Analýza lidského genomu v diagnostice koncepty a jak číst zprávu o genetickém vyšetření Lenka Dvořáková

Transkript

1 Analýza lidského genomu v diagnostice koncepty a jak číst zprávu o genetickém vyšetření Lenka Dvořáková Máme-li mluvit o tom, jaké možnosti přináší znalost lidského genomu medicíně, měli bychom si v první řadě ujasnit, co tento pojem znamená. V obecné rovině je genom souhrn všech odlišných molekul DNA přítomných v organele, buňce nebo organismu. Z tohoto pohledu zahrnuje lidská buňka genomy dva jaderný a mitochondriální. Každá buňka obsahuje řádově stovky až tisíce mitochondrií, každá organela nese jednu kopii mitochondriálního genomu - kruhové DNA o velikosti 16,6 kb. Jaderný genom je oproti mitochondriálnímu nesrovnatelně větší, 3,2 x 10 9 bp je rozděleno do 22 autosomů a dvou pohlavních chromosomů, X a Y. Struktura jaderného genomu Asi 20-25% jaderného genomu zaujímají geny (průměrně se počítá bp/gen, ale mezi geny je obrovská diverzita). Zbytek tvoří tzv. pouště, které jsou převážně osídleny potomky dávných retrovirů, které v naprosté většině ztratily schopnost retrotranspozice (tj. přemístění své identické kopie na nová místa v genomu). O funkci pouští dnes panuje řada protichůdných názorů, z nichž některé uvádějí, že se jedná o zcela zbytečnou část genomu (odpad junk), jiné říkají, že v pouštích se nachází řada řídících a regulačních oblastí. Při pojmu gen si obvykle v souladu s centrálním dogmatem molekulární biologie vybavíme gen strukturní takový, který kóduje polypeptidový řetězec. Strukturních genů máme podle současných odhadů tisíc. Kromě těchto genů se však v genomu vyskytuje i zhruba genů, které nejsou překládané, ale jsou přepisované do RNA (R A geny). K nim patří RNA podílející se na proteosyntéze (ribosomální a transferové RNA), malé nukleární RNA (snrna), které jsou součástí sestřihového aparátu, XIST a TSIX účastnící se procesu X- inaktivace a nyní intenzivně studované mikro RNA (jednořetězcové RNA o délce nukleotidů), účastnící se regulace genové exprese. Struktura genu Gen obvykle sestává z exonů oddělených introny, které jsou při posttranskripčních úpravách RNA odstraňovány (proces sestřihu splicing) a v maturované RNA nejsou přítomny.

2 Z oblasti, kterou zaujímá gen, jen malá část kóduje polypeptidové řetězce. Introny, které jsou před translací RNA do proteinu vystřiženy, jsou v průměru 50x delší než kódující úseky exony. Ke každému genu náleží regulační oblasti, které řídí jeho transkripci - oblasti promotoru. Transkripci genu zesilují a zeslabují i další oblasti - enhancery a scilencery. Lidský genom v diagnostice Teď, když jsme si udělali alespoň hrubou představu o tom, jak lidský genom vypadá, je na místě otázka, jakým způsobem lze tyto znalosti využít pro diagnostické účely. Z hlediska velikosti oblasti, která je za vývoj onemocnění zodpovědná, rozlišujeme aberace genové a chromosomální. Chromosomální abnormality jsou velké změny týkající se celých chromosomů nebo jejich částí a mohou být početní (monosomie, trisomie, triploidie,...) nebo strukturní (např. translokace, inserce, duplikace, delece, inverze). Jestliže manifestace onemocnění souvisí s oblastí/oblastmi zasahujícími jeden nebo více genů, mluvíme o nemocech monogenních nebo o onemocněních s komplexním typem dědičnosti. Onemocnění s komplexním typem dědičnosti jsou charakterizovány souborem interakcí mezi predispozičními faktory zahrnujícími zpravidla několik genů a vliv prostředí. Vznik a průběh nemoci pak závisí na malých změnách v těchto predispozičních faktorech, kdy ani jedna změna sama o sobě není kauzativní, ale určitá kombinace těchto změn vede k manifestaci fenotypu. Vyšetření těchto vlivů se zatím pohybuje spíše v oblasti výzkumu. Jako monogenní si dnes nepředstavujeme nemoc, kterou lze vysvětlit poruchou funkce jediného genu, ale jako nemoc, kde jeden gen má na vznik a vývoj onemocnění určující vliv. Fenotyp konkrétního pacienta (to, jak se u něj nemoc reálně manifestuje), je ovlivněno i genovým pozadím (gen nepůsobí sám, ale jako součást celého genomu) a vlivem prostředí. Vyšetření chromosomálních a genových abnormalit je založeno na odlišných metodikách. Cytogenetické vyšetření využívá mikroskopické techniky. Připomeňme si, že klasickým G pruhováním (barvením Giemsovým roztokem) zachytí cvičené oko změnu o velikosti cca 2 3 milionů nukleotidů, použití fluorescenčních sond (FISH) je až o dva řády citlivější. Jak si ukážeme za chvíli, patogenní změny na úrovni jednotlivých genů se nejčastěji odehrávají v rozsahu jednotek až desítek nukleotidů. Analýza takových změn je možná na základě

3 molekulárně genetického vyšetření. Co se týče mitochondriálního genomu, spadá pro svou velikost do oblasti metod molekulárně genetických. V dalším textu se budeme zabývat zejména analýzou jaderných strukturních genů, které jsou svázány s monogenními onemocněními. Důvodem je, že tyto geny jsou dostatečně prozkoumány a lze je použít pro diagnostické účely. To zatím neplatí o jaderných RNA genech zatím nelze říci, že určitá změna ve struktuře RNA genu vede k vývoji nemoci. Hlavní typy mutací Chceme-li zjistit aktuální stav, jaké mutace byly v lidském genomu doposud nalezeny, je dobré navštívit internetovou stránku Human Gene Mutation Database (HGMD, která si dala za cíl sbírat a třídit publikované genové změny, které jsou zodpovědné za lidská dědičná onemocnění. Ze statistiky HGMD jasně vyplývá, že naprostá většina změn se odehrává na úrovni maximálně několika nukleotidů. Mezi nejčastější patologické změny ve struktuře genu patří nukleotidové záměny, jejichž důsledkem vznikají missense, nonsense nebo sestřihové mutace. Missense mutace je záměna jednoho aminokyselinového zbytku za druhý, nonsense mutace znamená vznik stop kodonu a předčasné ukončení translace, sestřihová mutace způsobuje zánik starého nebo vznik nového sestřihového místa, inserce (včlenění) nebo delece (odstranění) jednoho nebo více nukleotidů vede buď k inserci nebo deleci jednoho nebo více aminokyselinových zbytků, nebo k posunu ve čtecím rámci (frame shift) a k předčasnému stop kodonu. Velké delece, inserce nebo velké přestavby zdaleka nejsou tak časté jako mutace malého rozsahu. Společným znakem výše jmenovaných mutací je, že jsou stabilní, to znamená, že členové rodiny sdílejí identickou mutaci, která se v průběhu generací nemění. Existují však i nestabilní dynamické mutace, typické pro geny obsahující segment tří opakujících se nukleotidů, např....cag CAG CAG... (triplet repeat). Počet opakujících se jednotek narůstá (podléhá expanzi) při přenosu genu z generace na generaci. Mezi onemocnění způsobené dynamickými mutacemi patří Huntingtonova chorea, fragilní syndrom X nebo Friedrichova ataxie. Postup při vyšetření genu Pro efektivní vyšetření genu je důležité se co nejpodrobněji seznámit s jeho strukturou, zjistit sekvenci normálního (nemutovaného) genu, velikost exonů a intronů, podívat se, co je známo o běžných polymorfismech, zda se v genu vyskytují prevalentní mutace či zda má většina

4 pacientů své privátní mutace. Odpovědi na tyto otázky hledáme na internetových stránkách. Pro naše potřeby je základní stránka CBI (National Center for Biotechnology Information, která má řadu odkazů, z nichž uvedeme jen tři: PubMed, OMIM a databázi sekvencí známých genů. PubMed je databáze citací včetně abstraktů, které vyšly v časopisech zaměřených na lékařský a biologický výzkum. OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) je katalog lidských genů a genetických onemocnění. Referenční sekvence všech známých genů včetně jejich transkripce a translace je uvedena v databázi, kterou najdeme na domovské stránce NCBI pomocí rozbalovacího menu Search Gene. Poté co se seznámíme teoreticky s genem, který máme studovat, můžeme přistoupit k návrhu metod, které pro analýzu genu použijeme. Strategie analýzy mutací není předmětem zájmu této kapitoly a nebudeme proto zabíhat do technických detailů. Dotkneme se zde jen určitých obecných aspektů, které jsou důležité pro interpretaci výsledků a tedy pro správně vedenou genetickou poradu. Nejčastěji používaným materiálem pro isolaci D A (R A) jsou leukocyty isolované z periferní krve. Alternativou je kultura kožních fibroblastů, bioptický nebo nekroptický materiál. Pro prenatální diagnostiku se nejčastěji používá biopsie choriových klků, případně amniocyty. RNA používaná pro přípravu cdna je mnohem citlivější k degradaci. U některých genů je RNA přítomna pouze v některých orgánech (např. v játrech) a z běžně používaného materiálu ji isolovat nelze. Metoda, která dnes tvoří odrazový můstek ke všem dalším molekulárně genetickým analýzám, je PCR, polymerázová řetězová reakce, která umožňuje in vitro namnožení určitého konkrétního úseku DNA do milionů kopií. Délka PCR produktu je obvykle bp, za zvláštních podmínek lze amplifikovat i desítky tisíc nukleotidů. Je zřejmé, že výběr metody bude záviset na typu mutací, které očekáváme. Budeme li studovat gen zodpovědný za Duchennovu muskulární dystrofii, zvolíme metodiku vhodnou pro detekci velkých delecí. Pokud budeme vyšetřovat gen, ve kterém předpokládáme mutaci malého rozsahu (podle stránek HGMD je to víc než 90% veškerých publikovaných mutací), zvolíme některou z metod skríningových, skenovacích nebo přímou sekvenační analýzu. Metodám, které vyšetřují pouze předem určené mutace, říkáme metody skríningové. Nejčastěji používanými metodami tohoto typu jsou restrikční analýza nebo alelově specifické PCR. Skríningové metody jsou vhodné pro geny, ve kterých se vyskytují prevalentní mutace. Takovým genem je např. HADHA asociovaný s poruchou β-oxidace dlouhých mastných

5 kyselin (deficit LCHAD); 87% alel pacientů s deficitem LCHAD nese prevalentní mutaci c.1528g>c (p.glu510gln). Pokud v genu převažují mutace privátní, lze použít některou ze skenovacích metod. Všechny tyto metody sledují rozdílné fyzikální vlastnosti fragmentu obsahujícího normální sekvenci, sekvenci mutovanou a heteroduplex (fragment s jedním normálním a jedním mutovaným vláknem). Sledovanou vlastností je např. mobilita fragmentů v gelu (metody SSCP, TGGE), na koloně vysokotlaké kapalinové chromatografie (dhplc) nebo teplota tání - teplota, při níž se oba řetězce DNA od sebe oddělí (Hi Res Melting system). Výsledkem skenovací metody není identifikace mutace, ale určení fragmetu, ve kterém se tato mutace nachází. Mutace je v těchto vytipovaných fragmentech specifikována sekvenováním. Nevýhodou těchto metod je, že vyžadují pečlivou optimalizaci postupu pro každý fragment a jejich citlivost není vždy dostatečná. To znamená, že některé fragmenty nesoucí mutaci může pominout. Výhodou těchto metod je jejich rychlost a nízká cena. Obecně se proto skenovací metody používají v případě, že gen je vyšetřován u velké skupiny pacientů. V případě analýzy genu u malé skupiny pacientů je vhodné přistoupit k přímé detekci mutace k sekvenování všech důležitých oblastí genu. Postupujeme tak, že vybrané oblasti genu jsou amplifikovány metodou PCR a potom sekvenovány modifikovanou Sangerovou metodou s použitím dideoxynukleotidů (cycle sequencing). Které oblasti vyšetřujeme Sekvenace genu dnes není problémem technického provedení, ale interpretace. V první řadě není vůbec jednoduché určit, které oblasti jsou ty důležité. Závisí samozřejmě na konkrétním genu, ale v podstatě se pro účely diagnostiky vytvořil konsensus, že vyšetřujeme exony a k nim přiléhající částí intronů, v nichž se mohou nacházet sestřihové mutace. To znamená, že dnes jsme schopni vyšetřit a interpretovat méně než 1% celého lidského genomu. Pokud je ve vzorku vyšetřované tkáně přítomen i transkript genu našeho zájmu (příslušná mrna), je dobré vyšetřit jak sekvenci DNA tak sekvenci transkriptu (cdna). Vyšetření DNA i odpovídající mrna může v některých případech usnadnit nebo upřesnit interpretaci nalezené mutace, jak si ukážeme později. Které oblasti nevyšetřujeme, i když mohou mít pro výsledný fenotyp význam Tím, že kromě krátkých intronových úseků sekvenujeme jen kódující oblast genu, vynecháváme celé dlouhé sekvence intronů, promotorovou oblast a další regulační oblasti genu. Tyto oblasti jsou důležité pro správný sestřih a pro regulaci exprese genu, nicméně, při

6 dnešní úrovni poznání neumíme případné změny nalezené v těchto oblastech interpretovat. Řada regulačních oblastí dnes ani není známá, promotory jsou často definovány jen velmi nepřesně. Analýza těchto oblastí je jedním z intenzivně sledovaných směrů genetického výzkumu. Příkladem je studium rozdílné methylace určitých míst promotorové oblasti u pacientů a zdravých kontrol. Stupeň methylace je důležitým faktorem regulace genové exprese. Dalším příkladem je 3 nepřekládaná oblast, která je potenciálním místem pro nasedání mikrorna, molekul zapojených do regulace genové exprese. Mutace v místě důležitém pro vazbu mikrorna by mohly vysvětlit některé fenotypové projevy. Použít tyto výsledky pro diagnostické účely by však bylo více než předčasné. Interpretace mutace Interpretací myslíme odhad, zda změna ve struktuře genu, kterou jsme u pacienta našli, může být příčinou jeho nemoci (patogenita, kauzativnost mutace). Zda je mutace kauzativní, odvozujeme z jejího vlivu na proteinovou strukturu. Proteinovou strukturu v naprosté většině případů neověřujeme, odvozujeme ji ze sekvence transkriptu, kterou jsme buď zjistili analýzou cdna nebo predikovali na základě analýzy genomové DNA. Potom předpokládáme, že inserce nebo delece jednoho nebo více nukleotidů vede buď k včlenění nebo odstranění jednoho nebo více aminokyselinových zbytků, nebo k posunu ve čtecím rámci (frame shift) a k předčasnému stop kodonu. Dále předpokládáme, že substituce nukleotidu povede k záměně aminokyselinového zbytku (missense mutace), ke vzniku předčasného stop kodonu (nonsense mutace), nebo ke změně aminokyselinové struktury nevede (synonymní mutace). Realita však může být jiná: hlavním důsledkem inserce nebo delece je v některých případech vznik nestabilního transkriptu RNA je brzy po svém vzniku degradována a v analyzovaném vzorku se vůbec nevyskytuje (mechanismus nonsense mediated decay). Dále je důležité si uvědomit, že nukleotidová záměna může hrát roli i v sestřihovém mechanismu a může vést k nové sestřihové variantě. Místa důležitá pro sestřih lze předpovídat (predikovat) na základě počítačových programů, např. NNSPLICE ( Nicméně, jaká bude struktura transkriptu ve skutečnosti nelze jednoznačně určit bez jeho analýzy v laboratoři.

7 Následující příklad uvádí, jak se tatáž nukleotidová záměna v sekvenci DNA může projevit u dvou pacientů různě: Yogalingam a spol. uvádějí, že u dvou pacientů s mukopolysacharidosou typ I (MPSI) byla v genu IDUA nalezená nukleotidová záměna c.793g>c. Pokud by analýza skončila na úrovni genomové DNA, případ by byl uzavřen tak, že předpokládaný vliv na proteinovou sekvenci je aminokyselinová záměna glycinového za argininový zbytek. Analýza transkriptu u prvního pacienta ale ukázala, že 793. nukleotidová pozice je součástí sestřihového akceptorového místa. V exonu 7 je potom využíváno krypticé sestřihové místo, následkem čehož dochází k deleci 33 nukleotidů v exonu 7. Těchto 33 nukleotidů kóduje 11 aminokyselinových zbytků, které pak v proteinu chybí. U druhého pacienta nebyl transkript obsahující deleci 33 nukleotidů detekovatelný, pravděpodobně z důvodu nestability. Příčinou nestability může být další neidentifikovaná změna v intronu. Určité procento molekul transkriptu bylo sestřiženo správně a vedlo k missense mutaci (p.g265r - záměny glycinového za argininový zbytek na 265. aminokyselinové pozici). V silně převažujícím procentu případů najdeme mutaci, jejímž jediným důsledkem je záměna aminokyselinového zbytku. Predikční programy nebo analýza transkriptu neukáže, že by mutace vyvolávala poruchu sestřihu. Jak tento výsledek interpretovat? Nejlepší způsob ověření patogenity mutace je expresní studie in vitro. Tento přístup obnáší vložení mutované a kontrolní cdna do vhodného vektoru a exprese genu v hostitelských buňkách. Aktivita měřená v hostitelských buňkách nesoucích mutovaný gen by měla být výrazně nižší než v buňkách s kontrolní sekvencí genu. Expresní studie je velmi pracná a nelze ji rutinně používat pro ověření patogenity všech nalezených mutací. Navíc u některých genů nelze měřit biologické důsledky mutace a funkční studie se nedá použít vůbec. Alternativou jsou informace nalezené v literatuře, databáze a počítačové programy. Pokud existují informace o struktuře proteinu, lze zjistit, zda se mutace nachází v aktivním centru enzymu nebo jiné funkčně důležité oblasti enzymu. O funkční důležitosti oblasti nebo aminokyselinového zbytku napovídá konzervace oblasti v průběhu fylogenetického vývoje. Je-li ten samý aminokyselinový zbytek přítomen v proteinu z Drosofily, potkana, psa, kočky a člověka, lze předpokládat, že má pro funkci proteinu velký význam, protože záměna tohoto aminokyselinového zbytku za jiný neumožňuje přenos na potomstvo a nefixuje se v populaci. Dobrým argumentem pro patogenitu mutace je její segregace s fenotypem, to znamená, že pacienti mutaci nesou, zatímco v normální populaci se nevyskytuje. Byla li mutace popsána jako patogenní v literatuře, je velmi pravděpodobné, že taková mutace bude příčinou nemoci i

8 u našeho pacienta. Pokud jsme identifikovali mutaci, která doposud nebyla v literatuře popsána, lze její nepřítomnost v normální populaci ověřit vyšetřením velkého počtu (minimálně 300) kontrolních alel. Na druhé straně ani analýzou velkého množství vzorků nelze vyloučit, že náš nález není velmi vzácným polymorfismem, na druhou stranu můžeme ve vyšetřovaném souboru kontrol přijít na skryté heterozygoty a patogenní mutaci pak interpretovat jako polymorfismus. Na výše uvedená kriteria je pořeba nahlížet jen jako na určité vodítko, vždy zbývá určité procento nejistoty, zda nalezená variace je příčinou manifestace onemocnění. V jakém případě je molekulárně genetická analýza indikovaná? 1. Ověření diagnosy. Monogenní onemocnění bývají často enzymopatiemi. Pokud stanovení aktivity enzymu jednoznačně prokáže deficienci, je diagnosa stanovena a není nutné přistupovat k analýze mutací. Molekulárně genetické vyšetření je indikováno v případě, že biochemický/enzymologický test není jednoznačný, jeho provedení by bylo příliš komplikované nebo ho nelze provést vůbec (např. u membránových a transportních proteinů, proteinů s neznámou funkcí). 2. genetické poradenství v rodině. Mutace nalezené u probanda jsou pak analyzovány u příbuzných. U autosomálně recesivních onemocnění je dobré vyšetřit rodiče z hlediska genetického poradenství v dalším těhotenství. Pro stanovení diagnosy, případně kvůli preventivní péči je indikováno vyšetření sourozenců probanda. Největší význam má genetické poradenství v rodinách s gonosomálně recesivním onemocněním. Všechny ženy v rodině mají 50% riziko, že jejich syn bude postižen; biochemický test nemusí být vzhledem k posunu v X-inaktivaci jednoznačný. 3. prenatální diagnostika. Je indikována v rodinách, kde se narodilo dítě s autosomálně recesivním onemocněním a byl zjištěn genotyp rodičů. V rodinách s gonosomálně recesivním onemocněním je prenatální diagnostika nabízena všem potvrzeným přenašečkám. Jako příklad významu molekulárně genetického vyšetření v prenatální diagnostice uvádíme poruchu cyklu močoviny - deficit ornithinkarbamoyltransferasy (OTC). Enzym OTC je přítomen pouze v játrech. Pomineme-li fetální biopsii jater pro stanovení enzymu, je analýza mutací jedinou dostupnou metodou, jak prenatální diagnostiku provést. Gen OTC je vázán na X-chromosom, prenatální diagnostika je proto plně indikovaná u přenašeček, ale i u žen, kterým se narodil syn s prokázaným deficitem OTC, ale které v periferní krvi mutaci nenesou.

9 Důvodem je riziko tkáňového nebo gonadálního mozaicismu, kdy mutace je přítomna jen v určitém procentu buněk některých tkání. Bowling a spol. popsali klinicky zdravou ženu, která porodila dva syny s deficitem OTC. Mutace (záměna methioninového za argininový zbytek na 206. pozici) nebyla prokázána ani v leukocytech ani ve fibroblastech matky. Výsledek silně nasvědčuje gonadálnímu mozaicismu. Jak číst zprávu Pro lékaře jsou ze zprávy nejdůležitější identifikační údaje pacienta (jméno, RČ), gen, který byl vyšetřován a výsledek typu: Výsledky vyšetření ukazují, že pacient je složeným heterozygotem pro variace c G>C (p.r411p) a c.2861 C>T (p.s954l) v genu PC1. Genotyp probanda je: ( PC1: c. [1232 G>C] + [2861 C>T]). Vzorec znamená, že v genu PC1 byly nalezeny 2 nukleotidové záměny, substituce guanosinu za cytidin na pozici 1232 a substituce cytidinu za thymidin na pozici Hranaté závorky znamenají, že každá mutace se nachází na jiné alele (mutace jsou ve fázi trans). Nomenklatura mutací je uvedena na stránkách Human Genome Variation Society (HGVS; Přestože základní informace byly právě uvedeny, měl by lékař vědět, jak k takovému výsledku analytik došel. Proto si projdeme další body, které by zpráva měla obsahovat. Referenční sekvence: Podle toho, jak probíhá resekvenace lidského genomu, je sekvence DNA upřesňována a čas od času dochází k aktualizaci referenční sekvence. V záhlaví stránky sekvence konkrétního genu je uvedeno číslo verze a datum vydání. Pro přesnou interpretaci našich výsledků je proto důležité znát číslo verze a datum vydání sekvence, kterou používáme jako referenční. Materiál, který byl použit: nejkomplexnější výsledek dostaneme z kombinované analýzy genomové DNA a cdna. Pokud vyšetříme jen genomovou DNA, vystavujeme se riziku chybné interpretace výsledků. Pokud použijeme jen cdna, je možné, že mutaci nezachytíme v důsledku nestabilní mrna. (Viz odstavec Interpretace mutace). V rutinní diagnostice se vyšetření cdna obvykle neprovádí z hlediska finanční náročnosti, v některých případech ani nelze provést, protože cdna není dostupná (viz odstavec Postup při vyšetření genu, Materiál pro isolaci DNA, RNA). Metody: Na použité metodě závisí interpretace výsledků. Pokud použijeme skríningovou metodu, máme představu jen o konkrétní analyzované mutaci. Pokud pro výběr oblastí, které

10 budeme sekvenovat použijeme skenovací metodu, vystavujeme se nebezpečí, že některé oblasti, v nichž se variace nacházejí, pomineme vzhledem k nižší rozlišovací schopnosti skenovacích metod. Sekvenování je nejdražší, ale nejcitlivější metoda pro vyhledávání malých mutací. Ani jeden z uvedených typů metod nezachytí mutace velkého rozsahu (např. velké delece). Výsledky: v tomto odstavci je uvedeno, jaká mutace byla nalezena, v jaké oblasti se nachází, zda byl analyzován i transkript, jaký předpokládaný vliv má mutace na proteinovou strukturu. Dále by mělo být zřejmé, zda mutace už byla popsána v literatuře, či zda se jedná o mutaci novou. Interpretace: Zde by měly být uvedeny výsledky z hlediska citlivosti použité metody. Dále by měly být diskutovány údaje, na základě nichž usuzujeme, že nalezená mutace je patogenní (viz odstavec Interpretace mutace). Závěr Cílem této kapitoly bylo ukázat, že analýza mutací byť i v tom nejjednodušším případě, tj. u monogenních onemocnění, je komplikovanou záležitostí. Při analýze nezohledňujeme regulační oblasti genu, epigenetickou složku, smysluplně jsme schopni interpretovat změny v méně než 1% genetické informace, kterou člověk vlastní. Navíc ani variace nalezená v kódující oblasti nemusí mít jednoznačnou interpretaci. Proto, pokud je to možné, by diagnosa měla být postavena multidisciplinárním přístupu např. na metodách histologických, enzymologických a molekulárně genetických. Na druhou stranu, i přes dosavadní nejasnosti a úskalí je mutační analýza silný nástroj sloužící k ověření diagnosy, poskytuje možnost genetického poradenství a prenatální diagnostiky. Použitá a doporučená literatura: R. L. Nussbaum, R. R. McInnes, H. F. Willard: Thompson & Thompson Genetics in Medicine, Sixth Edition, W B Saunders Co, 2004 T. Strachan, A. Read: Human Molecular Genetics, 3rd Edition, Garland Science Publishing, 2004 L.Dvořáková: Rozluštění lidského genomu, Akademon ( Yogalingam G, Guo XH, Muller VJ, Brooks DA, Clements PR, Kakkis ED, Hopwood JJ. Identification and molecular characterization of alpha-l-iduronidase mutations present in mucopolysaccharidosis type I patients undergoing enzyme replacement therapy. Hum Mutat Sep;24(3): Bowling F, McGown I, McGill J, Cowley D, Tuchman M.: Maternal gonadal mosaicism causing ornithine transcarbamylase deficiency. Am J Med Genet Aug 27;85(5):452-4.