Buněčný cyklus, onkogeny a nádorové supresory

Transkript

1 Buněčný cyklus, onkogeny a nádorové supresory Barbora Fialová, Jan Bouchal a Jiří Ehrmann Laboratoř molekulární patologie LF UP

2 Přehled 1) Rozdělení buněčného cyklu, jeho iniciace a vlastní mechanismus 2) Proliferace, diferenciace 3) Průtokový cytometr 4) Onkogeny, aktivace onkogenů a jejich funkce 5) Nádorové supresory

3 Buněčný cyklus (BC) základní mechanismus rozmnožování všech buněk organismu evolučně konzervovaný proces všech eukaryotických buněk studium mechanismů kontroly BC je středem velkého zájmu Nobelovy ceny za medicínu (2001) Hartwell objasnil systém regulace BC Nurse - objevil cyklin-dependentní kinázy (Cdk) = enzymy, které fosforylují podřízené proteiny cyklu Hunt - popsal první cyklin jako regulační protein nutný pro enzymovou aktivaci Cdk

4 Buněčný cyklus ovlivňuje kontakt buňky s okolím přítomnost mitogenních signálů změny stavu jaderné membrány a chromatinu Rozdělení aktivit buňky do buněčných fází

5 Buněčný cyklus Časové trvání všech fází dohromady = délka buněčného cyklu nebo generační doba buňky G1 fáze časově nejvariabilnější S + G2 + M fáze časově konstantní

6

7 Interfáze (G1 + S + G2) transkripce genů a syntéza proteinů buňka roste (zvětšuje většinu buněčných struktur) replikace DNA (dvojnásobné množství)

8 Profáze kondenzace chromozomů vznik mitotického aparátu tvořeného mikrotubuly

9 Prometafáze rozpad jaderného obalu přechod mikrotubulů do jádra připojení mikrotubulů ke kinetochorům (tělísko v místě centromery chromatid)

10 Metafáze a anafáze posun chromozomů do ekvatoriální roviny oddělení chromatid a posun k opačným pólům buňky

11 Telofáze dekondenzace chromozomů rekonstrukce jaderného obalu

12 Regulace a kontrolní body BC restrikční bod G1 kontrolní body G2/M molekula p53 centrum pro organizaci mikrotubulů (MTOC) poruchy vzniklé při replikaci, distribuci genetického materiálu vážné následky pro buňku a organismus zpětnovazebná kontrola vnitřními mechanismy buňky

13 Aktivace fází BC zahájení a průběh fází BC - řízenou aktivací katalytických komplexů cyklin/cdk cykliny A- I, K, T proteiny podílející se na průběhu fází BC Cdk cyklicky aktivované proteinkinázy regulace akumulací a degradací cyklinu Cdk 1-12, strukturální a hmotnostní podobnost Cdk aktivní pouze v komplexu s cyklinovou podjednotkou syntéza či destrukce příslušných cyklinů v určitých fázích BC aktivita komplexů cyklin/cdk regulace přechodu G1-S-G2 fáze

14 Regulace aktivity cyklin/cdk správný průběh jednotlivých fází BC závisí na několika klíčových faktorech typ cyklinů regulace transkripce a translace posttranslační modifikace cyklin/cdk katalyticky aktivní pouze v dané fázi BC

15 Regulace aktivity cyklin/cdk řízení exprese jejich složek a ubikvitin-dependentní degradaci cyklinové podjednotky tvorba a rozpad komplexů katalytických podjednotek Cdk s cykliny posttranslační modifikace komplexů cyklin/cdk (fosforylace, defosforylace) inhibice Cdk specifickými polypeptidovými inhibitory

16 Regulace aktivity cyklin/cdk Vliv přirozeně se vyskytujících proteinových inhibitorů: 1. inhibitory třídy INK4 (p15, p16, p18, p19) přísně specifická pro cyklin D-dependentní kinázy Cdk4 a Cdk6 spojována s řízením G1 fáze 2. inhibitory třídy CIP/KIP (p21, p27, p57) přednostně inhibují Cdk v G1 a S fázi schopnost inhibovat i ostatní Cdk p21: - blokování interakce komplexu se substrátem - tvorba také stimulována p53 po detekci poškození DNA - spojovací článek mezi p53 a prb

17 Proliferační kinetika vs. tumorigeneze buňky proliferují, jsou-li stimulovány signály okolních buněk, nedostanou-li tyto signály, vstupují do G0 fáze kontrola proliferace, diferenciace a apoptózy buněk je úzce spjata s procesem onkogeneze většina nádorových buněk obsahují mnohočetné genetické změny podporující proces tumorigeneze proliferační schopnost buněk - proteiny PCNA, Ki-67 morfologické zhodnocení diferencovanosti analýza průtokovým cytometrem upřesnění diagnózy a výběr terapie

18 Stanovení množství DNA pomocí průtokového cytometru

19 Stanovení množství DNA pomocí průtokového cytometru stanovení S fáze buněčného cyklu je důležitým ukazatelem proliferační aktivity nádoru

20 Onkogeny

21 Onkogeny objeveny díky retrovirům nesoucím virové analogy lidských onkogenů základy teorie o existenci onkogenů datovány do r Rous: přenosný sarkom u kuřat (Rous Sarcoma Virus - RSV) RSV - RNA virus (retrovirus) - reverzní transkriptáza - virus inkorporovaný do DNA hostitele = provirus

22 Onkogeny Nádory výsledkem mutací buňky nereagují na regulační faktory buněčného dělení a přežívání schopnost proliferovat bez normálních zábran Poruchy diferenciace Inaktivace apoptózy Aneuploidie

23 Protoonkogeny a normální růst buňky Protoonkogeny (PO) =tvoří normální vybavení genomu = kódují proteiny řídící proliferaci diferenciaci přežívání buněk = mutací přeměněny na onkogeny (somatická buňka - přes 100 různých PO) Onkogeny = všechny aktivní geny schopné způsobit či podpořit nádorovou transformaci = mutací se zvýší aktivita nebo množství proteinových produktů = onkoproteinů

24 Onkogeny Celulární (c-onc) = geny vznikající aktivací protoonkogenů Virální (v-onc) = geny virů zodpovědné za maligní transformaci RNA viry retroviry (HIV-1, HIV-2, lidské lymfotropní viry typu I) DNA onkoviry kódují proteiny, které interagují s nádorovými supresory (adenoviry, papilomaviry, herpes viry, HBV)

25 Aktivace onkogenů Mutace = zvýší aktivitu anebo množství onkoproteinu (kvantitativní změny exprese onkogenu) = syntéza onkoproteinu se změněnou funkcí (kvalitativní změny) Téměř vždy dominantní stačí aktivace 1 alely protoonkogenu Fúzní proteiny s nepřirozenou regulací Spontánní dimerizace a aktivace nezávislá na ligandu Trvalá aktivace (delece oblasti s negativní regulační funkcí)

26 Mechanismus aktivace onkogenů Bodová mutace záměna nukleotidu vedoucí ke změně pořadí AMK (př. geny rodiny ras: vliv na vazbu produktů k proteinu GAP) Amplifikace zmnožení genu, prokázána v četných nádorech (př. N-myc v neuroblastomu) Translokace přesuny ovlivňující expresi nebo funkci protoonkogenů (př. během připojení c-myc ke genům pro syntézu Ig - Burkittův lymfom) Transdukce implantace protoonkogenu do virového genomu vysoká exprese transdukovaného genu vliv na homeostázu buněk (př. akutně transformující retroviry, RSV) Inzerční mutageneze vložení retrovirových promotorů a enhancerů do genomu hostitelské buňky, do blízkosti protoonkogenu (př. c-myc, c-erbb)

27 Funkce c-onc 1. Transkripční regulační faktory (Myc, Fos, Jun) 2. Proteinkinázy (intracelulární - IC a transmembránové - TM) a receptory růstových faktorů (Src, Abl, Erb) 3. Růstové faktory (Int, Sis) 4. Signální transduktory (Ras) 5. Inaktivující nádorové supresory (MDM2, E6, E7) 6. Blokující apoptózu (= antiapoptotické, Bcl-2)

28 Jaderné onkoproteiny - vazba na DNA myc fos, jun 1. Onkogeny kódující transkripční regulační faktory - imortalizační aktivita klíčový gen pro kontrolu proliferace a diferenciace 6 členů; jen u proliferujících buněk s proliferačním potenciálem funguje jako - promotor replikace DNA - regulátor přechodu z fáze G0 do G1 - regulátor buněčné proliferace časné geny indukované růstovými faktory a hormony vazba na promotory různých genů = regulace proliferace, apoptózy, angiogeneze c-jun za normál. podmínek neindukuje transformaci, teprve porucha regulace jeho exprese nádorová transformace

29 2. Onkogeny kódující proteinkinázy a receptory růstových faktorů src abl erb rodina onkogenů, kódují jen IC proteinkinázy s tyrosin-specifickou aktivitou aberace vedoucí k vyšší kinázové aktivitě = stimulují nádorový růst u mnoha typů buněk buněčný homolog transformuje sekvence v-abl Abelsonova viru myší leukemie (retrovirus s defektní replikací transformující fibroblasty na lymfoidní buňky) erba, erbb onkogeny viru ptačí erytroblastózy erbb je homologní s částí EGFR (receptor pro epidermální růstový faktor) c-erbb-2 identický s HER2/neu kóduje receptor pro růstový faktor podobný EGFR amplifikace HER2/neu u 30 % případů nádorů prsu

30 3. Onkogeny kódující růstové faktory Int aktivuje se integrací myším onkovirem u karcinomů mléčné žlázy kóduje proteiny rodiny fibroblastického růstového faktoru (FGF) Sis opičí sarkomový virus izolovaný z fibrosarkomu odvozen od genu pro PDGF (destičkový růstový faktor) silný mitogen mezenchymálních buněk

31 Ras 4. Onkogeny kódující signální transduktory rodina onkogenů, každý kóduje polypeptid - onkoprotein p21 (21 kd) vazba p21 ras k GTP = aktivní forma, je regulována GAP proteiny (GAP pomocí enz. GTPázy konvertují p21 ras na neaktivní GDP vázající proteiny) po aktivaci proteiny p21 ras stimulují buněčné dělení aktivní p21 ras komplexy s produkty raf genu aktivace raf stimuluje MAPK dráhu fosforylace a aktivace transkripčních faktorů fos a jun (signální dráha ras-raf-map-fos+jun) mutantní ras onkogeny nehydrolyzují GTP trvale aktivní onkogenní proces cca 15 % nádorů (karcinomů, sarkomů, melanomů, leukemií) obsahuje mutovaný c-ras

32 5. Onkogeny inaktivující nádorové supresory E6, E7 součást genomu onkogenních HPV (lidský papilomavirus) jejich produkty vytváří komplexy s p53 a prb = inaktivace imortalizace buněk nádorový růst MDM-2 nadměrná exprese onkoproteinu nádorová transformace buněk (téměř totéž jako mutace p53) udržuje hladinu p53 na nízké úrovni a inhibuje jeho transkripční aktivitu po vazbě na p53 zablokování jeho transkripční domény stimulace degradace p53 zpětnovazebný vztah s p53

33 6. Onkogeny blokující apoptózu (= anti-apoptotické) Rodina Bcl-2 mají vztah k buněčné smrti, ne k proliferaci jeho produkt je homologní s produkty genů viru EB chrání buňky před zánikem - apoptózou podpora vývoje nádoru či selhání terapie př. Folikulární lymfomy Hormonálně dependentní nádory (Ca mléčné žlázy, prostaty, vaječníku) nadměrná exprese Bcl-2 rezistence buněk vůči apoptóze nádorový růst

34 Rodina proteinů Bcl-2 klasifikace podle počtu společných domén (BH1-4) tvorba hetero a homodimerů

35 Geny kódující nádorové supresory

36 Nádorové supresory = tumor suprimující geny kódují proteiny kontrolující BC, ztráta jejich funkce zodpovědná za změněný fenotyp nádorové buňky antionkogeny pojistky buněčného cyklu brání abnormální proliferaci a přenosu poškozené genetické informace inaktivace, dysfunkce ztráta kontrolních mechanismů transformace buněk v somatických i zárodečných buňkách mutace recesivního charakter - nutný defekt obou alel = ztráta heterozygotnosti fenotypu (Loss of heterozygosity LOH)

37 Identifikace antionkogenů identifikovány později než onkogeny obtížnější než u onkogenů (vnesení antionkogenu do normální buňky = prakticky nepozorovatelné) cytogenetické studium vrozených chromosomálních změn u pacientů s nádorem analýza vedoucí k lokalizaci genů zodpovědných za predispozici k tvorbě určitého typu nádorů studie sledující LOH nebo ztráty alel při srovnávání normální a nádorové tkáně

38 Přehled nádorových supresorů p53 prb NF-1 NF-2 APC WT-1 PTEN BRCA 1, 2 p16 INK4

39 p53 (STRÁŽCE GENOMU) tumor supresorový gen lokalizovaný na chromozomu 17p13.1 tetramerová struktura (53 kd), 4 strukturně-funkční domény transkripční jaderný faktor regulující stovky genů (uplatňují se při blokaci BC a apoptóze) konstitutivně exprimován, přesto je jeho hladina v normální buňce nízká nádorové buňky - exprese p53 nezměněna regulován pomocí degradace (MDM2-E3-ubiquitinligázou, přičemž transkripce MDM2 je řízena p53 = zpětnovazebná autoregulační smyčka)

40 Aktivace a funkce p53 závisí na povaze stresového signálu nutriční stres, poškození DNA, aktivace onkogenů blok replikace poškozené DNA (blok BC) blok angiogeneze aktivace DNA reparačních genů nenávratné poškození DNA vede k apoptóze mutace p53 replikace poškozené DNA rezistence vůči apoptóze nádorový růst

41 Inaktivace p53 ~ mutací (somatické i germinální buňky) = ztráta schopnosti interakce s cílovou sekvencí 50 % všech nádorů zahrnuje mutace p53 (inaktivace obou alel genu karcinomy plic, tlustého střeva, mléčné žlázy) 90 % mutací u karcinomu kůže 80 % bodových mutací a 20% zlomů inaktivace zvýšenou expresí MDM2 i virovými onkoproteiny - adenovirální protein E1B - protein E6 lidského papilomaviru - velký T-antigen viru SV Wild type p53 Mutovaný p53

42 Detekce p53 imunohistochemie Western blot analýza wild type p53 nestabilní mutovaný p53 stabilní možnost detekce Příklad western blot analýzy exprese proteinu p53

43 prb první objevený nádorový supresor (1986) protein retinoblastomu (prb) - maligní nádor retiny 40 % případů familiárních a 60 % sporadických familiární forma = vrozený defekt 1 alely prb ve všech buňkách organizmu k rozvoji nádoru defekt druhé alely v jakékoliv buňce (LOH) sporadická forma = obě mutace v jedné buňce abnormální exprese produktu prb i u jiných typů nádoru (př. osteosarkom) jaderný fosfoprotein, kontrola transkripce genů regulujících BC více než 10 fosforylačních míst regulace vstupu do S fáze buněčného cyklu inaktivace význam pro celou řadu lidských nádorů

44 Regulace prb nefosforylovaná forma prb = aktivní blokuje přestup z G1 do S-fáze (antiproliferační aktivita) hyperfosforylovaná forma prb = inaktivní zvýšená proliferace buněk i v nepříznivých podmínkách komplexy i s produkty onkogenů myc prb snižuje jejich hladinu v buňce nepřítomnost funkčního prb uvolnění kontrolních bodů buněčného cyklu snadný přechod do S-fáze

45 NF1, NF2 NF1 neurofibromatóza typu 1 NF2 kóduje protein neurofibromin negativní regulátor p21 ras defekty mnohočetné benigní neurofibromy kůže, kožní hyperpigmentace, abnormality skeletu, feochromocytom (nádor dřeně nadledvin) aj. produkt merlin tvoří komplexy s aktinem a CD44 zárodečná mutace autozomálně dominantní dědičnost defekty oboustranný neurinom akustiku somatické mutace defekty gliomy, meningiomy aj.

46 APC zděděná mutace APC familiární adenomatózní polypóza (FAP) tračníku vznik mnohočetných polypózních adenomů s vysokým potenciálem malignizace defekty kolorektální karcinom, karcinom pankreatu, desmoidy, hepatoblastom funkční protein degradací ß-kateninu reguluje diferenciaci a množení buněk mutace vedou ke vzniku stop kodonů či posunům čtecího rámce dominantní chování k projevům dochází i při mutaci jedné alely! ( = haploinsuficience heterozygotní stav, kdy normální alela nestačí plnit přirozenou inhibiční funkci)

47 WT1, PTEN WT1 Wilmsův nádor ledvin produkt působí jako tkáňově specifický regulátor transkripce genů řídících dělení buněk defekty uplatňuje se během embryonálního vývoje močového ústrojí PTEN (Phosphatase and TENsin homologue) kooperace se signálními drahami p53 a prb defekty četné nádory v pokročilých stádiích vývoje (glioblastomy, melanoblastomy, ca prsu, prostaty, ovarií aj.)

48 BRCA1 a BRCA 2 funkční produkty se podílejí na opravách zlomů v DNA a regulaci transkripce mutace: poruchy oprav DNA zvýšená genetická nestabilita nádorová transformace defekty BRCA 1 (Breast carcinoma 1) zděděná mutace jedné alely predispozice a familiární výskyt karcinomu mléčné žlázy, ovaria a pravděpodobně prostaty a tlustého střeva defekty BRCA 2 (Breast carcinoma 2) navíc predispozice ke ca pankreatu a hrtanu

49 p16 INK4 inhibitor Cdk 4 a 6 blok BC v nádorech často gen deletován nebo hypermetylován promotor defekty: maligní melanom - rodinný výskyt ca jícnu, pankreatu, žaludku nemalobuněčné ca plic glioblastom, sarkom aj.

50 Význam onkogenů a nádorových supresorů v histopatologii Detekce produktů onkogenů, supresorových genů, antimetastatických genů poznatky o dráhách vedoucí ke vzniku nádorů prognóza onemocnění nejvhodnější způsob terapie případná cílená genová terapie (př. antisence)

51 Laboratoř molekulární patologie LF UP