Určení rodičů (analýza paternity)

Transkript

1 Určení rodičů (analýza paternity)

2 Možné problémy Oba rodiči neznámi Jeden rodič (matka) znám, druhý neznám Chen caerulescens hnízdní parasitismus mimopárové paternity Jeden nebo dva rodiči? Samooplození u hermafroditů potomci mají jen alely matky deficit heterozygotů oproti HW Samooplození nebo mitotická partenogeneze (klonalita)? klony fixovaná heterozygotnost u potomků heterozygotů (není segregace) POZOR! Existuje i meiotická partenogeneze. Limacidae outcrossing Epiactis prolifera samooplození Rodič Aa, gamety A a samooplození potomci AA, Aa, aa klonalita potomci jen Aa Deroceras laeve klonalita (očekávalo se samooplození)

3 Techniky Dříve minisatelitový DNA fingerprinting alozymy, mtdna Dnes převážně mikrosatelity Další možnosti: AFLP, SNPs, proteinový fingerprinting

4 RFLP a AFLP Základem je naštípání DNA restrikčními enzymy milióny fragmentů různé délky Rozdíly díky: přítomnosti/absenci restrikčních míst tandemovým opakováním (mikrosatelity, minisatelity) delece a inzerce Zviditelnění jen určité části fragmentů AFLP selekce primery RFLP selekce hybridizací

5 Sir Alec Jeffreys DNA fingerprinting x Jeffreys et al naštípání DNA pomocí restrikčního enzymu Rozdělení fragmentů pomocí elektroforézy Hybridizace (jako sonda minisatelit) Dostatek kvalitní DNA Vše na jednom gelu Laboratorní náročnost

6 Otec 3 Otec 2 Otec 1 děti matka Určení otce DNA fingerprinting Procento sdílených otcovských proužků

7 Bucephala clangula Proteinový fingerprinting Hohol severní Andersson & Åhlund 2000 Proteiny z bílku vajec isoelectric focusing in immobilized ph gradients Problém: nevím jistě, která vejce jsou od hostitelské matky Vnitrodruhový hnízdní parazitismus (více něž polovina hnízd) Zanáší si zřejmě příbuzné samice

8 SNPs (dnes již stovky najednou) Illumina's GoldenGate Assay

9 Mikrosatelity Vyhledání primerů pro nové lokusy: dříve: náročné na čas i finance genomové knihovny, hybridizace se sondou, sekvenování pozitivních klonů Alternativa NGS možno i komerčně Stejné primery často fungují pro více příbuzných druhů (ale ne vždy, mutace v místě nasedání primerů)

10 Alely se liší délkou CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTC + CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT

11 Určení paternity Matka Otec Mládě 1 Mládě 2

12 Fragmentační analýza Je možné analyzovat několik lokusů najednou.

13 krmící samec LOX8 (CTTT) n (CCTT) n Samec 55 Samice 56 matka Mládě 57 mládě

14 Specializované programy Automatické dohledání rodičů

15 Vyvození důsledků

16 Kolik je třeba lokusů? Nutný počet není absolutní Dáno: počtem alel heterozygotností četností alel Nielsen et al různý počet alel, různý počet možných rodičů velikostí vzorku vazbou lokusů Ideální - hypervariabilní lokusy Obvykle však 6 a více, optimálně kolem 20ti nebo více Tedy nejdříve je nutná pilotní studie dospělců v populaci výpočet Exclusion probability, kontrola možné vazby lokusů

17 Exclusion probability Pravděpodobnost, že genotyp náhodně vybraného jedince nebude pasovat na potomka Tedy pravděpodobnost, že náhodně vybraného jedince vyloučíme jako rodiče Často se ale udává i non-exclusion probability (tedy 1 Exclusion probability) Závisí na počtu lokusů a alel Dobré jsou hodnoty okolo 0,01 a nižší (pro non-exclusion) Vypočítá například Cervus Jiné hodnoty pro prvního a druhého rodiče AB Možní rodičové Ab AA AB Ba Aa matka Aa potomek

18 Exclusion probability hrubý odhad Vhodnější simulace zahrneme i počty a procenta ovzorkovaných jedinců, chyby a jiné problémy (mutace, nulové alely)

19 Lokusy ve vazbě snížení variability porušen předpoklad nezávislosti vyřazení jednoho z lokusů Kontrola v běžně dostupných programech Např. GenePop

20 Technické a biologické obtíže Nulové alely (nikdy se neamplifikují) Allelic dropout (někdy se neamplifikují) False alleles Chyby při zjišťování alel (scoring errors) Lokus na pohlavním chromosomu Mutace Příbuznost potenciálních rodičů (extended family structure) Nejhorší je zařadit mezi potenciální rodiče sourozence potomků!

21 Nulové alely Alely, které nejsme schopni detekovat Mutace v místě nasedání primeru Falešní homozygoti Odhalení Neshoda matek s mláďaty Rozdíl mezi očekávanou a pozorovanou heterozygotností Podobný efekt má allelic dropout Interakce fragmentů při amplifikaci Velký rozdíl v délce alel kratší alely se lépe amplifikují nízká koncentrace nekvalitní DNA templátu

22 Heterozygotnost (= Podíl heterozygotních lokusů) Pozorovaná heterozygotnost - odečtu ze zjištěných genotypů Příklad: jedinec 1 Aa BB Cc Dd jedinec 2 AA BB CC Dd H O 0,5 0 0,5 1 0,50 Očekávaná heterozygotnost - vypočtu z HW rovnováhy Očekávané frekvence genotypů z HW rovnováhy p 2, 2pq a q 2 p = frekvence A = 0,75, q = frekvence a = 0,25 očekávaná heterozygotnost na prvním lokusu 2pq = (2 x 0,75 x 0,25) = 0,375

23 Rozdíl mezi očekávanou a pozorovanou heterozygotností Nadbytek homozygotů možný výskyt nulových alel Cervus, hodnoty frekvence nulových alel nad 0,05 stojí za úvahu: homozygoty beru jako potenciální heterozygoty Nadbytek může být ale i díky jiným příčinám: populační struktura, inbreeding, náhoda

24 Mutace Ibarguchi et al Obvykle se zanedbávají Mohou však být i poměrně časté (4.5 x x 10-6 na lokus) Navíc častější u samců (2 až 6x) Vyloučení na základě jednoho lokusu může být špatně

25 Řešení Použít více lokusů Mutace nejčastěji posun o jednu jednotku opakování například rodič (CTTT) 7 potomek (CTTT) 8, délka fragmentu tedy například 120 u rodiče a 124 u potomka Probability of resemblance (P R ) Podívám se na ostatní lokusy a vypočítám s jakou pravděpodobností mohou alely sdílet dva nepříbuzní jedinci. Možní otci Možní otci Pro jeden lokus AB Ab AA AB BC AC AB Ab AA AB BB AC Součin pravděpodobností přes lokusy Aa potomek Od matky Ca potomek Od matky

26 Uria lomvia 22% mimopárová paternita bez korekce na mutace 7% mimopárová paternita s korekcí soulad s jinou použitou technikou

27 Počítačové programy Cervus Colony SOLOMON (R, Bayes) Newpat Probmax Kinship Famoz Pasos Papa Parente Patri a další viz např. Jones et al (Některé programy počítají i s možnými chybami při určování genotypů Cervus3, SOLOMON, Newpat)

28 Co je nejdůležitější? Kvalitní data z terénu! Nejlépe všichni dospělci z populace, behaviorální data, mláďata přiřazena do rodin Pokud máme jen omezený vzorek více lokusů (např. 20 dobrých) Špatná data = špatné výsledky Možnost srovnání mláďat se všemi potenciálními otci téměř nemožné u minisatelitového DNA fingerprintingu snadné u mikrosatelitů

29 Příklady použití analýzy paternity

30 Orangutan na Sumatře (paternita) Nápadný dimorfismus (vystouplé tváře a hrdelní vaky u samců) Předpoklad: Samci bez nápadných znaků hormonálně suprimováni a nemnoží se Mikrosatelity 50 % mláďat je samců bez nápadných znaků alternativní strategie

31 Skladování spermií Dny u savců týdny u ptáků nebo hmyzu měsíce u mloků roky u hadů a želv Chrysemys picta Chrysemys picta mikrosatelity po 3 roky mláďata od stejného otce, opakované páření se stejným otcem je nepravděpodobné

32 Pinus sylvestris Robledo-Arnuncio & Gil 2005 Izolovaná populace ve Španělsku 36 stromů (další nejbližší 30 km) DNA z jehličí a 813 embryí Chloroplastové a jaderné mikrosatelity EP=0, embryí otci mimo lokalitu (min 30 stromů) Vysoká míra samooplození - 25% (3% ve velkých monokulturách) Míra samooplození roste se vzdáleností k nejbližšímu sousedovi Pravděpodobnost oplození klesá strmě se vzdáleností Disperze pylu je výrazně asymetrická

33 Hirundo pyrrhonota, H. rustica, Delichon urbica, Tachycineta bicolor, T. albilinea, Riparia riparia, Progne subis Ptáci Řada druhů byla považována za monogamní (pěvci) Ale u 75 % druhů ptáků mimopárová mláďata Skutečně monogamní pěvci jen 14% (Phylloscopus?) Emberiza schoeniclus až 55% mimopárových mláďat Velké rozdíly i u příbuzných druhů (vlaštovky) Malurus cyaneus až 72% mimopárových mláďat

34 Odhad % mimopárových mláďat Griffith et al Dostatečný vzorek pro odhad Více než 200

35 Dohledání mimopárových otců Vzorky z většiny možných rodičů ve sledované populaci Více lokusů Technicky obtížné

36 Tachycineta bicolor vlaštovka stromová Určení mimopárových otců Notiomystis cincta (hihi) medozobka novozélandská

37 Metody Jones & Ardren 2003, Jones et al Málo potenciálních rodičů, všichni ovzorkováni, dostatek dobrých markerů Exclusion (prosté vyloučení) nekompatibilita mezi rodičem a potomkem zamítnutí rodičovství postupným vyřazováním nakonec zbude jeden možný rodič ( biologický otec nebo matka) Zbyde více možných otců než 1, neovzorkováni všichni, víme o genotypizačních chybách Metody založené na maximální věrohodnosti Categorical and fractional allocation (založeno na pravděpodobnosti chyb a homozygotnosti homozygot má větší pravděpodobnost předat alelu) Full probability parentage analysis (Bayesian statistics) (zahrnutí i dalších dat jako vzdálenost hnízd, behaviorální data ) Rodiče neznámi a neovzorkováni Parental reconstruction Z genotypů potomků z jedné rodiny rekonstrukce genotypu rodičů Například k určení multiple paternity

38 Full probability model Bayesiánská statistika Složitější modely, zohledňují vzdálenost hnízd, frekveci krmení, párování

39 Categorical x fractional allocation Vezmu potomka, pro každou kombinaci možných rodičů spočtu pravděpodobnost, s jakou lze kombinací jejich genotypu vygenerovat genotyp potomka věrohodnostní profil Categorical likelihood Potomek přiřazen jednomu nejpravděpodobnějšímu otci, biologicky validní Fractional likelihood Potomek přiřazen všem kompatibilním otcům. Statisticky přesnější a proto někdy výhodnější Používá se však zcela vyjímečně

40 Rodiči neznámí nebo neovzorkováni Parental reconstruction Z genotypů potomků z jedné rodiny rekonstrukce genotypu rodičů Například k určení multiple paternity, rate of selfing Zásadní je velký počet mláďat ve snůšce/vrhu! Optimální je > 10

41 Příklad genotypy matky a embryí lokus 1 lokus 2 Matka embryo embryo embryo

42 Alely od matky lokus 1 lokus 2 Matka embryo embryo embryo Na druhém lokusu více než dvě alely, které nejsou od matky více otců (nebo chyba více lokusů)

43 Apodemus agrarius a sylvaticus mláďata až od tří samců (Bryja et al. 2008)

44 Kachny (Kreisinger et al. 2010) Neinvazivně Genotyp matky z peří v hnízdě Genotypy mláďat z blan z vylíhlých vajec Zjištění vnitrodruhového hnízdního parazitismu Dohledání hnízd parazitických samic Opakované hnízdění Rekonstrukce genotypů otců Zjištění extrapárových paternit Dohledání dalších mláďat extrapárových otců

45 Ambystoma maculatum axolotl skvrnitý Myers & Zamudio 2004 Jde to i bez matek Vnitřní oplození Spermatofory Samec klade Samice sebere vajec ve snůšce 2 8 samců na snůšku

46 Alternativní přístup k paternitám Vytvoření nejpravděpodobnějších skupin potomků podle jejich příbuznosti Ke skupinám dohledání rodičů (nebo určení počtu rodičů) Silnější než jednoduché paternity Pracujeme s větším množstvím informace (genotypy z celého vrhu nebo snůšky versus genotypy jen jednoho mláděte) Vhodné pro druhy s větším množstvím mláďat ve vrhu (snůšce) Program Colony

47

48 Caridina ensifera, sladkovodní krevetka Yue & Chang msat lokusy 20 matek s potomstvem 5 až 30 potomků Minimální počet otců - až 5 Colony nejpravděpodobnější počet - až 11

49 Qian et al Myrmecia pilosula 319 dělníků (17 36 na hnízdo) 9 msat lokusů 1-4 královny na kolonii Polydomní kolonie Královna se množí s 1 9 samci

50 Metodická poznámka Colony vytvoří nejpravděpodobnější skupiny Nás však často zajímá průkaznost výsledku Srovnáváme tedy věrohodnost dvou hypotéz Např. jedinci z hnízda jsou si příbuznější než náhodná dvojice z populace Full siblings versus half siblings versus unrelated Program Kingroup Pozor na problém s Bonferroniho korekcí! průkaznost zjišťuji jen u vybraných dvojic

51 Příbuzenský koeficient r r - kvantitativní míra příbuznosti, lze si představit jako: Pravděpodobnost sdílení alely jedinci (vynásobeno 2) Podíl stejných alel v genomu jedinců Celková IBD (identity by descent) Diploidní organismy Rodič potomek 0,5 Sourozenci 0,5 Jednovaječná dvojčata 1 Nevlastní sourozenci 0,25 Bratranci a sestřenice 0,125 Nepříbuzní 0 Problém: většinou neznám rodokmeny odhad z několika lokusů (msat) pomocí ML (BAYES) programy RELATEDNESS, KINSHIP (Mac), KINGROUP, makra pro Excel, COLONY

52 R = 0 R = 0.5 R = 0.25

53

54 Cynopterus sphinx kaloň krátkonosý Storz et al Kolonie složené z harémů, v harému samec a 1 až 37 samic Příbuzenská struktura kolonie a harémů (kin structure)? 10 mikrosatelitových lokusů, r, KINSHIP r blízké nule jedinci v kolonii jsou nepříbuzní Zásadní role disperze (mláďata z kolonie se v dospělosti nedrží pospolu)

55 Megaptera novaeangliae Valsecchi et al Cestují v malých skupinách Tvoří skupiny příbuzní? Kin selection? Mikrosatelity (8 lokusů), KINSHIP, NEWPAT Jediní příbuzní ve skupinách byly matky a jejich potomci. Kromě nich hodnoty r stejné jako při sloučení skupin dohromady Kin selection skupiny nevysvětluje

56 Cryptomys damarensis Burland et al Kolonie, i více než 40 jedinců Množí se jen 1 samice (královna) a 1 až 2 samci Mark-recapture minimální disperze a výměna mezi koloniemi Laboratorní experimenty inbreeding avoidance Vysvětluje to, proč se množí jen královna? 11 kolonií, mikrosatelity, RELATEDNESS Královna má mláďata i se samci, kteří nejsou v kolonii V kolonii často nepříbuzní jedinci opačného pohlaví Inbreeding avoidance nestačí k vysvětlení sociality Dominance královny

57 Haplodiploidie haploidní, diploidní Jeden otec Sestry: 0,75 Matka dcera 0,5 Více otců Sestry: 0,25-0,75 Matka dcera 0,5 Více matek i otců r různé

58 Polistes dominulus (dříve P. gallicus) vosík francouzský Queller et al Hnízdo bez ochranného obalu Zakládá často více přezimovavších samic Dominantní samice klade vajíčka (>90%), subordinátní se starají o potravu Kin selection? (Jsou si samice příbuzné?) Ve třetině případů jsou samice nepříbuzné (ML 35% nepříbuzné 7% sestřenice 56% sestry) Jediná výhoda nahrazení dominantní samice, pokud zahyne Výjimka u sociálního hmyzu!

59 Bombus pascuorum Čmeláci Darrvill et al Bombus terrestris 10 km transekt, 9 mikrosatelitových lokusů, GENEPOP, KINSHIP Haplodiploidie, monoandrie sestry r~0,75 B. terrestris 30/97 sestry 80 kolonií B. pascuorom 84/237 sestry 190 kolonií V hnízdech B. terrestris 4,5x více jedinců hnízda B.p. 11x četnější B. terrestris létá až 600 m za květy (sestry často na sousedních bodech) B. pascuorom vzácně více než 300 m (sestry většinou na stejných bodech)