Kmenové buòky a vznik nádorového onemocnìní Tumorigeneze jako onemocnìní kmenových bunìk (3. èást)

Transkript

1 Prof. MUDr. Jaroslav Masopust, DrSc. Univerzita Karlova v Praze, 2. lékaøská fakulta, Ústav klinické biochemie a patobiochemie Kmenové buòky a vznik nádorového onemocnìní Tumorigeneze jako onemocnìní kmenových bunìk (3. èást) 3. Význam kmenových bunìk pro cílenou optimální onkoterapii (možnost úplného vyléèení) Hypotéza o nádorových kmenových buòkách poskytuje novou možnost cílené a opravdu úèinné terapie nádorových onemocnìní, která by nejprve znièila pokud možno všechny proliferující tumorové buòky a po té navodila diferenciaci a znièila nádorové kmenové buòky, které jsou refrakterní vùèi chemoterapii, pokud zùstávají v klidovém ( spícím ) stádiu. Nové možnosti protinádorové terapie jsou založeny na (a) navození diferenciace nádorových kmenových bunìk, (b) eliminaci nádorových kmenových bunìk navozením specifické imunologické reaktivity, (c) dále na blokádì nádorové signalizace nebo (d) na ovlivnìní ložiska (útulku) nádorových kmenových bunìk. Ideální by bylo odhalit tumor-iniciující buòky v samém zaèátku vývoje (kupø. ještì v nádorovém útulku ) a pøimìt je k apoptóze, event. zablokovat jejich další progresi. Možná že toto dìlá prùbìžnì tzv. protinádorový imunologický dohled, jak pøedpokládá Burnetova a Thompsonova hypotéza. Protinádorové vakcíny nebo imunomodulátory se zatím pøíliš neosvìdèily. Výjimkou je preventivní oèkování proti infekci lidským papilomavirem, který je nejèastìjším pùvodcem karcinomu dìložního èípku. Diskutovaná je otázka zvýšení imunogenicity nádorových bunìk, a tím navození úèinné protinádorové odpovìdi (vrozené nebo získané). Je známo, že cytotoxický úèinek anthracyklinù a γ-radiace zpùsobí, že dendritické buòky zaènou reagovat na poškozené nádorové buòky, a dochází tak ke stimulaci protinádorové odpovìdi. Tato odpovìï je provázena translokací calreticulinu (CRT) z nitra buòky (endo-crt) na povrch membrány (ekto-crt). Deplece CRT snižuje tuto imunogenicitu, naopak exogenní aplikace CRT ji navozuje (Obeid M, 2007). (Obr. 12, 13) Diferenciaèní terapie Tato terapie je založena na faktu, že nádorové kmenové buòky ztrácejí svoji rezistenci proti konvenèní protinádorové terapii, jsou-li podníceny k diferenciaci. Pokusy s all-trans-retinovou kyselinou a jejími deriváty pøi léèení akutní promyelocytové leukémie naznaèují, že tento zpùsob je nadìjný (viz Sell S, 2004; Schugar RC, 2007). Obr. 12: Prùbìh konvenèní protinádorové terapie Na konvenèní protinádorovou terapii reagují pouze tranzientnì amplifikující buòky, aberantnì diferenciující a nenádorové buòky. Velikost nádoru (kupø. poèet leukemoidních bunìk) se takto mùže výraznì snížit, ale nádorové onemocnìní není vyléèeno. Rezistentní nádorové kmenové buòky navodí, døíve nebo pozdìji, rekurenci choroby. 4 Labor Aktuell 03/08

2 Obr. 13: Srovnání konvenèní chemoterapie a cílené protinádorové terapie namíøené na tumorové progenitory Ovlivnìní nádorové signalizace Pøíkladem mùže být potlaèení rùstu meduloblastomu aplikací inhibitoru γ-sekretázy, GSI-18, který blokuje Notch-signalizaci. Signalizace zaèíná vazbou ligandu na specifický receptor s následnou proteolýzou jeho intramembranózní èásti pùsobením metaloproteinázy ADAM (A disintegrin - metalloprotein) a γ-sekretázovým komplexem. To umožní translokaci NOTCH do jádra, kde pùsobí na èleny komplexu CBF1-RBP-JR-supressor of hairless-lag-1(csl) DNA-binding protein family, což ovlivní expresi genù regulujících diferenciaci, samoobnovu, proliferaci a apoptózu bunìk. Dojde tak k pøerušení cyklu bunìèného dìlení, k apoptóze a diferenciaci bunìk meduloblastomové linie (Xing Fan, 2006). Konstituènì aktivovaný NOTCH-1 receptor se nalézá u 50 % T-ALL (Palomero T, 2007). Notch signalizace je mnohonásobnì vyšší v buòkách podobných kmenovým (jde o buòky CD133-pozitivní) než u jiných mozkových bunìk. Notch-blokáda nièí buòky podobné kmenovým, ale mnohem ménì atakuje buòky více diferencované. Anti-Notch terapie též zabránila rùstu nádorových bunìk u akutní lymfoblastické leukémie in vitro (Weng AP, 2004). Slibné terapeutické pokusy komplikuje rezistence vùèi anti-notch preparátùm, mutace (ztráta aktivity) protein-fosfatázy PTEN (Palomero T, 2007). Jinou možností u akutní T-lymfoblastické leukémie s onkogenní mutací NOTCH-genu, pøi níž dochází k trvalé aktivaci NF-κB dráhy prostøednictvím komplexu IκB-kinázy, je indukce zvýšené exprese této dráhy v kostní døeni u HSCs a jejich progenitorù. Inhibice této dráhy u HSCs je slibnou terapeutickou možností (Vilimas T, 2006). Také agens pùsobící na Hedgehog signalizaci mají anti-neoplastický úèinek. Patøí sem Hedgehog inhibitor - cyklopamin, zpùsobující výraznou regresi tumorového xenograftu v experimentu na myších. Jiný inhibitor - HhAntag, který je úèinnìjší než cyklopamin, blokuje tvorbu meduloblastomu u transgenních myší (Romer JT, 2004). Využití PAX proteinù jako možného anti-tumorového terapeutického cíle navrhují Lang a spolupracovníci (Lang D, 2006). Tyto proteiny pùsobí jako transkripèní faktory, které ovlivòují expresi genù regulujících proliferaci, samoobnovu, rezistenci vùèi apoptóze a migraci embryonálních prekurzorových bunìk a koordinují specifický diferenciaèní program. PAX proteiny byly též ve specifické populaci kmenových a progenitorových bunìk rùzných nádorù. Jinou možností je použití multikinázového inhibitoru jako je sorafenib tosylát (Nexavar ), který se váže na receptor serin/threonin- i tyrosinproteinkináz a snižuje tak nádorový rùst a angiogenezi neresekovatelného hepatocelulárního karcinomu. Preklinické studie ukázaly, že lék ovlivòuje aktivitu RAF-kinázy, aktivitu receptorù 2 a 3 pro rùstový faktor cévního endotelu (VEGFR 2 a 3), receptoru pro rùstový faktor odvozený od destièek (PDGFR) a KIT a FMS- related kinázu 3 (viz Waknine Y, 2007). Ovlivnìní mikroprostøedí Je známo, že normální hematopoéza je udržována interakcí mezi hematopoetickými buòkami a mikroprostøedím kostní døenì (stroma, osteoblasty, endotelium) (Konopleva M, 2007). Urèité vlivy tohoto mikroprostøedí mohou navodit zmìny ve fenotypu subpopulace nádorových leukemických bunìk, které se stávají rezistentní vùèi konvenèní protinádorové chemoterapii. Je proto snaha vyvinout prostøedky, které tuto interakci mezi stromatem a leukemoidními buòkami naruší. Obr. 14: Aktivace reziduálních nádorových kmenových bunìk myeloidní leukémie a možnost zrušení jejich rezistence vùèi imatinibu aplikací G-CSF Labor Aktuell 03/08 5

3 Obr. 16: Ubikvitin-proteasomový systém - schéma mechanismu Obr. 15: Kombinace konvenèní chemoterapie a biologická terapie zamìøená na tumor-iniciující buòky Eliminace nádorových kmenových bunìk nebo jejich progenitorù Navození apoptózy (event. nekrózy) nádorových kmenových bunìk in vivo, aniž by byl vážnì poškozen hostitelský organismus, je velmi obtížné pro výraznou, jim vlastní odolnost. U jejich bezprostøedních progenitorù to však už možné je. Pøíkladem mùže být cílená terapie eliminující blasty (Hutchinson E, 2007). Chronická myeloidní leukémie (CCL) a akutní lymfoblastická leukémie s pozitivním Philadelphia chromozomem (Ph1ALL) je udržována a podnìcována nepøimìøenou kinázovou aktivitou BCR-ABL onkoproteinu. Vìtšina tìchto pacientù v blastové krizi neodpovídá nebo je rezistentní na léèbu ABL inhibitory jako je imatinib (inhibuje tyrosin-proteinkinázy) ale též na dasatinib (inhibuje SRC-kinázu, což je threonin/serin-proteinkináza, která není atakovaná imatinibem) (Yiguo Hu, 2006). Aktivace nádorových kmenových bunìk tìchto hemoblastóz aplikací faktoru stimulující rùst kolonií granulocytù (G-CSF), pomáhá odstranit jejich rezistenci vùèi ABL inhibitorùm (Obr. 14). Nadìjná je i reaktivace tumor-supresorové proteinfosfatázy 2 (PP2A) aplikací preparátu FTY720, kterou je možno navodit apoptózu blastù; inhibuje se tak fosforylace, a tím aktivita faktorù signální dráhy Akt, STAT 5 a ERK1 a 2. Preparát FTY720, který je používán jako imunomodulátor pøi léèení mnohoèetné sklerózy nebo pøi transplantaci ledvin, se ukazuje být vhodný pro léèbu pacientù s výše uvedenou formou leukémií. Také kombinace konvenèní chemoterapie s inhibicí proliferaèního úèinku interleukinu 4 (IL-4) blokádou jeho receptoru specifickou protilátkou mùže redukovat i poèet tumor-iniciujících bunìk (Obr. 15). Protinádorová imunita Obr. 16: Ubikvitin-proteasomový systém - schéma mechanismu Nádorové buòky mohou i nemusí vyvolat imunitní odpovìï již v èasném stádiu onkogeneze (Kroemer G, 2007). I když existuje øada rùzných názorù, jak imunologický dohled pùsobí na rozvoj nádorového onemocnìní, je zøejmé, že alespoò za urèitých okolností mùže nádor (jeho produkty) navodit odpovìï imunitního systému. Mùže to však být nejen indukce cytotoxického mechanismu, ale též navození 6 Labor Aktuell 03/08

4 imunotolerance vùèi nádorovým buòkám (Stagg J, 2007; Willimsky G, 2007; Wan YY, 2007; Cronin SJF, 2007). Také zánik nádorových bunìk, spontánní nebo navozený chemoterapií, mùže být imunogenní, a to v závislosti na použitém agens. Anti-tumorová imunitní odpovìï mùže být realizována øadou imunologických efektorù, pøedevším dendritickými buòkami, T-, NK- nebo NTK-buòkami, které mohou teoreticky sloužit jako cílový prostøedek imunofarmakologické protinádorové terapie (stimulace protinádorové imunitní odpovìdi). Metody imunoterapie se snaží mobilizovat pacientùv imunitní systém tak, aby mu pomohl likvidovat nádorové buòky (Palucka K, 2007). Tento pøístup mùže být jednak pasivní, tj. aplikace imunitních efektorových bunìk (T-lymfocytù) nebo proteinù (protilátek), jednak aktivní (protinádorové vakcíny). Pasivní protinádorová imunoterapie však nedokáže navodit produkci pamì ových T-bunìk s dlouhou životností, které by dokázaly trvale kontrolovat rozvoj nádoru. Naproti tomu aktivní imunoterapie pomocí vakcinace založené na dendritických buòkách (DC) mùže navodit tvorbu tumor-specifického efektoru i pamì ových T-bunìk. Existují už první laboratorní pokusy. Další experimenty na bázi DC-vakcín se snaží vyprodukovat velké množství efektorových CD8 + -T-bunìk s vysokou aviditou, které by pøešly na formu regulujících T-bunìk. Tato terapie by mohla být doplnìna nastolením supresivního úèinku okolní tkánì tumoru. V bunìèné imunologické reaktivitì (cell-mediated) vùèi nádorovým buòkám hrají velmi dùležitou úlohu cytokiny produkované Th1 (T-helper typ 1) jako je interferon-γ (INF-γ). V modelových experimentech na myších (Berner V, 2007) byla prokázána synergická antitumorová odpovìï pøi kombinaci stimulace CD40 s interleukinem-2 (IL-2) v modelech s pokroèilými metastázami. Další pokusy však prokázaly, že tato imunoterapie vede sice z poèátku ke zvýšení poètu CD4 + T-bunìk, ale sníží poèet CD8 + T-bunìk (=cytotoxických T-lymfocytù); INF-γ navodí totiž jejich apoptózu, a tím pozdìji výraznì oslabí protinádorový úèinek. Tyto výsledky ukazují na složitost úèinku nádorové imunoterapie. Jiným pøíkladem je mechanismus chemoterapie aplikací anthracyklinu nebo po ozáøení γ-paprsky. Dochází pøitom ne- Tab. 2: Specifické inhibitory tumorigeneze z nádorových progenitorových bunìk jen k apoptóze nádorových bunìk, ale také k indukci anti-tumorové odpovìdi dendritickými buòkami. Ataka nádorových bunìk zpùsobí pre-apoptózovou translokaci intracelulárního calreticulinu (endo- CRT) na povrch plasmatické membrány (ekto-crt), což je klíèová reakce umožòující rozpoznání a fagocytózu umírajících nádorových bunìk dendritickými buòkami. Jiná pro-apoptózová agens jako mitomycin C nebo etoposid tento imunogenní efekt postrádají (Obeid M, 2007; Chaput N, 2007; Panaretakis Th, 2007; Kroemer G, 2007). Následující tabulka (Tab. 2) uvádí pøehled specifických inhibitorù rùstových faktorù, složek signalizaèní kaskády, pøežití nebo lékové rezistence u nádorových progenitorových bunìk nebo u nádorové angiogeneze (dle Mimeault M, 2007). Vìtšinou jde o aktivitu prokázanou in vitro. Ubikvitin-proteasomový systém je velmi dùležitá extralysosomální degradace (nepotøebných) proteinù v eukaryontních buòkách tím, že odstraòuje klíèové proteiny dùležité pro regulaci základních bunìèných procesù jako je vývoj plodu, diferenciace, cyklus bunìèného dìlení, apoptóza, genová transkripce, sig- Labor Aktuell 03/08 7

5 nální transdukce, stárnutí, zánìtlivá nebo stresová odpovìï. Pøirozené nebo v poslední dobì i syntetické inhibitory mohou být využity k navození apoptózy nebo zástavy bunìèného cyklu dìlení u neoplastických bunìk (Naujokat C, 2007). (Obr. 16) Mikro-RNA (µrna) MikroRNA geny, na rozdíl od jiných genù, které ovlivòují tumorigenezi, nekódují proteiny. Produkty tìchto genù jsou tvoøeny jednovláknovou krátkou RNA sestávající z 21 až 23 nukleotidù. Jejich úlohou je regulace genové exprese. Molekula µrna se mùže napojit na úsek mrna, který obsahuje komplementární nukleotidovou sekvenci. To má za následek degradaci dotèené mrna, a tím zamezení translace genetické informace a vznik proteinu se specifickým biologickým úèinkem (viz Croce CM, 2008). Jde o evoluènì starý mechanismus, kterým se organismus brání vùèi virogenùm a pravdìpodobnì i vùèi nežádoucímu úèinku nìkterých onkogenù. Pøíkladem mùže být µr-15a a µr-16-1, které jsou už v zaèátku rozvoje nádorové choroby odstranìny (nebo výraznì sníženy) u tzv. neškodných pøípadù chronických lymfoblastických leukémií. Mapování rùzných µrna-genù prokázalo, že se vyskytují hojnì v oblastech chromozomù, kde došlo k pøesmyku (rearrangement), deleci nebo amplifikaci v nádorových buòkách. Profilizace exprese µrna- genù mùže pøispìt ke klasifikaci, diagnóze, staging, prognóze i k odhadu odpovìdi na terapii nádorových onemocnìní. (Obr. 17) 4. Závìr Výzkum hematoonkologických onemocnìní v posledních letech, pøedevším leukémií, pøedložil nové dùkazy o existenci nádorových kmenových bunìk (jejich progenitorù) a o jejich významu pro vznik, rozvoj a léèení nádorových onemocnìní. Stále však je více otázek než správných odpovìdí. Podle odborné literatury není stále ještì jasno, který typ bunìk je odpovìdný za vznik nádoru. Dosavadní práce pøinášejí dùkazy, že to jsou tkáòové kmenové buòky, buòky progenitorové i buòky somatické, které podlehly genetickým a epigenetickým alteracím. Není dosud zøejmé, který z tìchto typù je tím pravým cílem maligní transformace; podle nìkterých jím mùže být každý z nich, i když s rozdílnou úèinností. Zøejmì kmenové buòky, které mají dlouhou životnost, jsou déle vystaveny akumulaci postupných genetických i epigenetických tumorigenních alterací. Další otázkou je, zda buòky, v kterých maligní transformace zaèíná (tumor-iniciující), jsou tytéž, kterými se nádor rozvíjí (tumor-propagující). Jak vysvìtlíme morfologickou i funkèní heterogenitu bunìk, které rozvinutý nádor tvoøí? Další faktor, který mùže významnì ovlivnit další osud tumor-iniciujících bunìk, je mikroprostøedí, v kterém jsou umístìny, a také stav celého organismu, vèetnì imunologického protinádorového systému. (Podrobná literatura u autora: jaromasopust@seznam.cz) Obr. 17: Mechanismus protinádorového úèinku mikrorna (µrna) 8 Labor Aktuell 03/08