MASARYKOVA UNIVERZITA LÉKAŘSKÁ FAKULTA VYUŽITÍ METODY REAL-TIME PCR V ŠIROKOSPEKTRÉ DETEKCI PATOGENŮ

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA LÉKAŘSKÁ FAKULTA MIKROBIOLOGICKÝ ÚSTAV FAKULTNÍ NEMOCNICE U SVATÉ ANNY a CENTRUM KARDIOVASKULÁRNÍ A TRANSPLANTAČNÍ CHIRURGIE BRNO VYUŽITÍ METODY REAL-TIME PCR V ŠIROKOSPEKTRÉ DETEKCI PATOGENŮ Disertační práce v oboru Lékařská mikrobiologie a imunologie Školitelé: Prof. MUDr. Miroslav Votava, CSc. MUDr. Tomáš Freiberger, Ph.D. Autor: Mgr. Eva Němcová Brno, 2014

2 Abstrakt Úvod: Narůstající počty infekcí způsobených jinými druhy kandid než C. albicans, lišící se rezistence k antimykotikům u jednotlivých druhů a nově se objevující druhy kandid v klinickém materiálu, to vše naznačuje potřebu rychlé a spolehlivé identifikace velkého počtu medicínsky významných druhů kandid. Diagnostika bakteriální infekční endokarditidy (IE) zůstává zatím stále náročnou z důvodu mnohdy nepřesvědčivého klinického obrazu nemoci nebo z důvodu limitací standardních laboratorních metod, kdy není možné patogena detekovat kvůli předchozí léčbě antibiotiky nebo přítomnosti kultivačně náročné nebo pomalu rostoucí bakterie. Metody: Byla vyvinuta metoda real-time PCR zacílená do oblasti ITS2 (UNF-qPCR) s následnou analýzou tání s vysokým rozlišením (High Resolution Melting Analysis, HRMA), testována byla na 25 sbírkových kmenech kandid a validována na 143 klinických izolátech. Všechny sbírkové kmeny i klinické izoláty, u kterých se lišila identifikace pomocí fenotypových metod a HRMA, byly sekvenovány. Pro rychlou a senzitivní detekci bakterií v klinickém materiálu (chlopních) byla vyvinuta metoda real-time PCR zacílená do genu 16S rrna (UNB-qPCR) s následnou sekvenací pozitivních vzorků. Metoda byla testována na 21 sbírkových kmenech bakterií a validována na 28 chlopních od pacientů s podezřením na IE. Bylo analyzováno i 20 chlopní od pacientů s neinfekční diagnózou. K dekontaminaci UNB-qPCR byl použit 8-methoxypsoralen v kombinaci s ozářením UV světlem. Spolu s cílovou sekvencí byla amplifikována i nově navržená exogenní nekompetitivní interní amplifikační kontrola. Výsledky: Při zahrnutí všech sbírkových a klinických kmenů lze konstatovat, že pomocí UNF-qPCR a HRMA bylo odlišeno 23 z 27 druhů kandid a zbylé 4 druhy byly rozděleny do dvou párů. Analýza byla provedena pomocí hodnot tání (Tm ± 3 SD), tvaru derivovaných křivek tání (dmelt křivek) a v některých případech i pomocí křivek odlišností vzhledem k C. krusei. Efektivita navržené UNB-qPCR pro identifikaci bakterií byla vypočítána na 94,4 % s lineárním dynamickým rozsahem od kopií/pcr. Všechny sbírkové kmeny byly určeny správně. Výsledky analýz klinických vzorků pomocí UNB-qPCR se shodovaly s výstupy z námi běžně používané širokospektré end-point PCR. Z porovnání obou metod vyplývá, že UNB-qPCR byla schopna přesněji identifikovat streptokoky na úroveň druhu. Závěr: HRMA je jednoduchá, rychlá a relativně dostupná metoda pro identifikaci širokého

3 spektra druhů medicínsky významných kandid. Mohla by doplnit stávající diagnostické postupy založené na komerčně dostupných biochemických kitech. Navržená UNB-qPCR s následným sekvenováním je vhodná pro identifikaci širokého spektra bakterií. Tato metoda je rychlejší a méně náročná než námi běžně využívaná širokospektrá end-point PCR. Klíčová slova Candida sp., analýza tání s vysokým rozlišením, ITS2, širokospektrá detekce bakterií, PCR sledovaná v reálném čase, gen 16S rrna, sekvenování Abstract Objectives: An increasing trend in non-albicans infections, various susceptibility patterns to antifungal agents and uncommon species emerging in clinical samples implies a requirement for fast and reliable identification of a number of medically important Candida species. The diagnosis of bacterial infective endocarditis (IE) remains challenging due to frequently inconclusive clinical course of the disease and limitations of conventional laboratory tests in cases of previous antibiotic treatment or presence of fastidious or slow-growing bacteria. Molecular methods seem to be an efficient tool to improve a diagnostic power in both circumstances. Methods: Real-time PCR (UNF-qPCR) followed by high resolution melting analysis (HRMA) was developed, tested on 25 reference Candida collection strains and validated on an additional 143 clinical isolates in this study. All reference strains and clinical isolates inconclusive when using phenotypic methods and/or HRMA were analysed using ITS2 sequencing. Fast and sensitive real-time PCR targeting 16S rrna gene (UNB-qPCR) followed by direct sequencing was developed for broad-range detection and identification of bacteria in the heart valves. The assay was tested on 21 reference bacterial strains and validated on 28 heart valve (HV) tissue samples from patients with suspicion of IE and additional control group of 20 HV samples from patients without IE. To avoid contamination of the UNB-qPCR 8-methoxypsoralen in combination with UV radiation was used. An exogenous non-competitive internal amplification control was designed and co-amplified together

4 with the target sequence. Results: Considering reference and clinical strains together, 23 out of 27 Candida species could be clearly distinguished by HRMA, while the remaining 4 species were grouped in 2 pairs, when applying the mean Tm ± 3 SD values, shape of the derivative melting curve (dmelt curve) and, in some cases, the normalized and temperature - shifted difference plot against C. krusei. Efficiency of optimalized real-time broad-range UNB-qPCR was calculated 94.4 % with linear dynamic range copies/pcr. All reference strains could be identified using this newly developed UNB-qPCR. Clinical sample results after UNB-qPCR were in concordance with those of our routinely used end-point broad-range (br) PCR. UNB-qPCR was able to identify streptococci more precisely and thus it showed better resolution than our end-point br PCR. Conclusion: HRMA as a simple, rapid and inexpensive tool was shown useful to identify a wide spectrum of clinically important Candida species. It may complement the current clinical diagnostic approach based on commercially available biochemical kits. The introduced UNB-qPCR followed by direct sequencing showed to be useful in detection of wide range of bacterial species. In addition, the method was faster and less laborious than conventional end-point br PCR. Keywords Candida sp., High resolution melting, ITS2, Broad-range bacteria detection, Real-time PCR, 16S rrna gene, Sequencing

5 Prohlašuji, že jsem disertační práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Tomáše Freibergera, Ph.D. a prof. MUDr. Miroslava Votavy, CSc. s využitím zdrojů uvedených v soupisu literatury. Mgr. Eva Němcová

6 Děkuji MUDr. Tomáši Freibergerovi, Ph.D. za odborné vedení mé práce, cenné konzultace a rady v průběhu celého studia. Za podnětné připomínky bych ráda poděkovala prof. MUDr. Miroslavu Votavovi, CSc. Za možnost studovat a pracovat v Genetické laboratoři CKTCH Brno děkuji doc. MUDr. Petru Němcovi, CSc, MBA. Mé díky patří i kolektivu Genetické laboratoře CKTCH Brno za výbornou spolupráci a příjemné pracovní prostředí. Za poskytnutí mikrobiologického materiálu a identifikaci konvenčními přístupy děkuji doc. Filipu Růžičkovi, Ph.D. Autorům a spoluautorům předkládaných publikací děkuji za spolupráci. Velké díky náleží mým rodičům, bratrovi Milanovi a příteli Petrovi za neustálou podporu a trpělivost v průběhu mého studia.

7 OBSAH 1 Úvod Využití molekulárně-biologických metod pro detekci kandid Kandidová onemocnění Izolace DNA z kandid Cílová místa pro PCR detekci kandid Přehled používaných molekulárně-biologických metod pro identifikaci kandid Metoda analýzy teploty tání s vysokým rozlišením (HRMA) Využití molekulárně-biologických metod pro detekci bakterií Izolace bakteriální DNA Cílová místa pro PCR detekci bakterií Přehled využívaných molekulárně-biologických metod pro detekci bakterií PCR sledovaná v reálném čase (real-time PCR) Interní amplifikační kontrola pro PCR Cíle práce Materiál a metody Mikroorganismy Klinický materiál Kultivace a fenotypová identifikace Kultivace sbírkových kmenů a klinických izolátů Hemokultivace a kultivace klinického materiálu Molekulárně biologická detekce DNA... 29

8 3.4.1 Izolace houbové DNA Izolace bakteriální DNA Analýza sekvencí Širokospektrá detekce houbové DNA pomocí real-time PCR (UNF-qPCR) a HRMA Širokospektrá detekce bakteriální DNA pomocí real-time PCR (UNB-qPCR) a sekvenování End-point PCR Sekvenování Příprava amplifikačních kontrol Výsledky UNF-qPCR a HRMA Analýza sekvencí Sekvenování referenčních kmenů kandid HRMA u referenčních kmenů kandid HRMA u klinických izolátů kandid Fenotypová identifikace klinických izolátů UNB-qPCR a sekvenování Dekontaminace UNB-qPCR Senzitivita a specificita UNB-qPCR Sekvenování referenčních kmenů bakterií Detekce bakteriální DNA přímo z klinického materiálu Diskuze UNF-qPCR a HRMA... 59

9 5.1.1 Heterogenity v klinických izolátech a obtížně rozlišitelné druhy Odlišení fenotypově podobných kandid Poly-fungální vzorky Spolehlivost veřejně dostupných databází pro identifikaci kandid UNB-qPCR a sekvenování Dekontaminace qpcr Návrh exogenní nekompetitivní interní amplifikační kontroly pro UNB-qPCR Spolehlivost veřejně dostupných databází pro identifikaci bakterií Detekce bakteriální DNA přímo z klinického materiálu Širokospektrá PCR pro detekci bakterií Závěr Soupis literatury a pramenů Seznam zkratek Seznam obrázků Seznam tabulek Seznam příloh Seznam odborných publikací autora Seznam publikací a spoluautorských prací Seznam vybraných konferenčních abstrakt Souhrn poznatků disertační práce Přílohy... 91

10 1 ÚVOD Předkládaná disertační práce je svými cíli rozdělena na dvě části, v první je optimalizována metoda pro identifikaci kandid a ve druhé části metoda pro detekci bakterií. Vzhledem k faktu, že práce byla realizovaná v Genetické laboratoři Centra kardiovaskulární a transplantační chirurgie Brno (CKTCH Brno), byla metodika zaměřena na detekci kandid, jako nejčastějšího detekovaného houbového agens u pacientů po transplantaci solidních orgánů a na detekci bakterií s důrazem na validaci metody pro záchyt patogenů v chlopních u pacientů s infekční endokarditidou (IE). Rychlá diagnostika patogenů pomocí molekulárně-biologických metod je přínosná hlavně u pacientů, kteří mají utlumenou imunitu po transplantaci orgánů, čímž se u nich zvyšuje riziko infekce, nebo se u nich projevily infekční komplikace po velkých chirurgických výkonech. U bakteriálních a mykotických infekcí může být účinná i v případech podávání antimikrobiální léčby, kdy klasické kultivační techniky často selhávají. Molekulárně-biologická diagnostika infekčních onemocnění má velké spektrum uplatnění od identifikace patogenů až po jejich genotypizaci. Umožňuje rychlou, citlivou a specifickou detekci patogena i jeho genů rezistence a i když tyto geny ne vždy odráží fenotypový projev, může informace o jejich přítomnosti ve specifických situacích (např. kriticky nemocní pacienti) přispět k optimalizaci léčby. Metody molekulární biologie jsou rozsáhle využívány pro detekci obvyklých i vzácných, kultivačně náročných i nekultivovatelných patogenů a je vyvíjen stále větší tlak na jejich validaci/standardizaci. 1.1 Využití molekulárně-biologických metod pro detekci kandid Byla publikována řada vědeckých článků o detekci kandid pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR), ale z důvodu chybějící standardizace, klinické validace a průkazu, že má aplikace této metody vliv na výsledek léčby pacienta 1,2, nezařadily ji doposud odborné společnosti do svých doporučení. Evropská organizace pro výzkum a léčbu rakoviny - Skupina pro výzkum mykóz (EORTC/MSG) nezahrnula použití PCR do doporučení definic IMO 3 a ani Evropská společnost klinické mikrobiologie a infekčních nemocí (ESCMID) nedoporučila PCR pro diagnostiku jakéhokoli kandidového onemocnění (Tabulka 1) 4. V posledních několika letech je tedy kladen velký důraz na standardizaci PCR pro detekci mykotických onemocnění. 10

11 1.1.1 Kandidová onemocnění Klinicky nejvýznamnější skupinou chorob jsou invazivní onemocnění. Rizikovými faktory invazivního kandidového onemocnění (IKO) u dospělých pacientů na odděleních intenzivní péče (JIP) jsou: dlouhodobý pobyt na nemocničním oddělení ( 4 dny), mechanická ventilace ( 2 dny), kritický stav pacienta, neutropenie, diabetes, selhání ledvin, hemodialýza, užívání širokospektrých antibiotik ( 4 dny), zavedený centrální venózní katetr, parenterální výživa, užívání imunosupresiv, nádorové onemocnění a chemoterapie, akutní pankreatitida, mnohočetná kolonizace kandidami ( 2 místa), chirurgický výkon (především v abdominální oblasti) a transplantace 5,6. Revidovaná kritéria EORTC/MSG rozdělují invazivní mykotické onemocnění (IMO) na prokázané, pravděpodobné a možné. Jako prokázané lze označit onemocnění potvrzené histologickým, cytologickým nebo přímým mikroskopickým vyšetřením vzorku (získaného punkcí či biopsií) nebo kultivačním nálezem ve vzorku sterilně odebraného z primárně sterilního místa (vč. krve) postiženého infekcí. U Cryptococcus sp. stačí sérologický průkaz antigenu v likvoru. Při pravděpodobném onemocnění je potřeba splnit alespoň jednu podmínku ze tří skupin kritérií: faktoru ma straně hostitele, klinického kritéria a mykologického kritéria. V případě, že je splněno pouze kriterium klinické a faktoru hostitele bez přítomnosti mykologického kritéria, jedná se o onemocnění možné 3. Kategorie prokázané IMO může být vztažena na jakéhokoli pacienta, ale kategorie pravděpodobné a možné IMO byly navrženy pouze pro imunokompromitované pacienty. Doposud u nich totiž nebylo nalezeno adekvátní východisko pro stanovení vhodných faktorů na straně hostitele 3. Evropská společnost pro klinickou mikrobiologii a infekční nemoci (ESCMID) vypracovala doporučení pro diagnostiku IKO (Tabulka 1) 4. Další doporučení ESCMID bylo zaměřeno na diagnostiku IMO způsobených vzácnými kvasinkovitými organismy (Tabulka 2) 7. 11

12 onemocnění materiál test doporučení krev hemokultivace základní vyšetření mannan/antimannan doporučeno kandidémie beta-d-glukan doporučeno sérum jiné protilátky žádné - chybí informace septifast PCR Kit žádné - chybí informace in-house PCR žádné - chybí informace krev hemokultivace základní vyšetření mannan/antimannan žádné - chybí informace sérum beta-d-glukan doporučeno septifast PCR Kit žádné - chybí informace IKO in-house PCR žádné - chybí informace přímá MI a HI základní vyšetření kultivace základní vyšetření tkáň a sterilní imuno-histochemie žádné - chybí informace tělní tekutiny PCR z tkáně žádné - chybí informace in situ hybridizace žádné - chybí informace krev hemokultivace základní vyšetření mannan/antimannan doporučeno sérum beta-d-glukan doporučeno chronické diseminované KO orofaryngeální a esofageální KO vaginální KO tkáň a sterilní tělní tekutiny stěr biopsie stěr/vaginální sekret septifast PCR Kit in-house PCR přímá MI a HI kultivace žádné - chybí informace žádné - chybí informace základní vyšetření základní vyšetření imuno-histochemie žádné - chybí informace PCR z tkáně žádné - chybí informace in situ hybridizace žádné - chybí informace kultivace základní vyšetření in-house PCR žádné - chybí informace přímá MI a HI základní vyšetření kultivace základní vyšetření přímá MI a HI základní vyšetření kultivace základní vyšetření komerční testy používat pouze validované in-house PCR žádné - chybí informace Tabulka 1: doporučení pro diagnostiku IKO dle ESCMID 4 (upraveno), IKO invazivní kandidové onemocnění, KO - kandidové onemocnění, MI - mikroskopie, HI histopatologie. 12

13 anamorfa Druh kandidy teleomorfa C. dubliniensis nepopsána C. fabianii C. famata C. guilliermondii Cyberlindnera fabianii Debaromyces hansenii Meyerozyma guilliermondii C. inconspicua nepopsána C. intermedia nepopsána C. kefyr Kluyveromyces marxianus C. lipolytica Yarrowia lipolytica C. lusitaniae Clavispora lusitaniae C. metapsilosis nepopsána C. norvegensis Pichia norvegensis komentář relevantní ke klinickému kontextu blízká C. albicans, citlivost k antimykotikům podobná, ale potenciál stát se rezistentní k flukonazolu má větší 8 klinický význam neurčitý; vzácně způsobuje fungémie 9-11, MIC k flukonazolu vyšší než u C. albicans 12 vzácně způsobuje fungémie, neroste při 37 C - je tedy humánním patogenem? 13 ; vzácně může způsobit fungémie 14 MIC k flukonazolu a echinokandinům vysoké 13 blízká C. norvegensis, citlivost k antimykotikům podobná C. krusei (rezistentní k flukonazolu) 15 orofaryngeální kolonizace, infekce krevního řečiště, peritonitidy. Citlivá k antimykotikům kromě flucitosinu 13 zatím nepopsána rezistence k antimykotikům klinický význam neurčitý, MIC k flukonazolu vyšší než u C. albicans nevhodné lečit amfotericinem B i v případě, kdy je MIC v oblasti citlivosti ( 1 mg/l) 16 blízká C. parapsilosis, citlivost k antimykotikům podobná (vyšší MIC k echinokandinům) 17 blízká C. inconspicua, citlivost k antimykotikům podobná C. krusei (rezistentní k flukonazolu) 15 C. orthopsilosis nepopsána blízká C. parapsilosis, citlivost k antimykotikům podobná (vyšší MIC k echinokandinům) 17 Wickerhamomyces C. pelliculosa anomalus (Pichia MIC k flukonazolu vyšší než u C. albicans 18 anomala, Hansenula anomala) C. pulcherrima Pichia kudriavzevii (Metschnikowia klinický význam neurčitý, vzácně může způsobit infekce 19 pulcherrima) C. rugosa nepopsána MIC k flukonazolu vyšší než u C. albicans 18 C. zeylanoides nepopsána klinický význam neurčitý Tabulka 2: Výběr vzácně se vyskytujících kandid 7 (upraveno) Pacienti po transplantaci solidních orgánů (SOT) jsou nejčastěji ohroženi IMO způsobenými Candida sp. a Aspergillus sp. méně Cryptococcus sp. a jinými vláknitými houbami (Tabulka 3) 20. Incidence mykotických onemocnění (MO) po SOT se pohybuje v rozmezí 5-10 % v závislosti na transplantovaném orgánu 21. Riziko MO je nejvyšší u pacientů po transplantaci tenkého střeva a plic, poté jater, srdce, slinivky břišní a ledvin 20. Významějšími faktory u vzniku IMO, než je počet dní po transplantaci, jsou imunosuprese, 13

14 antimykotická profylaxe a působení vnějšího prostředí na pacienta. Medián počátku IKO se pohybuje od několika týdnů až měsíců u pacientů po transplantaci plic a jater až po dobu dvou a více let u pacientů po transplantaci ledviny 22. Hlavním zdrojem IKO bývá gastrointestinální trakt, intravaskulární katétry a močové cesty. Incidence IKO u pacientů po SOT je odhadovaná na 2 % a mortalita IKO po 12 měsících na 34 % 20. Mezi preventivní opatření MO u SOT patří např. kontraindikace transplantace v případě, že má donor aktivní MO, a kontrolní kultivace média, v němž se orgány uchovávají 23. Záchyt kandid ve stolici, na kůži, drénech, v respiračních sekretech a moči nemusí vždy indikovat infekci, ale může pro pacienta znamenat vyšší riziko pro rozvinutí KO. Naopak detekce kandid z primárně sterilního materiálu (krve, inta-abdominální tekutiny, abscesu) znamená přítomnost infekce. Druhová identifikace kandid je poté důležitá z důvodu mezidruhové variability kandid ve stupni patogenity a citlivosti k antimykotikům 24. Typ IMO Játra (n= 378) Ledviny (n = 332) Slinivka břišní (n = 128) Plíce (n = 248) Srdce (n = 99) Tenké střevo (n = 22) Kandidy 255 (68) 164 (49) 97 (76) 56 (23) 48 (49) 19 (85) Aspergily 42 (11) 47 (14) 6 (5) 109 (44) 23 (23) 0 (0) Zygomycety 9 (2) 8 (2) 0 (0) 8 (3) 3 (3) 0 (0) Jiné vláknité houby 9 (2,4) 10 (3) 4 (3,1) 49 (19,8) 7 (7,1) 0 (0) Nespecifikované vláknité houby 8 (2,1) 7 (2,1) 0 (0) 7 (2,8) 2 (2) 0 (0) Kryptokoky 24 (6) 49 (15) 6 (5) 6 (2) 10 (10) 1 (5) Endemické mykózy 17 (5) 33 (10) 8 (6) 3 (1) 3 (3) 0 (0) Pneumocysty 0 (0) 5 (1) 1 (1) 4 (2) 3 (3) 0 (0) Jiné kvasinky 9 (2,4) 6 (1,8) 5 (3,9) 0 (0) 0 (0) 1 (5) Nespecifikované kvasinky 5 (1,3) 3 (0,9) 1 (0,8) 6 (2,4) 0 (0) 1 (5) Tabulka 3: Počet (%) případů IMO u pacientů po SOT (1063 pacientů s 1208 IMO) 20 (upraveno) Izolace DNA z kandid Efektivní proces izolace houbové DNA je jednou ze základních podmínek úspěchu molekulárně-biologických metod. Kritickými body jsou výběr vhodného klinického materiálu a s tím spojená senzitivita izolace. Jelikož jsou kandidy komenzály lidského těla (horní dýchací cesty, gastrointestinální trakt, vagína, kůže apod.), je vhodné vybrat pro jejich detekci pomocí PCR primárně sterilní materiál. Pro diagnostiku IKO pomocí PCR se jeví nejdostupnějším materiálem krev a její frakce 1, tedy i nejvhodnějším z pohledu pacienta 14

15 na JIP, pro něhož není invazivní zákrok, jako je biopsie ložiska, vždy možný. Limitujícím faktorem senzitivity izolačního procesu je i původ houbové DNA přítomné v klinickém materiálu, tedy zda pochází z živých nebo mrtvých buněk 1,25. Důležitý je výběr takové metody, aby bylo možné její pomocí rozrušit buňky kvasinek a zároveň bylo omezeno riziko kontaminace vzorku z prostředí, příp. z reagencií. Dle doporučení minimální informace pro publikaci metod založených na kvantitativních PCR v reálném čase (MIQE) 26 je nutné izolovat DNA v laminárním boxu v místnosti určené pouze pro izolaci DNA a používat reagencie, které neobsahují žádnou DNA. Maaroufi a kol. (2004) 27 testovali pět protokolů izolace houbové DNA kandid ze séra. Pomocí PCR sledované v reálném čase (real-time PCR) zjistili, že je metoda, kdy sérum projde varem v alkalickém roztoku guanidin-fenol-trisu a následně je DNA izolována pomocí chloroformu a isopropanolu, stejně citlivá jako izolace pomocí komerčně dostupného QIAamp DNA blood kitu (Qiagen) tj. 10 CFU/ml 27. Metwally a kol. (2008) 28 testovali sedm protokolů pro izolaci DNA hub z plné krve. Nejoptimálnějších výsledků (s ohledem na senzitivitu, cenu a délku izolace) bylo dosaženo použitím YeaStar genomic DNA kitu (Zymo Research), který je založen na enzymatické lyzi buněčné stěny hub a následném přečištění DNA pomocí kolonek. Jako referenční metodu použili QIAamp DNA mini kit (Qiagen) ve spojení s lytikázou pro rozrušení buněčné stěny hub a vynechali působení NaOH. Tento protokol byl stejně senzitivní jako kit YeaStar genomic DNA, ale byl finančně nákladnější a trval delší dobu 28. Poté se Metwally a kol. (2008) 29 zaměřili na výběr klinického materiálu porovnali vhodnost séra a plné krve pro detekci kandid u kriticky nemocných pacientů (bez neutropenie). Z dat vyplynulo, že je sérum vhodným výchozím materiálem pro detekci kandid, ale studie byla omezena pouze na jedno centrum a nebylo možné z ní vyvozovat jasná doporučení pro další laboratoře 29. Lau a kol. (2010) 25 porovnali krev, sérum a plazmu pro včasnou detekci kandidémie. I přes malý počet vzorků doporučili pro izolaci DNA kandid sérum a plazmu místo krve, jelikož byla DNA kandid detekována častěji v séru (71 %) a plazmě (75 %) než v plné krvi (54 %). Důvodem mohl být fakt, že je v krvi přítomna DNA volná i vázaná na buňky (leukocyty, buňky hub) a při izolaci z krve je všechna volná DNA odstraněna při lyzi erytrocytů a při odstraňování inhibitorů 25. V případě živých/neporušených fungálních buněk by tedy bylo vhodné izolovat DNA z plné krve, naopak volnou DNA z mrtvých buněk je možné izolovat i ze séra 29. Ve své studii Lau a kol. (2010) 25 zaznamenali i vliv skladování primárních vzorků pro detekci DNA pomocí mnohočetné vícekrokové PCR (multiplex-tandem PCR) (MT-PCR). Zjistili, že je výhodnější zamražení krve na -20 C než její uchovávání při 4 C nebo než izolace přímo z odebrané krve bez uskladnění. Detekční 15

16 limit MT-PCR byl pro většinu kandid 10 CFU/ml kromě C. krusei (100 CFU/ml) a senzitivita při izolaci z krve byla 75% a negativní prediktivní hodnota (NPV) 85% Cílová místa pro PCR detekci kandid Bylo publikováno mnoho genů vhodných jako cíl pro detekci kandid pomocí PCR. Výhodnější se jeví geny, které jsou v buňce obsaženy ve více kopiích a zvýší tak senzitivitu záchytu oproti genům přítomným pouze v jedné kopii 2. Nejčastěji jsou amplifikovány oblasti rrna genů 5S, 18S, 28S (především méně konzervativní oblast D1 - D2) a dále variabilní oblasti ITS1 a ITS2 30,31. Dalšími cílovými geny využívanými pro detekci kandid jsou geny pro tvorbu aktinu (ACT1) 32, proteinu teplotního šoku 90 (HSP) 33, chitin syntázy (CHS1) 34, aspartyl proteinázy (SAP 1-6) 35, fragment genu EO3 36 a gen pro manoprotein o velikosti 65 kda (MP65) Přehled používaných molekulárně-biologických metod pro identifikaci kandid Avni a kol. (2011) 38 publikovali meta-analýzu 54 studií (4694 pacientů, z nichž 963 mělo prokázané/pravděpodobné nebo možné IKO) založených na detekci IKO z krve pomocí PCR. Senzitivita a specificita byly velmi dobré (95 % a 92 %) v případě, že se jednalo o vzorky pacientů s prokázanou kandidémií. Pokud se do analýzy zařadily i vzorky pacientů s pravděpodobným a možným IKO, senzitivita PCR poklesla a specificita zůstala přibližně stejná (73 % a 91 %). Dále autoři zaznamenali proměnné, které měly vliv na vyšší senzitivitu: krev použita jako výchozí materiál místo séra, izolace DNA pomocí QIAamp kitu (Qiagen), PCR cílená na geny rrna nebo P450, dále PCR specifická pro kandidy a detekční limit in vitro 10 CFU/ml. Pokud byla u pacienta provedena více než jedna PCR, přispěla k vyšší specificitě metody 38. Žádná ze studií ale neumožnila stanovit vliv vyšší senzitivity a dřívější diagnostiky IKO pomocí PCR na klinické výsledky pacientů. Dle Ostrosky-Zeichner (2012) 39 by měly být studie plánované na základě standardních definic IMO uvedených např. v publikaci De Pauw a kol. (2008) 3. Techniky molekulární biologie používané pro detekci hub jsou založeny převážně na PCR, která je buď specifická, nebo širokospektrá. Následně je možné patogen dourčit pomocí délkového polymorfismu restrikčních fragmentů (RFLP) 40,41 nebo sekvenování 42,43 a v posledních letech i sekvenování nové generace 44,45. Většina studií je zaměřena na real-time PCR s použitím specifických sond 27, Další autoři publikovali studie s různými metodikami jako např. částečně dvoukrokovou PCR (semi-nested PCR) 50, MT-PCR 51, mnohočetnou PCR (multiplex PCR) 52,53, fluorescenční in situ hybridizací založenou na uměle 16

17 syntetizovaných analozích nukleových kyselin (PNA-FISH) 54,55, hmotnostní spektrometrií typu MALDI-TOF 56-58, isotermální amplifikací spojenou s reverzní transkripcí umožňující detekci převážně RNA (NASBA) 59 nebo spojení PCR s hmotnostní spektrometrií (PCR-ESI/MS) Neobvyklé postupy detekce popsali např. Muir a kol. (2011) 63, kteří detekovali kandidy pomocí elektrochemicky značených DNA sond, nebo Bisha a kol. (2011) 64, kteří upravili fluorescenční in situ hybridizaci založenou na DNA (DNA-FISH) pro detekci kandid pomocí průtokové cytometrie. Výše uvedené postupy jsou ale pracné nebo drahé (např. nákup přístroje pro hmotnostní spektrometrii), příp. nejsou schopny rozlišit větší množství druhů kandid v jednom experimentu nebo nemají dostatečně obsáhlou databázi zahrnující i nově se objevující či neobvyklé patogeny Metoda analýzy teploty tání s vysokým rozlišením (HRMA) HRMA byla vyvinuta roku 2003 jako jednoduchá metoda pro analýzu genotypů, vyhledávání mutací a porovnávání podobnosti sekvencí 65,66. HRMA je jednoduchá a levná metoda, která závisí na kvalitní DNA i PCR 67-69, vhodném přístroji 70,71 a interkalační barvičce 72, která musí dvouřetězcovou (dsdna) plně saturovat (Obrázek 1) a zároveň nesmí inhibovat PCR 73, vhodné jsou např. EvaGreen, LCGreen a SYTO Obrázek 1: Nesaturující a saturující barviva: A) při použití nesaturujícího barviva (např. SYBR Green I), se mohou molekuly barvičky během tání přemístit do částí dsdna, které ještě netály, což zapříčiní malou nebo nehomogenní změnu teploty v křivce tání. B) při použití saturujícího barviva (např. SYTO 9) se nemohou molekuly barviva přemístit do plně saturované dsdna, což se projeví na profilu tání, který přesněji odpovídá sekvenci DNA 74 ( upraveno). Princip HRMA je založen na PCR v přítomnosti fluorescenční saturační barvičky a následném odečtu fluorescence uvolňované při denaturaci dsdna tzn. tání výsledného 17

18 produktu PCR 66. Jakákoli dsdna totiž v přítomnosti saturačního interkalačního barviva fluoreskuje při nízkých teplotách a jakmile se teplota postupně zvyšuje, dsdna denaturuje a fluorescence se pomalu snižuje až do momentu, kdy prudce klesne, čímž kopíruje stav v reakci, kde dsdna roztála do dvou jednořetězcových vláken (ssdna). Tato teplota tání (Tm) dsdna a profil křivky tání závisí na délce sekvence, procentuálním obsahu GC a sekvenci a odpovídá 50 % dsdna, která již denaturovala do formy ssdna (Obrázek 2) 65. Z výpočtu Tm = 81,5 + 16,69 (log [Na + ]) + 0,41 (% G + C) (500/délka sekvence), je možné odvodit, že se změna Tm ( Tm) při jedné záměně G - C A - T rovná hodnotě (41/délka sekvence) v C 75. Obrázek 2: Křivka tání (po normalizaci dat) ( upraveno) Při analýze jsou hrubá data po odstranění pozadí automaticky pomocí softwaru normalizována, tj. počátek i konec fluorescence křivek tání jsou zpracovány na stejnou výchozí a konečnou hodnotu, poté jsou data automaticky teplotně upravena a následnou zápornou derivací fluorescence a teploty jsou zobrazeny píky křivek tání a z nich odečtena hodnota Tm. Dále je možné dle potřeby vyhodnotit křivky odlišností (tzv. difference curve), které zobrazí normalizované křivky vzhledem k vybrané křivce 66. Tm je vhodná veličina k odlišení změn v sekvenci, ale více informací poskytne spolu s křivkou tání, která je závislá na sekvenci 65,75. Reed a Wittwer (2004) 76 ve své práci doporučili pro nejlepší rozlišení jedno-nukleotidových heterozygotních změn amplifikovat úsek o délce do 300 bází, ale i 600 a 700 bází dlouhé sekvence bylo možné bezchybně odlišit. Chyby v rozlišení zaznamenali u 400, 800 a 1000 bází dlouhých sekvencí. Autoři vyhodnotili metodu HRMA jako stejně citlivou nebo i citlivější než jiné doposud používané metody, např. polymorfismus konformace jednořetězcové DNA (SSCP), vysokoúčinnou kapalinovou 18

19 chromatografii (HPLC), či elektroforézu v gradientovém denaturačním gelu (DGGE) 76. Výhodou metody je provedení PCR i HRMA v jedné mikrozkumavce, čímž se minimalizuje jak riziko kontaminace, tak možnost chyb v procesu, dále není potřeba dalších separačních technik a urychlí se tedy celý proces detekce 66. Oproti sekvenační reakci je HRMA mnohem levnější, není potřeba ani žádná fluorescenčně značená sonda jako pro real-time PCR, pouze kvalitní interkalační barvička. Nutností je mít přistroj určený pro HRMA nebo pro ni adaptovaný, i když adaptované nemají stejně dobré rozlišovací schopnosti 71. Kromě humánní genetiky 77 se HRMA rozšířila také do bakteriologie 78-81, virologie 82,83 a mykologie Využití molekulárně-biologických metod pro detekci bakterií Ačkoli byl v mnoha studiích prokázán přínos PCR pro detekci IE 93-95, nebyla doposud tato metoda zařazena mezi hlavní ani vedlejší Duke kritéria 96, dle nichž se diagnostika IE řídí a tedy ani do doporučení ESCMID 97. Habib a kol. (2009) 97 doporučili využít PCR z chlopně nebo embolu u pacientů s IE, kteří podstoupili operaci a měli negativní výsledek hemokultur. Dále bylo v doporučeních ESCMID zmíněno využití PCR z chirurgického materiálu (jako jedné z metod) pro detekci náročných bakterií jako je Bartonella sp., Brucella sp., Coxiella burnetii, Legionella sp., Mycoplasma sp., Tropheryma whipplei Izolace bakteriální DNA Kritickým místem v aplikaci molekulárně-biologických metod je pre-analytická příprava vzorku a extrakce DNA. Ideální metoda pro detekci IE by měla být schopna zachytit minimální množství DNA patogenu již z krve, v níž bývá množství bakterií velmi malé cca 1 10 CFU/ml 98. Protokol pro izolaci bakteriální DNA se obvykle skládá z chemické, mechanické nebo enzymatické lyze buněk, což je důležitý krok, jelikož struktura bakteriální stěny může ovlivnit efektivitu izolace DNA 99. Následuje odstranění všech inhibitorů PCR, extrakce DNA a její přečištění. Yang a kol. (2011) 100 porovnali jeden manuální a šest automatických komerčně dostupných kitů pro izolaci DNA/RNA virů i bakterií (testováno pět patogenů) z nazálních výplachů. Použité kity se lišily vstupním objemem vzorku, délkou protokolu a kapacitou, což může vést k odlišnostem v lýze a schopnosti odstranit inhibitory reakce. Cílová DNA byla detekována pomocí specifických real-time PCR. Žádný z kitů nebyl výjimečný, ale MagNa Pure Compact (Roche, Švýcarsko) se ukázal vhodnějším pro izolaci 19

20 DNA gram-pozitivní bakterie Streptococcus pyogenes, zatímco KingFisher ml (ThermoFisher Scientific Inc., USA) a EasyMag (biomérieux, Francie) pro izolaci RNA virů 100. Hansen a kol. (2013) 101 porovnali čtyři komerčně dostupné kity pro izolaci DNA z krve (QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen), MagNA Pure LC Microbiology Kit M Grade (Roche), MolYsis Complete5 Kit (MolZym), MagSi-DNA Isolation Kit for Blood (MagnaMedics)). DNA byla poté detekována pomocí multiplex real-time PCR pro detekci Staphylococcus aureus a genu rezistence k methicilinu. U všech kitů byl použit pro pre-analytickou přípravu vzorků kit MolYsis Basic (MolZym), který selektivně odstranil lidskou DNA. Pro porovnání byla souběžně izolována DNA dvěma kity bez použití tohoto ošetření. Nejlepším kitem pro izolaci DNA bakterií z krve byl MolYsis Complete5 Kit se senzitivitou 50 CFU/ml tzn. 4 CFU/PCR, pravděpodobně i díky většímu vstupnímu objemu a pre-analytické přípravě vzorků. Autoři ale neprokázali, že by izolace DNA založená na magnetických kuličkách byla vhodnější než použití kolonek a centrifugace 101. Gosiewski a kol. (2014) 102 porovnali čtyři typy pre-analytické přípravy vzorků krve: a) 0,17 M roztok chloridu amonného pro lyzi erytrocytů, b) mechanické rozrušení buněk pomocí skleněných kuliček a přístroje FastPrep, c) enzymatickou lyzi bakterií s použitím lysozymu, lysostaphinu a lytikázy při 37 C, d) působení 50 mm hydroxidu sodného při 95 C. DNA bakterií a hub byla dále izolována pomocí pěti komerčních kitů za účelem výběru nejvhodnějšího: GeneMATRIX Quick Blood DNA Purification Kit (EURx), GeneJET (Fermentas, Litva), QIAamp DNA Blood (Qiagen), Blood Mini (A&A Biotechnology), Genomic Mini (A&A Biotechnology). DNA byla detekována pomocí specifických PCR pro jednotlivé patogeny. Výsledkem optimalizace byla pre-analytická příprava vzorku založená na kombinaci mechanické, chemické a teplotní lyze následovaná izolací DNA pomocí GeneMATRIX Quick Blood DNA Purification Kitu. Limity detekce metody pro jednotlivé patogeny byly 3 CFU/ml Escherichia coli, 30 CFU/ml S. aureus i Candida albicans a 300 CFU/ml Aspergillus fumigatus 102. Výsledky se liší od komerčně dostupných certifikovaných (CE - IVD) kitů, u LightCycler SeptiFastu (Roche, Švýcarsko) udává výrobce limit detekce 3, resp CFU/ml podle druhu zachyceného mikroorganismu 103. Při použití SepsiTestu (Molzym, Německo) byl popsán limit detekce pro gram-pozitivní bakterie CFU/ml, pro gram-negativní bakterie CFU/ml podle druhu zachyceného mikroorganismu v krvi 104. Odlišnosti mohou být dány různými vstupními objemy krve, elučními objemy a objemy PCR. Izolaci DNA z tkání optimalizovali Mygind a kol. (2003) 105. Aterosklerotické tkáně uměle očkovali C. pneumoniae a testovali pět postupů izolace: fenol/chloroform, fenol/chloroform 20