Základy bioinformatického zpracování dat v proteomice. Pavel Řehulka rehulka@pmfhk.cz

Transkript

1 Základy bioinformatického zpracování dat v proteomice Pavel Řehulka rehulka@pmfhk.cz

2 Historie sekvencování DNA nepřímé metody určení sekvence bílkovin 1970: Ray Wu 12 nukleových bazí 3 roky práce 1975: Frederic Sanger & A. R. Coulson Sangerova sekvenační metoda 1977: Allan Maxam a Walter Gilbert Maxam-Gilbertova sekvenační metoda 1996: Pål Nyrén & Mostafa Ronaghi pyrosekvencování

3 Historie sekvencování DNA v dnešní době je rozvoj metod, jež jsou rychlé a pokud možno levné, například: 454 sekvencování paralelní sekvencování DNA na streptavidinových substrátech v pikolitrových reaktorech SMRT (Single molecule real-time) 1 molekula DNA, 1 molekula DNA-polymerázy 20 zeptolitrové nádobce, detekce záblesku po uvolnění fluorescenčního barviva při navázání značené báze detekce bazí el. proudem při průchodu DNA nanopóry

4 Maxam-Gilbertova metoda též chemické sekvencování vstupem je jednovláknová DNA značená radioaktivním 32 P na 5 (pomocí polynukleotid kinázy) nebo 3 konci rozdělení na 4 části, každá štěpena různými chemikáliem vzniklé různě dlouhé sekvence DNA ve všech směsích jsou separovány gelovou elektroforézou a detekovány autoradiografií

5 Maxam-Gilbertova metoda guanin: destrukce báze dimethylsulfátem, destrukce glykosidické vazby (zahřívání při neutrální ph), destrukce vazby (zahřívání při alkalickém ph) G A+G C+T C adenin + guanin: destrukce báze dimethylsulfátem, destrukce glykosidické vazby (zahřívání při neutrální ph), destrukce vazby (zahřívání při kyselém ph) cytosin a thymin: hydrazinolýza + štěpení piperidinem cytosin: hydrazinolýza v 2M NaCl + štěpení piperidinem 5 -TACCGCTTA-3

6 Sangerova metoda biochemická metoda, též dideoxy metoda nebo primed synthesis pro krátké sekvence jednovláknové DNA využívá se procesu replikace DNA v přítomnosti DNApolymerázy reakční směs: primer DNA-polymeráza radioaktivně značené ( 32 P) 2 -deoxyribonukleosidtrifosfáty 4 směsi obsahující navíc jednotlivé značené ( 32 P) 2,3 - dideoxyribonukleosidtrifosfáty (menší množství, asi 1%)

7 Sangerova metoda DNA polymeráza při náhodném začlenění dideoxy analogu nemůže dále syntetizovat => vznik fragmentu separace těchto fragmentů na polyakrylamidovém gelu s následnou autoradiografickou detekcí ddatp ddttp ddctp ddgtp sekvenovaný úsek DNA 3 -GAATTCATTCGCCAT-5 5 -CTTAAGTAAGC primer syntetizovaný fragment reakce ve směsi s ddctp 5 -TAAGCGGTA-3 3 -ATTCGCCAT-5

8 Automatizovaná Sangerova metoda místo radioaktivního značení ( 32 P) použita fluorescenční detekce dnes nejpoužívanější metoda reakční směs: fluorescenčně značený primer (4 směsi => 4 značky) DNA-polymeráza 2 -deoxyribonukleosidtrifosfáty jednotlivé směsi obsahují navíc příslušné 2,3 -dideoxyribonukleosidtrifosfáty (menší množství, asi 1%) po reakci se směsi smíchají a probíhá separace kapilární elektroforézou s fluorescenční detekcí na konci kapiláry A T C G T A A G C G G T A

9 Pyrosekvencování syntéza nových sekvnencí DNA s různou detekcí nukleotidů bez elektroforézy přítomno spousta enzymů DNA polymeráza ATP sulfuryláza luciferáza apyráza substráty adenosinfosfosulfát luciferin přidávají se nukleotidy postupně datp, dgtp, dctp, dttp za sebou detekce uvolnění světla (i jeho intenzita) po uvolnění pyrofosfátu při začlenění konkrétního nukleotidu na konci spotřeba ATP luciferázou k oxidaci luciferinu a degradace přidaného nukleotidu Apyrase Ronaghi M, Genome Res Jan;11(1):3-11. datp (d)xmp Polymerase GATCACCTGAAGTCAGCCCTTG ACTTCAGTCGGGAAC PPi ATP Light ATPsulfurylase Luciferase

10 Shotgun sequencing též nazýváno shotgun cloning metoda sekvencování dlouhých DNA vláken delší sekvence DNA (> 800 bazí) fragmentovány na menší kousky restrikčními endonukleázami (nebo mechanicky) DNA-fragmenty jsou vloženy do plazmidů BAC knihovny (= bacterial artificial chromosome library) pro větší fragmenty DNA, ty se pak fragmentují na menší, které jsou vnášeny do bakterií v plazmidech plazmidy jsou vneseny do bakterií (obvykle E. coli) bakterie se namnoží a DNA obsahující analyzovaný fragment se po vyizolování osekvenuje

11 Shotgun sequencing tyto sekvenované kousky jsou pak reasemblovány zpět každá část sekvence musí být osekvenována 5-10x Strand Původní První shotgun sekvence Druhá shotgun sekvence Rekonstrukce Sekvence TGCAGATTGGCTGACTGAATGCCTG TGCAGATTGGCTGACT GAATGCCTG TGCAGATTG GCTGACTGAATGCCTG TGCAGATTGGCTGACTGAATGCCTG problém s repetitivními úseky

12 Shotgun sequencing

13 cdna knihovny a ESTs cdna = complementary DNA nebo též copy DNA cdna není přímo genomová DNA, ale pochází z přepisu mrna, tzn. kóduje exprimovaný gen (bílkovinu) tkáň -> lýza buněk -> izolace mrna hybridizace s poly-t primerem vytvoření kopie (= cdna) pomocí reverzní transkriptázy odbourání mrna alkalickým roztokem syntéza komplementárního řetězce DNA pomocí DNA-polymerázy (spárovaný 3 konec slouží jako primer) sekvencováním cdna dostáváme tzv. EST (expressed sequence tag) viz

14 Sekvencování proteinů Určení N-koncové aminokyseliny Edmanova degradace sekvencování peptidů a proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie

15 Určení koncové aminokyseliny provádí se pomocí reakce dansyl chloridu s N-koncovou aminoskupinou a po hydrolýze peptidu/proteinu se identifikovala N-koncová aminokyselina chromatograficky dříve se též provádělo pomocí 1-fluoro-2,4-dinitrobenzenu (F. Sanger, sekvenace insulinu) ph deg.c, 1 h 6M HCl deg.c, 16 h... n

16 Edmanova degradace N-koncová aminoskupina peptidu/proteinu reaguje s fenylisothiokyanátem v bazickém prostředí za zvýšené teploty (2,5 % PITC ve směsi pyridin/voda = 1:1, 30 min, 50 o C) Phenylisothiocyanate (PITC) N-terminus of the protein immobilized on a solid support PITC coupling Cleavage v kyselém prostředí (100 % TFA, 10 min, 50 o C) pak odštěpuje 5-thiozolinonový derivát N-koncové aminokyseliny, který je po konverzi (1M HCl, 10 min, 80 o C) na fenylthiohydantoinový derivát identifikován Phenylthiocarbamyl-derivatized protein 5-Thiozolinone derivative N-terminus of the degraded protein immobilized on a solid support Conversion zbytek peptidu/proteinu je podroben dalšímu identifikačnímu cyklu Phenylthiohydantoin derivative next degradation cycle

17 dnes plně automatizovaný proces Edmanova degradace nutná dostatečné množství čistého proteinu nebo alespoň izolovaného na membráně reagenty jsou dodávány v plynné fázi, peptid/protein je ukotven na pevném nosiči (kvarterní ammoniová sůl Polybren) citlivost: 1-5 pmol pro více než 20 cyklů (tj. stanovených aminokyselin) délka cyklu: ~ 45 min, tj. asi 3 vzorky/den blokovaný N-terminus proteinu => pracné odstraňování modifikace, ne vždy efektivně úspěšné přes spoustu nevýhod ve srovnání s hmotnostní spektrometrií je to stále alternativní metoda určování sekvence bílkovin

18 Hmotnostní spektrometrie (MS) separace nabitých částic na základě poměru jejich hmotnosti a náboje, tj. m/z výsledkem je tzv. hmotnostní spektrum, kde na ose x je vynesena hodnota m/z a na ose y intenzita odezvy detektoru, často normalizovaná na nejintenzivnější pík v zobrazovaném rozsahu m/z Ion Source Mass Analyzer Detector % Recorded Spectrum m/z

19 Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS) spojení dvou hmotnostně spektrometrických analýz v prostoru nebo čase, oddělených od sebe procesem disociace iontů (většinou kolizí s neutrálním plynem) výsledkem je opět hmotnostní spektrum, popisující vztah rodičovského iontu a jeho fragmentů důležité pro získání strukturní informace rodičovského iontu ionization MS 1 precursor ion selection fragmentation of selected precursor MS 2 analysis of fragment ions

20 Trojitý kvadupól příklad MS/MS přístroje ion source detector + Q0 ion transmission Q1 precursor ion selection Q2 collision cell Q3 fragment ion analysis

21 Sekvenace proteinů pomocí MS izolace bílkovin, jejich separace (často gelovou elektroforézou) digesce vhodným enzymem (nebo chemicky) na peptidy směs peptidů buď přímo nebo po separaci (kapalinovou chromatografií) analyzujeme pomocí MS/MS vzniklé fragmentové ionty umožňují identifikaci/sekvenaci peptidů, a v důsledku i proteinů x 4 y 4 z 4 x 3 y 3 z 3 x 2 y 2 z 2 x 1 y 1 z 1 R1 O R2 O R3 O R4 O R5 H + H 2 N C C N C C N C C N C C N C COOH H H H H H H H H H a 1 b 1 c 1 a 2 b 2 c 2 a 3 b 3 c 3 a 4 b 4 c 4

22 Fragmentové ionty peptidů [N] hmotnost N- koncové skupiny peptidu [C] hmotnost C- koncové skupiny peptidu [M] součet hmotností aminokyselinových zbytků obsažených ve fragmentovém iontu [e] hmotnost elektronu Ion type Ion mass a [N] + [M] CO [e] b [N] + [M] [e] c [N] + [M] + NH 3 [e] x [C] + [M] + CO [e] y [C] + [M] + H 2 [e] z [C] + [M] NH [e] d [a-ion] [part of side chain] v [y-ion] [whole side chain] w [z-ion] [part of side chain] immonium ion [M] + H CO [e] internal y m a n [M] + H CO [e] internal y m b n [M] + H [e]

23 Struktura fragmentových iontů peptidů R1 O H 2 N C C N + C H H R2 H R3 O R4 O + C N C C N C C N C H H H H H H O R5 COOH R1 H 2 N C C N C H O H HC H R' H + a 2 x 3 d 2 R1 O H 2 N C C N C C H H R2 H O + R3 + H 3 N C C N C C H O H R4 H O N H R5 C H COOH HN C C N C C H O H R4 H O N H R5 C H H + COOH b 2 y 3 v 3 R1 O H 2 N C C N C C H H R2 O H NH 3 + R3 O R4 O C + C N C C H H H N H R5 C H COOH R' CH O R4 O C C N C C H H H N H R5 C H H + COOH c 2 z 3 w 3 R3 O R4 H 2 N C C N + C R3 O R4 H 2 N C C N C C O + R + H 2 N CH H H y 3 a 4 H H H y 3 b 4 H immonium ion

24 % Intensity Příklad MS/MS spektra peptidu interpretace MS/MS spektra vede k získání částečné nebo úplné sekvence peptidu Parent mass [M+H] y intepreted sequence: LPSEFDLSAFLR y1 20 y8 y10 b6 10 y3 y4 y5-nh3 b7 y2 y5 y7 y11 R y Mass (m/z)

25 Sekvenční databáze

26 Od DNA k proteinu (eukaryotní buňka) transkripcí z DNA vzniká primární RNA-transkript (exony + introny) modifikace konců primárního RNA-transkriptu (čepička RNA + poly(a) konec) vyštěpení intronů v enzymově katalyzovaném sestřihu RNA => vznik mrna transport mrna z jádra do cytoplasmy, kde dochází k translaci a vzniku bílkoviny některé procesy probíhají současně DNA cytoplasma exony primární RNA-transkript čepička RNA mrna mrna protein jádro gen introny transkripce přidání 5 -čepičky a poly(a) konce sestřih export do cytoplasmy translace AAAAA AAAAA AAAAA

27 Od DNA k proteinu (prokaryotní buňka) jednodušší proces (absence jádra) 5 -konec mrna vzniká iniciací transkripce, 3 -konec je určen místem terminace genu DNA gen transkripce translace může začít již před dokončením transkripce mrna translace protein

28 Sekvenční databáze Historie vzniku databází Primární a sekundární databáze Nukleotidové sekvenční databáze Struktura záznamu nukleotidové sekvence Proteinové sekvenční databáze

29 Historie vzniku databází snaha o zpřístupnění výsledků sekvenačních experimentů a vzájemnou výměnu informací 60. léta minulého století Margaret Dayhoff se spolupracovníky Protein Information Resource (PIR) sbírka proteinových sekvencí známých v té době vyšlo v tištěné podobě jako Atlas of Protein Sequence and Structure původně pouze sekvence proteinů z Edmanova sekvenování, později přidávány i nukleotidové sekvence byly přidávány i popisy sekvencí => první anotovaná databáze 1972 nutnost převést do el. podoby (nárůst rozsahu) distribuce na magn. pásku spolu s programy pro analýzu vzdálených evolučních příbuzností

30 Historie vzniku databází 1982: vzniká DNA sekvenční databáze na European Molecular Biology Laboratory (EMBL) v Heidelbergu krátce nato se připojuje GenBank při National Center for Biotechnology Information (NCBI) součást National Library of Medicine při National Institutes of Health o několik let později se připojuje i DNA Database of Japan (DDBJ) 1988: sjednocení formy spolupráce a formátu dat mezi EMBL, GenBank a DDBJ dnes: DDBJ / EMBL / GenBank konsorcium tvořené the National Institute of Genetics in Mishima, Japan the European Bioinformatics Institute (EBI) in Hinxton, UK NCBI in Bethesda, Maryland, USA

31 Historie vzniku databází 80. léta minulého století: Amos Bairoch (Ženeva) převedl PIR Atlas do formátu podobného EMBL formátu pro nukleotidové sekvence a přidal anotace k proteinovým sekvencím => PIR+ 1986: distribuce PIR+ na síti US Bionet (předchůdce Internetu) tehdy obsahovala 3900 sekvencí později vzniká SwissProt

32 Typy databází hlavní úkol databází zpřístupnit obsažené sekvence primární databáze archivní funkce obsahují experimentální výsledky s částečnou interpretací neobsahují však odborně doplněné popisy mnoha vlastností vztahujících se k dané sekvenci sekundární databáze administrované experty někdy též nazývané databáze vzorů (pattern databases) obsahují výsledky analýzy sekvencí z primárních databází kompozitní databáze kombinují různé zdroje primárních databází není nutno procházet každou primární databázi zvlášť

33 Příklady databází primární sekundární kompozitní DDBJ PROSITE NRDB EMBL Profiles OWL GenBank PRINTS PIR Pfam SwissProt BLOCKS TrEMBL IDENTIFY

34 Nukleotidové sekvenční databáze hlavním zdrojem nukleotidových sekvenčních databází je International Nucleotide Sequence Database Collaboration DDBJ / EMBL / GenBank nové sekvence lze zadávat do kterékoliv z těchto databází každá databáze si spravuje pouze sekvence do ní vložené jednou za 24 hodin si databáze navzájem vymění nová data a celkový obsah konsorcia je synchronizován (umožněno společným formátem dat) primární zdroj sekvenční a biologické informace => mnoho databází závisí na správnosti údajů v DDBJ / EMBL / GenBank

35 Konsorcium DDBJ / EMBL / GenBank Entrez NIH NCBI submissions updates GenBank NIG submissions updates CIB DDBJ EMBL EBI SRS submissions updates getentry EMBL

36 Vlastnosti databází DDBJ / EMBL / GenBank pokud pro danou nukleotidovou sekvenci není indikována kódující sekvence, tak není vytvořen odpovídající záznam v proteinové databázi příslušné porovnávání sekvencí vycházející z proteinových sekvencí může některé dostupné informace ztratit pokud záznam obsahující kódující sekvenci obsahuje chybu, tak tato chyba může být dále propagována mezi databázemi (i pomocí odvození dalších sekvencí na základě podobnosti) pokud důležitá vlastnost o proteinové sekvenci není na správném místě, tak programy navržené pro jejich získávání ji mohou ztratit

37 FASTA formát Formáty dat jednoduchý formát pro sekvence flatfile základní jednotka pro informaci o konkrétní sekvenci konkrétní formáty pro jednotlivé databáze se od sebe částečně liší ale jeho struktura přesto umožňuje vzájemnou výměnu vložených sekvencí mezi databázemi

38 FASTA formát začátek nového záznamu zdrojová databáze (SwissProt) přístupové číslo UniProt ideintifikátor krátký popis definiční řádek >sp P48598 IF4E_DROME Eukaryotic translation initiation factor 4E OS=Drosophila melanogaster GN=eIF-4E PE=1 SV=1 MQSDFHRMKNFANPKSMFKTSAPSTEQGRPEPPTSAAAPAEAKDVKPKEDPQETGEPAGN TATTTAPAGDDAVRTEHLYKHPLMNVWTLWYLENDRSKSWEDMQNEITSFDTVEDFWSLY NHIKPPSEIKLGSDYSLFKKNIRPMWEDAANKQGGRWVITLNKSSKTDLDNLWLDVLLCL IGEAFDHSDQICGAVINIRGKSNKISIWTADGNNEEAALEIGHKLRDALRLGRNNSLQYQ LHKDTMVKQGSNVKSIYTL sekvence proteinu (obvykle 60 znaků na řádek)

39 FASTA formát více záznamů >sp Q55D85 CAS1_DICDI Cycloartenol synthase OS=Dictyostelium discoideum GN=cas1 PE=1 SV=1 MTTTNWSLKVDRGRQTWEYSQEKKEATDVDIHLLRLKEPGTHCPEGCDLNRAKTPQQAIK KAFQYFSKVQTEDGHWAGDYGGPMFLLPGLVITCYVTGYQLPESTQREIIRYLFNRQNPV DGGWGLHIEAHSDIFGTTLQYVSLRLLGVPADHPSVVKARTFLLQNGGATGIPSWGKFWL ATLNAYDWNGLNPIPIEFWLLPYNLPIAPGRWWCHCRMVYLPMSYIYAKKTTGPLTDLVK DLRREIYCQEYEKINWSEQRNNISKLDMYYEHTSLLNVINGSLNAYEKVHSKWLRDKAID YTFDHIRYEDEQTKYIDIGPVNKTVNMLCVWDREGKSPAFYKHADRLKDYLWLSFDGMKM QGYNGSQLWDTAFTIQAFMESGIANQFQDCMKLAGHYLDISQVPEDARDMKHYHRHYSKG AWPFSTVDHGWPISDCTAEGIKSALALRSLPFIEPISLDRIADGINVLLTLQNGDGGWAS YENTRGPKWLEKFNPSEVFQNIMIDYSYVECSAACIQAMSAFRKHAPNHPRIKEINRSIA RGVKFIKSIQRQDGSWLGSWGICFTYGTWFGIEGLVASGEPLTSPSIVKACKFLASKQRA DGGWGESFKSNVTKEYVQHETSQVVNTGWALLSLMSAKYPDRECIERGIKFLIQRQYPNG DFPQESIIGVFNFNCMISYSNYKNIFPLWALSRYNQLYLKSKI >sp Q05581 CAS1_STRCL Clavaminate synthase 1 OS=Streptomyces clavuligerus GN=cs1 PE=1 SV=3 MTSVDCTAYGPELRALAARLPRTPRADLYAFLDAAHTAAASLPGALATALDTFNAEGSED GHLLLRGLPVEADADLPTTPSSTPAPEDRSLLTMEAMLGLVGRRLGLHTGYRELRSGTVY HDVYPSPGAHHLSSETSETLLEFHTEMAYHRLQPNYVMLACSRADHERTAATLVASVRKA LPLLDERTRARLLDRRMPCCVDVAFRGGVDDPGAIAQVKPLYGDADDPFLGYDRELLAPE DPADKEAVAALSKALDEVTEAVYLEPGDLLIVDNFRTTHARTPFSPRWDGKDRWLHRVYI RTDRNGQLSGGERAGDVVAFTPRG >sp P18503 CAS4_EPHMU Short-chain collagen C4 (Fragment) OS=Ephydatia muelleri PE=2 SV=1 DTGPQGPQGVAGPPGIDGAKGDKGECFYPPPPTCPTCPAGPPGAPGPQGAPGAPGAPGLP GPAGPQGPKGDKGLPGNDGQPGAPGAPGYDGAKGDKGDTGAPGPQGPKGDQGPKGDQGYK GDAGLPGQPGQTGAPGKDGQDGAKGDKGDQGPAGTPGAPGKDGAQGPAGPAGPAGPAGPV GPTGPQGPQGPKGDVGPQGPQGAPGSNGAVVYIRWGNNVCPAGETNVYSGHIVESSNAND ANGDYLCLPDTHNAYPPQTQNPLLNLKDVTDSYGKTVPCVACLASGRSTVFTFPDNTVCP YGWTTEYVGYEAANPKWPGQNLCVDTYFGDKLSQTPCNNLAVIAKGPLNAYSYQPQDVVS CVVCSI >sp P02662 CASA1_BOVIN Alpha-S1-casein OS=Bos taurus GN=CSN1S1 PE=1 SV=2 MKLLILTCLVAVALARPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFVAPFPEVFGKEKVNELSKDIG SESTEDQAMEDIKQMEAESISSSEEIVPNSVEQKHIQKEDVPSERYLGYLEQLLRLKKYK VPQLEIVPNSAEERLHSMKEGIHAQQKEPMIGVNQELAYFYPELFRQFYQLDAYPSGAWY YVPLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSEKTTMPLW počet záznamů souhrnné informace o databázi UniProt/SwissProt verze databáze Time files compressed : Tue Feb 02 19:18: Time files compressed (int) : Time / date of fasta file : Thu Jan 21 06:55: Time of fasta files (int) : Number of residues : Number of sequences : Number with invalid residues: 0 Number of sequences too long: 0 Length of longest sequence : Maximum Accession Length : 11 ftp://ftp.expasy.org/databases/uniprot/knowledgebase/uniprot_sprot.fasta.gz

40 Flatfile v DDBJ / EMBL / GenBank DDBJ a GenBank flatfiles jsou téměř shodné; používají slovní označení oddílů (lépe srozumitelnější) EMBL používá dvojpísmenné prefixy pro jednotlivé řádky obsahují 3 hlavní oddíly: hlavička (header) informace o celém záznamu vlastnosti (features) anotace záznamu nukleotidová sekvence poslední řádek končí znaky //

41 LOCUS DMU bp DNA linear INV 22-FEB-1998 DEFINITION Drosophila melanogaster eukaryotic initiation factor 4E (eif4e) gene, alternative splice products, complete cds. ACCESSION U54469 VERSION U GI: KEYWORDS. SOURCE Drosophila melanogaster (fruit fly) ORGANISM Drosophila melanogaster Eukaryota; Metazoa; Arthropoda; Hexapoda; Insecta; Pterygota; Neoptera; Endopterygota; Diptera; Brachycera; Muscomorpha; Ephydroidea; Drosophilidae; Drosophila; Sophophora. REFERENCE 1 (bases 1 to 2881) AUTHORS Lavoie,C.A., Lachance,P.E., Sonenberg,N. and Lasko,P. TITLE Alternatively spliced transcripts from the Drosophila eif4e gene produce two different Cap-binding proteins JOURNAL J. Biol. Chem. 271 (27), (1996) PUBMED REFERENCE 2 (bases 1 to 2881) AUTHORS Lasko,P.F. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (09-APR-1996) Paul F. Lasko, Biology, McGill University, 1205 Avenue Docteur Penfield, Montreal, QC H3A 1B1, Canada FEATURES Location/Qualifiers source /organism="drosophila melanogaster" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:7227" /chromosome="3" /map="67a8-b2" gene /gene="eif4e" mrna join( , , , , , ) /gene="eif4e" /product="eukaryotic initiation factor 4E-I" mrna join( , , , , , ) /gene="eif4e" /product="eukaryotic initiation factor 4E-I" mrna join( , , , , ) /gene="eif4e" /product="eukaryotic initiation factor 4E-II" CDS join( , , , , ) /gene="eif4e" /note="method: conceptual translation with partial peptide sequencing" /codon_start=1 /product="eukaryotic initiation factor 4E-II" /protein_id="aac " /db_xref="gi: " /translation="mvvletektsapsteqgrpepptsaaapaeakdvkpkedpqetg EPAGNTATTTAPAGDDAVRTEHLYKHPLMNVWTLWYLENDRSKSWEDMQNEITSFDTV EDFWSLYNHIKPPSEIKLGSDYSLFKKNIRPMWEDAANKQGGRWVITLNKSSKTDLDN LWLDVLLCLIGEAFDHSDQICGAVINIRGKSNKISIWTADGNNEEAALEIGHKLRDAL RLGRNNSLQYQLHKDTMVKQGSNVKSIYTL" CDS join( , , , , ) /gene="eif4e" /note="method: conceptual translation with partial peptide sequencing; two alternatively spliced transcripts both encode 4E-I" /codon_start=1 /product="eukaryotic initiation factor 4E-I" /protein_id="aac " /db_xref="gi: " /translation="mqsdfhrmknfanpksmfktsapsteqgrpepptsaaapaeakd VKPKEDPQETGEPAGNTATTTAPAGDDAVRTEHLYKHPLMNVWTLWYLENDRSKSWED MQNEITSFDTVEDFWSLYNHIKPPSEIKLGSDYSLFKKNIRPMWEDAANKQGGRWVIT LNKSSKTDLDNLWLDVLLCLIGEAFDHSDQICGAVINIRGKSNKISIWTADGNNEEAA LEIGHKLRDALRLGRNNSLQYQLHKDTMVKQGSNVKSIYTL" ORIGIN 1 cggttgcttg ggttttataa catcagtcag tgacaggcat ttccagagtt gccctgttca 61 acaatcgata gctgcctttg gccaccaaaa tcccaaactt aattaaagaa ttaaataatt 121 cgaataataa ttaagcccag taacctacgc agcttgagtg cgtaaccgat atctagtata Flatfile v GenBank a EMBL - příklad ID U54469; SV 1; linear; genomic DNA; STD; INV; 2881 BP. XX AC U54469; XX DT 19-MAY-1996 (Rel. 47, Created) DT 17-APR-2005 (Rel. 83, Last updated, Version 4) XX DE Drosophila melanogaster eukaryotic initiation factor 4E (eif4e) gene, DE alternative splice products, complete cds. XX KW. XX OS Drosophila melanogaster (fruit fly) OC Eukaryota; Metazoa; Arthropoda; Hexapoda; Insecta; Pterygota; Neoptera; OC Endopterygota; Diptera; Brachycera; Muscomorpha; Ephydroidea; OC Drosophilidae; Drosophila; Sophophora. XX RN [1] RP RX DOI; /jbc RX PUBMED; RA Lavoie C.A., Lachance P.E.D., Sonenberg N., Lasko P.; RT "Alternatively spliced transcripts from the Drosophila eif4e gene produce RT two different Cap-binding proteins"; RL J. Biol. Chem. 271(27): (1996). XX RN [2] RP RA Lasko P.F.; RT ; RL Submitted (09-APR-1996) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases. RL Paul F. Lasko, Biology, McGill University, 1205 Avenue Docteur Penfield, RL Montreal, QC H3A 1B1, Canada XX FH Key Location/Qualifiers FH FT source FT /organism="drosophila melanogaster" FT /chromosome="3" FT /map="67a8-b2" FT /mol_type="genomic DNA" FT /db_xref="taxon:7227" FT mrna join( , , , , , FT ) FT /gene="eif4e" FT /product="eukaryotic initiation factor 4E-I" FT mrna join( , , , , , FT ) FT /gene="eif4e" FT /product="eukaryotic initiation factor 4E-I" FT mrna join( , , , , ) FT /gene="eif4e" FT /product="eukaryotic initiation factor 4E-II" FT CDS join( , , , , ) FT /codon_start=1 FT /gene="eif4e" FT /product="eukaryotic initiation factor 4E-II" FT /note="method: conceptual translation with partial peptide FT sequencing." FT /db_xref="flybase:fbgn " FT /db_xref="goa:p48598" FT /db_xref="interpro:ipr001040" FT /db_xref="interpro:ipr019770" FT /db_xref="uniprotkb/swiss-prot:p48598" FT /protein_id="aac " FT /translation="mvvletektsapsteqgrpepptsaaapaeakdvkpkedpqetge

42 Příklad: Eukaryotic translation initiation factor 4E ?report=genbank entry?accnumber=u54469

43 Third party annotation (TPA) databáze navržená pro doplnění experimentálních / odvozených informací doplňující / potvrzující informace poskytnuté zadavatelem sekvence vhodné pro ostatní vědce nemající přímý přístup k databázové položce TPA dataset obsahuje reanotace existujících položek kombinace nových sekvencí a existujících primárních položek anotace archivu a celých genomových shotgun dat př.:

44 RefSeq projekt administrovaná sekundární databáze s cílem poskytnout souhrnný, integrovaný a neredundantní soubor sekvencí jak z genomické, tak transkripční a proteinové úrovně pro stále se zvyšující počet organismů důvodem vzniku byla redundance sekvencí a nejasnost původu záznamu (experiment vs. počítačové odvození) referenční sekvenci pro každou molekulu (DNA, mrna, protein) opět vyžaduje hodně práce biologických odborníků 2+6 formát přístupového kódu experimentální data genomická anotace genomický úsek (DNA) NT_ mrna NM_ XM_ modelová mrna protein NP_ XP_ modelový protein

45 EMBL Genome Reviews přechází na Ensembl Genomes opět důvodem překlenutí nedovoleného přístupu pro ostatní sekundární databáze pro administrované verze kompletních genomových sekvencí v DDBJ / EMBL / GenBank přidané další informace např. z UniProt knowledgebase, Gene Ontology Annotation (GOA), InterPro a pod. synchronizace s databází UniProt

46 Proteinové sekvenční databáze vznikly hlavně z důvodu analýzy proteinů kódovaných v genomech důležité obzvláště s příchodem aplikací hmotnostní spektrometrie v analýze proteinů (mj. analýza posttranslačních modifikací) z větší části jsou to sekundární databáze protože obsahují sekvence odvozené z DNA databází

47 Proteinové sekvenční databáze příklady GenPept jen pro proteinové sekvence odvozené translací nukleotidových sekvencí dnes součástí NCBI Protein - RefSeq obsahuje též proteinové sekvence (pro vybrané organismy) UniProt administrovaná databáze; kompozit SwissProt, TrEMBL a PIR-PSD UniProt Archive (UniParc) vkládání nových sekvencí UniProt Knowledgebase rozšíření práce původně prováděné se SwissProt, TrEMBL a PIR-PSD s cílem poskytnout expertní administrovanou databázi UniRef UniProt nonredundant reference database poskytuje neredundantní pohled na data v UniParc a UniProt Knowledgebase

48 UniProt Archive (UniParc) podstatná část sekvenčních dat proteinů pochází z přímé sekvenace proteinů SwissProt, TrEMBL, PIR-PSD patentové aplikace, PDB IPI, RefSeq, FlyBase, WormBase UniParc dává dohromady tyto zdroje (spolu s přímým zadáváním sekvencí) každá sekvence reprezentována pouze jednou svým jedinečným identifikačním číslem křížové referencování se zdrojovými databázemi (včetně verze vložené sekvence) spolu s označením stavu sekvence UniParc nemá žádné anotace sekvencí ty jsou dostupné přes původní databáze UniParc slouží k párovému přikládání sekvencí UniProt NREF 100, UniProt NREF 90, UniProt NREF 50 (UniRef klastry) seskupovány sekvence bez ohledu na druh

49 UniProt Knowledgebase SwissProt manuálně anotované záznamy založené na informaci z literatury + administrátorem vyhodnocené počítačové analýzy sekvencí TrEMBL počítačové anotované záznamy čekající na manuální anotaci (CDS z EMBL, které nejsou ve SwissProt) také PIR-PSD záznamy, které nejsou ve SwissProt/TrEMBL

50 UniProt Knowledgebase Knowledgebase je také neredundantní snaha popsat produkty odvozené z jednoho genu (nebo genů) jednoho druhu organismu jedno přístupové číslo spolu s identifikátorama isoforem (alternativní sestřihy, proteolytické štěpy, post-translační modifikace) rozsáhlé křížové reference => rozbočovač pro biomolekulární informace např. link k SWISS-2DPAGE

51 UniProt tok dat z primárních zdrojů UniProt NREF 50 UniProt NREF 90 UniProt NREF 100 Proteome Sets UniProt Knowledgebase SwissProt + TrEMBL IPI UniProt Archive Sub/ Peptide Data DDBJ/ EMBL/ GenBank VEGA PDB Patent Data WGS EnsEMBL RefSeq FlyBase WormBase Database sources

52 UniProt

53 ID IF4E_DROME Reviewed; 259 AA. AC P48598; A4V1Q6; Q95SV3; Q9VSX8; Q9VSX9; DT 01-FEB-1996, integrated into UniProtKB/Swiss-Prot. DT 01-FEB-1996, sequence version 1. DT 20-APR-2010, entry version 89. DE RecName: Full=Eukaryotic translation initiation factor 4E; DE Short=eIF-4E; DE Short=eIF4E; DE AltName: Full=mRNA cap-binding protein; DE AltName: Full=eIF-4F 25 kda subunit; GN Name=eIF-4E; Synonyms=Eif4e, EIF4F; ORFNames=CG4035; OS Drosophila melanogaster (Fruit fly). OC Eukaryota; Metazoa; Arthropoda; Hexapoda; Insecta; Pterygota; OC Neoptera; Endopterygota; Diptera; Brachycera; Muscomorpha; OC Ephydroidea; Drosophilidae; Drosophila; Sophophora. OX NCBI_TaxID=7227; RN [1] RP NUCLEOTIDE SEQUENCE [MRNA] (ISOFORM I), AND DEVELOPMENTAL STAGE. RX MEDLINE= ; PubMed= ; RA Hernandez G., Sierra J.M.; RT "Translation initiation factor eif-4e from Drosophila: cdna sequence RT and expression of the gene."; RL Biochim. Biophys. Acta 1261: (1995). RN [2] RP NUCLEOTIDE SEQUENCE [GENOMIC DNA] (ISOFORMS I AND II), AND FUNCTION. RX MEDLINE= ; PubMed= ; DOI= /jbc ; RA Lavoie C.A., Lachance P.E.D., Sonenberg N., Lasko P.; RT "Alternatively spliced transcripts from the Drosophila eif4e gene RT produce two different Cap-binding proteins."; RL J. Biol. Chem. 271: (1996). RN [3] RP NUCLEOTIDE SEQUENCE [GENOMIC DNA] (ISOFORMS I AND II), TISSUE RP SPECIFICITY, AND DEVELOPMENTAL STAGE. RC STRAIN=Canton-S; RX MEDLINE= ; PubMed= ; DOI= /s ; RA Hernandez G., del Corral R., Santoyo J., Campuzano S., Sierra J.M.; RT "Localization, structure and expression of the gene for translation RT initiation factor eif-4e from Drosophila melanogaster."; RL Mol. Gen. Genet. 253: (1997). RN [4] RP NUCLEOTIDE SEQUENCE [LARGE SCALE GENOMIC DNA]. RC STRAIN=Berkeley; RX MEDLINE= ; PubMed= ; DOI= /science ; RA Adams M.D., Celniker S.E., Holt R.A., Evans C.A., Gocayne J.D., RA Amanatides P.G., Scherer S.E., Li P.W., Hoskins R.A., Galle R.F., RA George R.A., Lewis S.E., Richards S., Ashburner M., Henderson S.N., RA Sutton G.G., Wortman J.R., Yandell M.D., Zhang Q., Chen L.X., RA Brandon R.C., Rogers Y.-H.C., Blazej R.G., Champe M., Pfeiffer B.D., RA Wan K.H., Doyle C., Baxter E.G., Helt G., Nelson C.R., Miklos G.L.G., RA Abril J.F., Agbayani A., An H.-J., Andrews-Pfannkoch C., Baldwin D., RA Ballew R.M., Basu A., Baxendale J., Bayraktaroglu L., Beasley E.M., RA Beeson K.Y., Benos P.V., Berman B.P., Bhandari D., Bolshakov S., RA Borkova D., Botchan M.R., Bouck J., Brokstein P., Brottier P., RA Burtis K.C., Busam D.A., Butler H., Cadieu E., Center A., Chandra I., RA Cherry J.M., Cawley S., Dahlke C., Davenport L.B., Davies P., Flatfile v UniProtu - příklad

54 EMBL-EBI

55 NCBI Natinal Center for Biotechnology Information

56 Nástroje pro práci se sekvenčními databázemi

57 Databázové nástroje ExPASy, UniProt, NCBI nástroje Mascot identifikace proteinů BLAST (pro nukleové kyseliny a proteiny)

58 ExPASy Expert Protein Analysis Server odkazy na databáze užitečné programy a nástroje zdroje informací pro výuku a návody k použití

59 rozebereme podrobněji ExPASy

60 UniProt

61 UniProt vyhledávání (Search) vyhledávání v základních datech Protein Knowledgebase (UniProtKB) Sequence Clusters (UniRef) Sequence Archive (UniParc) doplňující data různé informace

62 Protein Knowledgebase UniProtKB

63 Sequence Clusters (UniRef) reprezentativní sekvence 64 bílkovin v klastru

64 UniProt další nástroje BLAST párové přiložení sekvencí Align vícenásobné přiložení sekvencí (ClustalW algoritmus) Retrieve dávkové získání sekvencí na základě identifikátorů sekvencí ID Mapping mapování identifikátorů v jednotlivých databázích

65 UniProt BLAST zadaná sekvence výsledky párového přiložení detail

66 UniProt BLAST (detail) informace o párovém přiložení (ID sekvence, skóre, atd.) zadaná sekvence přiřazená sekvence z databáze informace o totožnosti, resp. podobnosti residuí

67 UniProt Align (ClustalW) zadání a výsledek

68 UniProt Retrieve zadané identifikátory sekvencí různé formáty výstupních dat

69 UniProt ID Mapping zadané identifikátory sekvencí identifikační čísla v databázi EMBL/GenBank/DDBJ zadaných čísel

70 ExPASy databáze mezi dalšími např. databáze obrazů 2D gelů (SWISS- 2DPAGE) databáze glykanů (GlycoSuiteDB)

71 ExPASy nástroje mnoho nástrojů, jak na ExPASy serveru, tak mimo, rozdělených do několika kategorií: identifikace a charakterizace proteinů identifikace a charakterizace proteinů pomocí peptidového mapování identifikace a charakterizace proteinů pomocí tandemové hmotnostni spektrometrie idetifikace pomocí pi, MW nebo aminokyselinového složení ostatní predikční a charakterizační nástroje ostatní proteomické nástroje vyhodnocování MS dat (vizualizace, kvantifikace atd.) analýza dat z 2D gelové elektroforézy překlad DNA sekvencí na proteinové sekvence podobnostní vyhledávání vyhledávání vzorů a profilů predikce post-translačních modifikací, topologií analýza primární, sekundární, terciární a kvarterní struktury proteinů přiložení sekvencí (párové, násobné) fylogenetická analýza aj.

72 návrh teoretických struktur glykanů/glykopept idů na základě experimentálně zjištěné molekulové hmotnosti ExPASy GlycoMod vložení experimentálních hodnot nastavení parametrů

73 ExPASy GlycoMod (příklad výsledku) identifikovaný N-glykan odkaz do databáze GlycoSuiteDB

74 ExPASy predikční proteomické nástroje ProtParam fyzikálně-chemické parametry proteinové sekvence (aminokyselinové složení, elementární složení, izoelektrický bod, extinkční koeficient) Compute pi/mw spočítá hodnotu pi a molekulové hmotnosti jak pro sekvence v UniProt (pomocí ID sekvence), tak pro uževatelem zadanou sekvenci GlycanMass spočítá hmotnost oligosacharidové struktury PeptideCutter predikce štěpných míst v proteinové sekvenci PeptideMass spočítá teoretické hmotnosti peptidů (spolu s posttranslačními modifikacemi uvedenými v databázi) po digesci proteinu IsotopIdent predikce teoretické isotopové distribuce peptidy, proteinu polynukleotidu nebo jiné chem látky

75 ExPASy ProtParam vložení ID proteinu nebo sekvence část výpisu výsledných hodnot pro výpočet hodnot pi/mw lze analogicky použít program Compute pi/mw (

76 ExPASy PeptideMass vložení ID proteinu nebo sekvence část výpisu výsledných hodnot zadání parametrů teoretického štěpení

77 Nástroje pro identifikaci proteinů pomocí MS dat Mascot databázové vyhledávaní a identifikace proteinů s MS a/nebo MSMS daty (Matrix Science Ltd., London) ProFound databázové vyhledávaní a identifikace proteinů s MS daty (MSMS data program X! Tandem a X! Hunter); též predikční nástroje (The Rockefeller University, New York) ProteinProspector databázové vyhledávání + predikční nástroje pro identifikaci proteinů z MS a MSMS dat (University of California, San Francisco)

78 Mascot tři nástroje pro vyhledávání: Peptide Mass Fingerprinting nástroj pro prohledávání databáze na základě metody otisku prstu (MS data) Sequence Query vyhledávání na základě MSMS dat nebo jejich částečné interpretace MS/MS Ion Search prohledávání databází s MSMS daty (vetší soubory)

79 % Intensity Typické MS spektrum peptidové směsi po digesci v gelu E Mass (m/z)

80

81

82

83 % Intensity Typické MSMS spektrum vybraného peptidového prekurzoru Mass (m/z)

84

85

86

87 BLAST Basic Local Alignment Search Tool at NCBI ( porovnávání na úrovni nukleových kyselin porovnání na základě sekvencí proteinů další nástroje pro analýzy sekvencí

88 BLAST at NCBI ( zadávací formulář výběr databáze volba algoritmu

89 BLAST at NCBI ( sekvence z databáze přiřazená k dotazu

90 Příklady ke cvičení

91 Informace o vzorku protein byl separován pomocí gelové elektroforézy redukce disulfidických můstků byla provedena dithiothreitolem, následná modifikace cysteinů byla provedena jodacetamidem (= Carbamidomethyl (C) ) enzymatické štěpení bylo provedeno v gelu pomocí trypsinu (štěpí za lysinem (K) a argininem (R), nenásleduje-li prolin) hmotnostní analýza byla provedena na hmotnostním spektrometru typu MALDI-TOF/TOF pro databázové vyhledávání použijte jeden z nástrojů

92 Nastavení databázového vyhledávání (Mascot) database: SwissProt enzyme: Trypsin missed cleavages: 1 taxonomy: All entries fixed modifications: Carbamidomethyl (C) variable modifications: Gln->pyro-Glu (N-term Q) Oxidation (M) Acetyl (Protein N-term) peptide tolerance: 30 ppm MSMS tolerance: 300 mmu mass values: [M+H] + Monoisotopic

93 zde doplnit svoje m/z hodnoty

94 Nastavení databázového vyhledávání (Protein Prospector) database: SwissProt digest: Trypsin max missed cleavages: 1 taxonomy: All fixed modifications: Carbamidomethyl (C) variable modifications: Peptide N-terminal Gln to pyroglu Oxidation of M Protein N-terminus Acetylated peptide tolerance: 30 ppm MSMS tolerance: 300 mmu mass are: monoisotopic

95 zde doplnit svoje m/z hodnoty

96 % Intensity Příklad MS spektra Refl ector Spec #1 M C=>BC[ BP = , 4573] získaný seznam píků hmotnostní spektrum Mass (m/z )

97 Výsledky vyhledávání z programu MS-Fit nejvyšší skóre identifikovaný protein exp. vs. teor. m/z hodnoty identifikované peptidové sekvence nástroje pro další analýzu nezidentifikovaných m/z hodnot

98 Výsledky vyhledávání z programu Mascot PMF hity mimo zelený rámeček jsou významné nejvyšší skóre identifikovaný protein parametry vyhledávání

99 Detailní popis výsledku vyhledávaní v programu Mascot PMF (I) skóre a expect hodnota molekulová hmotnost a pi sekvenční pokrytí

100 Detailní popis výsledku vyhledávaní v programu Mascot PMF (II) exp. vs. teor. m/z hodnoty identifikované peptidové sekvence rozložení experimentálních chyb flat file záznamu proteinu v databázi

101 % Intensity Příklad MSMS spektra s označenými ionty MS/MS Precursor y13 ion type m/z y y y y y y y y y y y y y y14 40 y7 30 y y1 y2 y3 y4 y5 y6 y8 y9 y11 y Mass (m/z)

102 ion type m/z difference AA alt. AA y y V y L I y Q K y S y V y Q K y E y F y T y G y S y P y F odečítáme odspodu (protože y-ionty) sequence FPSGTFEQVSQLV

103

104 rozkliknout informace o parametrech vyhledávání

105 zde další informace a nástroje

106 Program mmass ( Ke stažení (Windows, Mac OSX, Linux) na adrese

107 Zpracování spektra v programu mmass detekce píků manuálně nebo automaticky

108 Zadání získaných dat do programu Mascot PMF

109 Detail dialogového okna programu Mascot PMF

110 Výsledek vyhledávání v programu Mascot PMF (zadáno z programu mmass)

111 Detailní popis výsledku vyhledávaní v programu Mascot PMF (I) skóre a expect hodnota molekulová hmotnost a pi sekvenční pokrytí (zde je vyšší oproti 43%)

112 Detailní popis výsledku vyhledávaní v programu Mascot PMF (II) exp. vs. teor. m/z hodnoty identifikované peptidové sekvence rozložení experimentálních chyb flat file záznamu proteinu v databázi

113 Vyhledávací program PROFOUND (pro PMF)

114 Detail dialogového okna programu PROFOUND

115 Detail dialogového okna programu MS-Fit v programu mmass

116 nejvyšší skóre Výsledky vyhledávání z programu MS-Fit identifikovaný protein identifikované peptidové sekvence exp. vs. teor. m/z hodnoty nástroje pro další analýzu nezidentifikovaných m/z hodnot

117 Automatický výběr píků v programu mmass

118 Výsledek vyhledávání v programu Mascot PMF (zadáno z programu mmass po automatickém výběru píků) mnoho falešných píků snižují skóre sekvenční pokrytí docela dobré