmi rostlin. Detekce diagnostických SNP je hlavní snahou mnoha projektů zabývajících se SNP markery. Zjištěná frekvence pšenici seté činí 1 SNP na 540 bp (Somers et al., 2003) v kukuřici činí 1 SNP na bp (Ching et al., 2002), v lidském genomu je frekvence výskytu o něco niţší na 1 SNP připadá 1000 bp (Sachidanandam et al., 2001). Pro detekování SNP bylo zavedeno mnoho technik, některé jsou relativně jednoduše proveditelné a levné, zatímco jiné jsou laboratorně velmi náročné a tím i nákladné. Ţádný z přístupů není aplikovatelný pro všechny potřeby, hlavní přístupy můţeme zahrnout do pěti skupin: (1) přímé sekvencování, (2) enzymatická restrikce, (3) alelově specifická PCR, (4) alelově specifická oligonukleotidová hybridizace a (5) alelově specifická oligonukleotidová ligace. Výběr dané techniky záleţí na počtu SNP, počtu vzorků a také na náročnosti (Weising et al., 2005) Mapovací populace Mapovací populace slouţí ke studiu genů či lokusů ovlivňujících fenotyp a k determinaci rekombinačních vzdáleností mezi nimi. Ve většině případů mapovací populace sestávají z jedinců jednoho druhu, kteří vznikli kříţením rodičovských linií rozdílných v poţadovaných znacích. Při výběru rodičovských linií je třeba přihlédnout 27

29 k povaze experimentu. Je poţadována co největší rozdílnost sledovaných znaků, to umoţňuje popsat více genetických faktorů, které znak ovlivňují, coţ usnadňuje identifikaci (Kole et Abbott, 2008; Meksem et Kahl, 2005). V jedincích jednoho druhu jsou genové lokusy pevně fixovány na dané místo chromozomu, ale mohou se vyskytovat v různých alelových formách (polymorfismus). Vazba mezi geny na chromozomu se stanovuje na základě počtu rekombinací mezi různými genovými lokusy. Vazebné vztahy na všech chromozomech dávají genetickou mapu organismu. Způsob jakým se dané alely distribuují do potomstva, pomáhají detekovat molekulární markery, které také odhalí jejich genetickou vzdálenost od genů vykazujících znak ve fenotypu (Meksem et Kahl, 2005). Reprodukční strategie je základním kritériem při výběru vhodného typu mapovací populace. V nejširším slova smyslu je můţeme rozdělit na samosprašné a cizosprašné. Vzhledem k tomu, ţe pšenice patří mezi rostliny samosprašné, bude se tato kapitola věnovat mapovacím populacím, které jsou vhodné pro samosprašné rostliny (Meksem et Kahl, 2005). Jsou to F 2 populace, rekombinantní inbrední linie (RIL), populace vzniklé zpětným kříţením (backcross) a dihaploidní linie (DH) F 2 populace (F 2 Populations) Jedná se o nejjednodušší typ mapovací populace, která je schematicky znázorněna na Obr. 5. Základem jsou rodiče (parentální linie), kteří by v ideálním případě měli být rozdílní ve všech sledovaných znacích. Vzniklá F 2 populace segreguje ve sledovaných znacích v příslušných poměrech. Dominantní znaky v poměru 3:1, kodominantní znaky v poměru 1:2:1 (Kole et Abbott, 2008). F 2 jedinci jsou vlastně výsledkem jedné meiozy během které se rekombinuje genetický materiál rodičů. Pro plodiny s vysokým podílem homozygotů jsou geneticky vzdálení kříţenci efektivní způsob jak zvýšit podíl heterozygotů v populaci. (Meksem et Kahl, 2005). Velkou nevýhodou F 2 populací je nemoţnost materiál přemnoţit. Následná F 3 generace není geneticky identická (Meksem et Kahl, 2005). Mapovací populaci můţeme jen rozšiřovat o další F 2 jedince. 28

30 Obr. 5 Schéma přípravy F 2 mapovací populace (Meksem et Kahl, 2005) Rekombinantní inbrední linie (Recombinant Inbred Lines, RILs) Rekombinantní inbrední linie (viz obr. 6) jsou homozygotní populace vzniklé samosprášením F 2 jedinců. Výhodou je relativně malý počet generací potřebných ke generování RILs. Šest generací stačí pro dosaţení téměř úplné homozygotnosti. Mapovací populace je v podstatě nesmrtelná. Rekombinací pak nevznikají ţádné další změny v genetickém materiálu a nedochází k segregaci v potomstvu. Tyto linie tak mohou slouţit jako stálý nástroj pro mapování i v rámci různých výzkumných skupin. V porovnání s F 2 populacemi je také vyšší procento rekombinantů, zatímco v F 2 populaci došlo jen k jedné meióze, v případě RILs jich proběhlo několik, dokud nebylo dosaţeno homozygotnosti (Burr et Burr, 1991). 29

31 Obr. 6 Schéma přípravy rekombinantních inbredních linií (Meksem et Kahl, 2005) Populace vzniklé zpětným křížením (Backcross population, BC) Tyto mapovací populace vznikají kříţením rodiče A a rodiče B, kdy je F 1 generace zpětně kříţena s jedním z rodičů, např. s rodičem B. Za takové situace je rodič A donorem specifického DNA fragmentu do genomu B, protoţe v kaţdé generaci se zastoupení genetické informace z rodiče A sniţuje o polovinu (viz obr. 7). Sekvence A genomu ve vazbě se konzervují v recipientním genomu B, zatímco sekvence, které ve vazbě nejsou, se eliminují. Tento proces se opakuje po několik generací a výrazně jej zkracuje analýza pomocí molekulárních markerů. (Young et Tanksley, 1989). V případě, ţe generované linie se liší jen jedním či několika lokusy nazývají se nearly isogenic lines (NILs). K získání NILs je třeba několikanásobného zpětného kříţení společně s markerovou selekcí. Pokud BC linie vznikají kříţením vzdáleně příbuzných druhů, nazývají se introgresní linie, naopak pokud byly pouţity linie blízce příbuzné, třeba dvě různé odrůdy jednoho druhu, jedná se o intervarietové subtituční linie. Pokud je poţadována jedna určitá vlastnost, jako třeba rezistence k chorobě do odrůdy, který uţ nese jiné poţadované znaky, je zpětné kříţení vhodnou strategií. Jediným poţadavkem je produkce fertilního potomstva (Meksem et Kahl, 2005). 30

32 Obr. 7 Schéma přípravy populace zpětného křížení (Meksem et Kahl, 2005) Dihaploidní linie (Doubled Haploid Lines, DH) Dihaploidní linie nesou v jádrech svých buněk dvě identické haploidní sady chromozomů a jsou tím pádem zcela homozygotní, kdy pro kaţdý gen je v genomu jen jedna alela. Pro generaci dihaploidů se vyuţívají haploidní linie (haploidní rostliny jsou malé, málo vitální a téměř sterilní), které mohou vznikat spontánně (kukuřice, řepka) nebo uměle indukovaně. Pro indukovaný vznik DH můţe být pouţito kolchicinu, který brání tvorbě dělícího vřeténka během mitózy, následně nedojde k rozdělení buňky a vzniká dihaploid (Meksem et Kahl, 2005). Linie dihaploidů představují stálý zdroj pro mapování, zároveň jsou ideálními kandidáty pro kříţení vzhledem k absenci jakékoli heterogennosti. V případě obilovin se vyuţívají dihaploidní linie pro pšenici, ječmen a rýţi (Chao et al., 1989; Heun et al., 1991; McCouch et al., 1988). 31

33 4 Materiál a metodika 4.1 Biologický materiál Mapovací populace Mapovací populace T. monococcum L. se skládá ze 400 rostlin F 2 generace odvozené z kříţení rodičovských linií DV92 a 258. Pro konstrukci genetické mapy bylo pouţito 184 linií této mapovací populace. Rodič DV92 je T. monococcum ssp. monococcum L. kulturní jednozrnka z Titogradu Montenegro v Iltálii. Jeho alely jsou označovány písmenem A. Rodičovská linie 258 pochází z mapovací populace poţívané v diplomových pracích Klocová, Gallová a Vanţurová. Její alely jsou označovány písmenem B. Semena rodičovských linií byla poskytnuta Prof. J. Dubcovským (Univerzity of California in Davis). Mapovací populace byla vytvořena na Ústavu experimentální botaniky (Olomouc, ČR) Vzorek padlí sloužící k inokulaci Směsný vzorek padlí travního (Blumeria graminis f.sp. tritici) původně odebraný z vnímavé rodičovské linie 258. Tento vzorek je uchován v Zemědělském výzkumném Ústavu v Kroměříţi, kde byla provedena inokulace rostlin. 4.2 Přístrojové vybavení Vodní lázeň Jouan J18 (Bain univ, Francie) Oscilační mlýn MM301 (Retsch, Německo) Centrifuga Heraeus Fresco 17 (Thermo Scientific, USA) Termostat, BT 120M (Laboratorní přístroje Praha, Česká republika) Aparatura pro agarózovou elektroforézu Owl (Thermo Scientific, USA) 32

34 Zdroj stejnosměrného napětí MS 300 V (Major Science, USA) Transluminátor In genius (Syngene chemi Bio Imaging, UK) Dokumentační systém pro analýzu ELFO gelů (Syngene chemi Bio Imaging, UK) váhy AJ (Vibra, Japonsko) mikrovlnná trouba KOR-6C2B (Daewoo, Jiţní Korea) Aparatura pro polyakrylamidovou ELFO C-DASH Dual Adjustable Mega-Gel Kit (C.B.S. Scientific, USA) Zdroj stejnosměrného napětí MP 500 V (Major Science, USA) PCR Plate Spinner (VWR, USA) C1000 Touch Thermal cycler (BioRad, USA) 4.3 Chemikálie a roztoky Hodnocení fenotypu Agarózový gel připravený z 8 g agaru a 1000 ml destilované vody s antibiotikem benzimidazolem (40 ppm) v petriho miskách Izolace DNA z lyofilizovaného materiálu Invisorb Spin Plant Mini Kit (Invitek, Německo) Agarózová elektroforéza Pufr 5x TBE (1000 ml) 54 g Tris base (Sigma-Aldrich, USA) 27,5 g kyselina boritá (lach:ner, Česká Republika) 20 ml 0,5 mol/l EDTA (ph 8) (Fluka Analytical, Německo) doplnit destilovanou vodou na ml 0,5x TBE (ředění 5x TBE) 6x STOP C (10 ml) 33

35 2 ml 100 mm EDTA (ph 8) 0,1 g SDS 5 mg 0,05% (w/v) bromfenolová modř 5 mg 0,05% (w/v) xylene cyanol 4,3 ml 99% glycerol ředit 1 : 5 Velikostní marker 24 μl Gene Ruller 100bp Plus (Thermo Scientific USA) 100 μl 6x STOP C 476 μl destilovaná voda Agar pro DNA elektroforézu (Serva, Německo) Vyizolovaná DNA mapovací populace Polymerázová řetězová reakce (PCR) 10x PCR pufr (40 ml) 4 ml 100 mmol/l Tris-HCl (ph 8,2) 20 ml 500 mmol/l KCl 600 μl 15 mmol/l MgCl2 0,4 ml 1% Triton X-100 doplnit destilovanou vodou na 40 ml Nukleotidy (Fermentas, Litva) 100 mmol/l dttp 100 mmol/l datp 100 mmol/l dgtp 100 mmol/l dctp Cresol red (Sigma-Aldrich, UK) Taq polymeráza (Finzyme, Finsko) Primery (Invitrogen, USA) 34

36 4.3.5 Nedenaturující polyakrylamidová elektroforéza (PAGE) Pufr 5x TBE (2000 ml) 108g Tris Base 55g kyselina boritá 7,44G Na 2 EDTA. 2 H 2 O Doplnit destilovanou vodou na 2000 ml 10% APS ammonium persulfate (Sigma Life Science, USA) 40% směs akrylamid : N, N -metylenbisakrylamid 19 : 1 (Bio-Rad, USA) 10% ethidium bromid (Sigma Aldrich, USA) TEMED - tetrametyletylendiamin (Bio-Rad, USA) Silane 3 methacryloxypropyltrimethoxysilane (Serva, Německo) 99,8% kyselina octová (lach:ner, Česká Republika) 96% ethanol (lach:ner, Česká Republika) 4.4 Metodika Pěstování mapovací populace 7. září 2012 bylo 400 semínek z kříţení DV92 x 258 a 258 x DV92 umístěno do Petriho misek s buničitou vatou navlhčenou pitnou vodou, kde po dobu jednoho týdne klíčily. 14. záři byla klíčící semena zasazena do jiffy květináčů (5 x 5 cm) se zahradním substrátem, hnojivem (Osmocote exact) a Agrisorbem (1%). 12. října byly rostliny vysazeny do venkovních parcel v areálu ÚEB Olomouc - Holice Inokulace a hodnocení fenotypu Rostliny mapovací populace byly ve stádiu třetího listu převezeny do Zemědělského výzkumného ústavu Kroměříţ na fenotypizaci (Doc. Ing. Antonín Dreiseitl, CSc.). Z kaţdé rostliny byl odebrán první list, z kterého byly udělány listové segmenty. Ty byly přeneseny na agarózový gel s benzimidazolem a inokulovány směsným vzorkem padlí (viz obr. 8). Síla 35

37 napadení padlím byla hodnocena po měsíci hodnoticí škálou 0-4 (kde 0 byla rezistentní a 4 silně napadená). Obr. 8 Inokulované listy T. monococcum L. na agarovém gelu s benzimidazolem Izolace DNA z lyofilizovaného materiálu Izolace DNA byla provedena pomocí Invisorb Spin Plant Mini Kit (Invitek, Německo). Z kaţdé rostliny ve stádiu třetího listu byl odebrán list (asi 2 cm) do mikrozkumavky. Byly přidány dvě skleněné kuličky a dále bylo postupováno podle pokynů přiloţených u kitu na izolaci DNA Agarózová elektroforéza Pro kontrolu čistoty vyizolované DNA byla pouţita 1,2% agarózový gel. Gel byl připraven rozvařením 1,8 g agarózy v 150 ml 0,5x TBE pufru. Rozvaření bylo provedeno v mikrovlnné troubě. Agaróza je připraven ve chvíli, kdy je roztok čirý bez jakýchkoli 36

38 pevných částic. Před vlastním nalitím do vany je nutné roztok lehce ochladit pod proudem vody. Do vany pro agarózový gel s vloţenými hřebínky byl nalit zchlazeny roztok. Gel ztuhne přibliţně za 20 minut. Po ztuhnutí byly odstraněny hřebínky a gel zalit 0,5x TBE pufrem. Do jamek byly pipetovány vzorky smíchané s 6x STOP C v poměru 1:5. Po uzavření aparatury a připojení na zdroj elektrického napětí byly vzorky separovány při napětí 2V na 1 cm po dobu přibliţně jedné hodiny. Po ukončení byl gel vyříznut a vloţen do vany s ethidium bromidem (0,5 mg/ml)na min. Po vytaţení byl gel přemístěn do transiluminátoru, následovalo focení v UV spektru při expozičním čase 3s Polymerázová řetězová reakce Polymerázová řetězová rekce byla provedena v objemu 20 μl. Reakční směs obsahovala 1x PCR pufr, 0,01% Cresol red, 200 μmol/l jednotlivých dntp, 1 μmol/l primeru, 0,5U Taq polymerázy a 10 ng DNA. Polymorfní markery (primery) byly vybrány z genetické mapy mapovací populace DV92 x G3119 (diplomová práce Vanţurová). Celkem bylo vybráno 40 SSR markerů a 2 STS. Podmínky PCR pro SSR primery Zahřátí 95 C 5 min Denaturace 95 C 30 s Přisedání 1 30 s (viz tab. 2) 40 cyklů Polymerace 72 C 30 s Závěrečná polymerace 72 C 10 min Tab. 2 Použité primery SSR a STS markerů Chromozom 1A m Marker Primery SMP Chromozom 2A m Marker Primery F GCA AGG GAA GAG AAA AGC AG R TTT CTC AAT CTC ATG TTA TCC TTC A wmc602 F TAC TCC GCT TTG ATA TCC GTC C R GTT TGT TGT TGC CAT CAC ATT C Ta 55 C Ta 61 C 37

39 Tab. 2 pokračování wmc522 F AAA AAT CTC ACG AGT CGG GC R CCC GAG CAG GAG CTA CAA AT wmc296 F GAA TCT CAT CTT CCC TTG CCA C R ATG GAG GGG TAT AAA GAC AGC G wmc453 F ACT TGT GTC CAT AAC CGA CCT T R ATC TTT TGA GGT TAC AAC CCG A gwm122 F GGG TGG GAG AAA GGA GAT G R AAA CCA TCC TCC ATC CTG G wmc474 F ATG CTA TTA AAC TAG CAT GTG TCG R AGT GGA AAC ATC ATT CCT GGT A owm301 F AGT TTT GTG CAT GGG AAT GA R GCG ATT GTT CTG CAA ATT CA gwm515 F AAC ACA ATG GCA AAT GCA GA R CCT TCC TAG TAA GTG TGC CTC A gwm249 F CAA ATG GAT CGA GAA AGG GA R CTG CCA TTT TTC TGG ATC TAC C wmc420 F ATC GTC AAC AAA ATC TGA AGT G R TTA CTT TTG CTG AGA AAA CCC T gwm71 F GGC AGA GCA GCG AGA CTC R CAA GTG GAG CAT TAG GTA CAC G gwm382 F GTC AGA TAA CGC CGT CCA AT barc122 R CTA CGT GCA CCA CCA TTT TG F CCC GTG TAT ATC CAG GAG TG R CAG CCC TTG TGA TGT GAT G wmc407 F GGT AAT TCT AGG CTG ACA TAT GCT C R CAT ATT TCC AAA TCC CCA ACT C Chromozom 4A m Marker Primery wmc161 F ACC TTC TTT GGG ATG GAA GTA A R GTA CTG AAC CAC TTG TAA CGC A gwm494 F ATT GAA CAG GAA GAC ATC AGG G R TTC CTG GAG CTG TCT GGC cfa2173 F GAC ATA CTC CGG CGT TGA AT R TTC CCA GGA CAT CCT TCT TG wmc89 F ATG TCC ACG TGC TAG GGA GGT A R TTG CCT CCC AAG ACG AAA TAA C bcd1738 F TGA GCA CTA ACC CTG CCT TA barc106 cfd71 R TGA TGC ACA CCT CAA GCA AT F GCC CTC AAA TAA TTA CGC CAA TCC CTA TG R GCG TCA AGA TCA GAA GGC ATC CTA TTA TTG F CAA TAA GTA GGC CGG GAC AA R TGT GCC AGT TGA GTT TGC TC gwm397 F TGT CAT GGA TTA TTT GGT CGG R CTG CAC TCT CGG TAT ACC AGC Chromozom 5A m Marker Primery gwm6 F CGT ATC ACC TCC TAG CTA AAC TAG RAGC CTT ATC ATG ACC CTA CCT T wmc371 F GGA AAC CAA GGC AGC AGT CA R CCA GGG CTA CTT CAG CCA GG barc303 FGCG AGC TAT GAT CTG ATG AGG AG RGCG TGT CCT ACT AAT CCA ACT TG barc117 F TCA TGC GTG CTA AGT GCT AA R GAG GGC AGG AAA AAG TGA CT 61 C 61 C 61 C 60 C 61 C 55 C 60 C 55 C 51 C 60 C 60 C 52 C 61 C Ta 61 C 60 C 60 C 61 C 50 C 50 C 60 C 55 C Ta 55 C 61 C 50 C 52 C 38

40 Tab. 2 pokračování wmc805 F GAT GCT GCT GCA CCA AAC TC R GCC TTT TCC ATG CCA CAC T gwm639 F CTC TCT CCA TTC GGT TTT CC R CAT GCC CCC CTT TTC TG gwm126 F CAC ACG CTC CAC CAT GAC R GTT GAG TTG ATG CGG GAG G cfd47 F TGA CCA TGT CAT GTT TTA TAC CAC T R TGG ACT ACA TGT CAA GCA CAA A cfa2149 F CTT GGA GCT CGG GTA GTA GC R AAG GCA GCT CAA TCG GA GTA Chromozom 6A m Marker Primery wmc417 F GTT CTT TTA GTT GCG ACT GAG G R CGA TGT ATG CCG TAT GAA TGT T gwm570 F TCG CCT TTT ACA GTC GGC R ATG GGT AGC TGA GAG CCA AA Chromozom 7A m Marker Primery cfa2174 FACG GCA TCA CAG GTT AAA GG RGGT CTT TGC ACT GCT AGC CT wmc405 F GTG CGG AAA GAG ACG AGG TT R TAT GTC CAC GTT GGC AGA GG Neurčená pozice Marker Primery cfd223 FAAG AGC TAC AAT GAC CAG CAG A RGCA GTG TAT GTC AGG AGA AGC A wmc179 F CAT GGT GGC CATG AGT GGA GGT R CAT GAT CTT GCG TGT GCG TAG G gwm636 F CGG TAG TTT TTA GCA AAG AG R CCT TAC AGT TCT TGG CAG AA 61 C 55 C 60 C 60 C 60 C Ta 51 C 60 C Ta 60 C 61 C Ta 60 C 61 C 50 C Nedenaturující polyakrlyamidová elektroforéza Separace amplifikovaných vzorků DNA z PCR byla provedena pomocí nedenaturující polyakrylamidové elektroforézy v6% gelu o tloušťce 1 mm. Gel byl připraven smícháním 15 ml 5x TBE, 22,5 ml 40% směsi N, N -metylenbisakrylamidu 19 : 1, 110 μl TEMEDu, 1 ml 10% APS a doplněn vodou do 150 ml. Polymerace probíhala asi 40 minut při pokojové teplotě. Ztuhlý gel byl upevněn do elektroforetické aparatury a obě vany (anadová i katodová) byly naplněny 0,5x TBE pufrem. Do spodní, anodové, vany bylo přidáno 10 μl 10% ethidium bromidu. Pro nasycení gelu ethidum bromidem byla aparatura spuštěna na tzv. prerun, asi 1 hodina při 300 V. Poté bylo naneseno 5 μl velikostního markeru a 5 μl amplifikovaného vzorku DNA. Separace probíhala minut při 350 V. Separovaná DNA byla vizualizována a dokumentována systémem Syngene. 39

41 4.4.7 Konstrukce genetické mapy Genetická vazebná mapa byla konstruována za pouţití programu JoinMap 4 (Van Ooijen, 2006) analýzou rekombinační frekvence mezi všemi polymorfními markery. Genetická vzdálenost mezi jednotlivými markery byla vypočítána pomocí Kosambi funkce (Kosambi, 1943). Pro identifikaci vazebných skupin byla pouţita metoda regresního mapování. K identifikaci vazby markerů byly vyuţity pouze kombinace markerů s rekombinační frekvencí menší neţ 0,4 a LOD skóre větším neţ 1. Po přidání kaţdého markeru bylo provedeno přepočítání s ohledem na přilehlé tři markery (tripple) Software Pro zpracování výsledků a konstrukci genetické mapy byl pouţit následující software: JoinMap 4 (Van Ooijen, 2006) vytvoření mapy. Microsoft Office Excel 2007 jednoduché statistické metody a zpracování sesbíraných fenotypických dat. 40

42 5 Výsledky 5.1 Molekulární markery Polymerázová řetězová reakce byla provedena na 184 liniích F 2 mapovací populace s 40 SSR a 2 STS markery, u kterých byl předpokládán polymorfismus na základě genetické mapy DV92 x G3116 z diplomové práce Mgr. Vanţurové. Všechny vybrané markery vykazovaly jednobodový polymorfismus v nové mapovací populaci (viz obr. 13 a 14). Obr. 9: Polymorfismus SSR markeru wmc453 v polyakrylamidovém gelu. M velikostní marker, A rodič DV92, B 258, H heterozygot, K negativní kontrola, 2 13 mapovací populace Obr. 10:Polymorfismus STS markeru owm301v polyakrylamidovém gelu. M velikostní marker, A rodič DV92, B 258, H heterozygot, K negativní kontrola, 2 14 mapovací populace 41