Sortování savčích chromozomů a jejich praktické využití. Svatava Kubíčková, Jan Fröhlich, Halina Černohorská

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Sortování savčích chromozomů a jejich praktické využití. Svatava Kubíčková, Jan Fröhlich, Halina Černohorská"

Arnošt Štěpánek
před 8 lety
Počet zobrazení:

1 Sortování savčích chromozomů a jejich praktické využití Svatava Kubíčková, Jan Fröhlich, Halina Černohorská

2 2

3 gene specific FISH sondy centromere specific flow sorting conventional microdissection laser microdissection

4 Flowcytometrické karyotypování a sorting chromozomů - Historie Užívána od pol. 70. let 20.stol (Gray et al., 1975, Wray and Stubblefield, 1970). První experimenty na chromozomech křečka barvené jen ethidium bromidem (Jednokanálové experimenty). Konec 70.let - zaveden systém dvou laseru => možnost užití 2 barev vedlo ke zlepšení rozlišovací schopnosti (Dean and Pinkel, 1978, Langlois and Jensen 1979). Na počátku 90. let sortované chromozomy sloužily pro konstrukci DNA knihoven pro počáteční fáze Human Genome Project (Van Dilla and Deaven 1990). Navzdory všem vylepšením za posledních 20 let se stále nedaří rozeznat celou řadu chromozomu u různých druhů zvířat => využití FISHIS (Fluorescence in situ hybridization in suspension). 4

let - zaveden systém dvou laseru => možnost užití 2 barev vedlo ke zlepšení rozlišovací schopnosti (Dean and Pinkel, 1978, Langlois and Jensen 1979). Na počátku 90.

5 Flowcytometrické karyotypování a sorting chromozomů - aplikace Detekce delecí, aneuploidii, translokací, markerových chromozomů nebo jiných chromozomových abnormalit (Gray et al., 1988). Využití v genomových evolučních studiích (tvorba FISH sond) (Carter et al., 1992). Flow-sortování chromozomu je jednoduchou a levnou metodikou pro získání velkých množství určitého chromozomu v karyotypu o vysoké čistotě (více jak 90 %) => užití k vytvoření DNA knihoven. Sexation pohlaví potomstva založeno na oplodnění spermiemi, které byly rozděleny dle přítomnosti chromozomů X a Y. 5

Flow-sortování chromozomu je jednoduchou a levnou metodikou pro získání velkých množství určitého chromozomu v karyotypu o vysoké čistotě (více

6 Aplikace I - Identifikace derivovaných nebo markerových chromozomů A) B) Figure. Pictures shows flow karyotypes of two patients with derivated chromosomes. The peaks representing the normal chromosomes and additionally in case A) chromosomes X, 8, and 7, and the derivative chromosome 8 are indicated. In B) the peaks representing the normal and derivative chromosomes 21 (Carter et al., 1992). 6

The peaks representing the normal chromosomes and additionally in case A) chromosomes X, 8, and 7,

7 Aplikace II - Chromosome painting and genomové evoluční studie Chromosome painting je metoda využívající principy FISH (fluorescence in situ hybridization). Malovací sondy vytvořené z chromozomu jednoho druhu jsou hybridizovány na chromozomy příbuzného druhu. Reciproký chromozomový painting umožňuje zobrazení chromozomových homologií, translokací, delecí a popřípadě inverzí, ke kterým došlo během evoluce (Wienberg et al., 1990, 1992; Jauch et al., 1992, Korstanje 1999). Figure. Color-banded chromosomes of human and the great apes arranged according to the numbering system of the human idiogram. Chromosomes in each cases colorbanded using multicolor gibbon probe set (Harlequin FISH, Cambio) (Ferguson-Smith et al.,2000). 7

Reciproký chromozomový painting umožňuje zobrazení chromozomových homologií, translokací, delecí a popřípadě inverzí, ke kterým došlo během evoluce (Wienberg et al.

8 MoFlo XDP DNA specific fluorescent dyes Hoechst (A-T), Chromomycin A3 (G-C) 8

10 10 Karyotyp Homo sapiens

11 Flow kayryotyp - člověk (Homo sapiens) Figure. Human bivariate flow karyotype from a normal male individual. Different peaks represent chromosomes of varying size and base pair content. Using modern high-end machines, quality preparations have made it possible to resolve two parental alleles for certain chromosomes (NG and Carter, 2006). Figure. Human bivariate flow karyotype of the normal male Lymphocyte cells. 11

Different peaks represent chromosomes of varying size and base pair content.

12 12 Karyotyp Sus scrofa

13 Flow karyotyp - prase (Sus scrofa) Figure. Pig bivariate flow karyotype from a normal male (Yerle et al., 1993) Figure. Izolace prasečích chromosomů z linie IPEC (Intestinal Porcine Epitelial Cells ) 13

14 14 Karyotyp Bos taurus

15 Flow karyotyp - kráva (Bos taurus)? 28 Figure. Buňky z linie MDBK (Madine-Darby Bovine Kidney) Figure.Bivariate flow karyotype of the bovine cell culture. (Schmitz et al.,1995) 15

16 16 Karyotyp Vulpes vulpes

17 Flow analýza karyotypu liška (Vulpes vulpes) 17 Figure. Flow karyotype of the red fox with chromosomal assignments. Cell line derivated from Red Fox skin fibroblasts. Figure. Flow karyotype of the red fox with chromosomal assignments. (Yang et. al, 1999)

Cell line derivated from Red Fox skin fibroblasts. Figure.

18 PALM MicroLaser system slide 0,17 mm objective 100x 150x 18

19 19 LMM (laser microbeam microdissection)

20 20 Laser microdissection and catapulting

21 Chromozomové malovací sondy kopií chromozomů izolovaných průtokovou cytometrií kopií chromozomů ( nebo jejich částí) izolovaných mikrodisekcí DNA je amplifikovaná metodou DOP PCR ( primer 5`-CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G-3`) značení amplifikačních produktů v sekundární PCR za využití značených nukleotidů: biotin-dutp, digoxigenin-dutp, orangedutp, fluorescein -dutp ověření sondy FISH 21

22 Chromozomové malovací sondy Sus scrofa sus

23 Sus scrofa - subchromosomální sondy

24 Chromozomové malovací sondy Homo sapiens homo 2 homo 21

26 Chromozomové malovací sondy Bos taurus bos bos 5tel

27 Detekce chromozomálních aberací sus tranlokace inzerce

28 subfamily Caprinae subfamily Cephalophinae subfamily Reduncinae subfamily Alcelaphinae subfamily Hippotraginae subfamily Peleinae subfamily Aepycerotinae subfamily Bovinae subfamily Tragelapinae subfamily Antilopinae subfamily Neotraginae family Bovidae 28

29 kráva 2n=60 sitatunga 2n=30 29 stanovení fúzí

30 30 Bongo

31 Nyala Lesser kudu Greater kudu Bushbuck Sitaunga Bongo Common eland Derby eland 11; 22; 2 1; 5 24; 22; 2 3; 22; 2 3; 22; 2 3; 22; 2 3; 22; 2 3; 22; 2 2; 10 4; 5 6; 10 5; 10 5; 10 6; 11 6; 11 4; 7 3; 10 1; 29 4; 12 1; 29 5; 10 5; 10 3; 11 1; 29 4; 15 1; 29 4; 19 4; 12 4; 12 6; 16 6; 20 5; 17 8; 15 6; 21 1; 29 1; 29 12; 18 7; 18 8; 16 6; 24 7; 28 9; 20 9; 20 8; 20 8; 17 11; 20 11; 18 8; 15 8; 24 8; 24 9; 27 12; 16 7; 28 7; 26 9; 23 15; 16 15; 16 15; 22 11; 23 9;26 16; 20 11; 20 7; 28 7; 28 14; 29 9; 27 23; 12 14; 19 14; 27 18; 19 18; 19 19; 21 18; 21 9; 28 16; 17 14; 26 14; 26 14; 26 19; 25 21; 23 18; 26 21; 23 21; 23 15; 28 17; 27 17; 27 17; 27 X X; 13 X X X; 13 XX X X Y; 13 Y; 13 Y; 13 Y; 13 Y; 13 Y; 13 Y; 13 Y; 13

32 Y;13 1 Fylogenetické stromy Tragelaphus imberbis kudu malý 2;22 2 Tragelaphus angasii nyala nížinná 1;29 3 Tragelaphus strepsiceros kudu velký 3(2;22) 4 Tragelaphus scriptus lesoň 5;10 5 Tragelaphus eurycerus bongo Rubes et al ;12 17;27 21;23 8 Tragelaphus spekei sitatunga Taurotragusus oryx a.losí 15 T. derbianus a.derbyho

33 Antilopa čtyřrohá (Tetracerus quadricornis ) tandemové fúze Ropiquet et al. 2010

34 Dik-Dik ( Madoqua kirkii) stanovení cytotypu BOS 11 qd (green) cen cen BOS 26 qd (red) BOS 23 qd (green) BOS 27 qd (red) BOS 28 qd (green) BOS 1 qd (red) A1 q: BTA 1, BTA 28, BTA 27, BTA 23, BTA 26, A1 p: BTA 11 Cernohorska et al. 2011

35 Žirafa (Giraffa camelopardalis) a vidloroh (Antilocapra americana ) - přestavby chromozomů BTA1 a BTA3 sondy bos 1tel a bos 3tel Cernohorska et al. 2013

36 Antilopini (Bovidae) fúze X;BTA5 - přestavby GLE, NDA, ETH tandemová fúze ACE centrická fúze Cernohorska et al. 2015

37 translokace rob(1;29) u skotu normalní rob(1;29) rob(1;29) Y X X X 37

38 Antilopa jelení - polymorfismus fúzovaný a disociovaný chromozom 8 a 14 38

39 Chromozomální mosaicismus Mountain Reedbuck (Redunca fulvorufula), 2n=56 X Y Y Bahnivec horský ( Redunka fulvorufula ) - extra Y chromozom v 11% buněk 39

40 Orangutan bornejský a sumaterský ( Pongo pygmeus ) a sumaterský ( Pongo abelii ) Tsend-Ayush et al stanovení druhu ( bornejský x sumaterský ): FISH sonda homo 3dist 40

41 Komparativní FISH a malovací sondy průtoková cytometrie laserová mikrodisekce + efektivní, velice rychlé + možnost subchromosomálních sond - omezena na Flowcytometricky (specifické pro ramena, oblasti rozlišitelné chromosomy chromosomu) - sondy pouze pro celé - pomalé, zisk málo chromozomů chromosomy - nutná znalost karyotypu 41

42 Shrnutí FISH - dobré využití v oblasti detekce chromozomových abnormalit (delecí, translokací, inserce). Flow-sorting poskytuje vysoká množství specifického chromozomu o vysoké čistotě za relativně krátký čas vhodné pro FISH sondy konstrukci BAC klonů, NGS. Flow-sorting chromozomů je silnou metodou pro identifikaci a rozlišení chromozomů u celé řady druhů organismů. Flow-sorting i laserová mikrodisekce bezkontaktní získání chromozomů snižuje riziko kontaminace podstatné u metod založených na PCR Laserová mikrodisekce izolace subchromozomálních fragmentů > 1µm 42

Podobné dokumenty

Využití průtokové cytometrie v analýze savčích chromozomů

Využití průtokové cytometrie v analýze savčích chromozomů Jan Fröhlich frohlich@vri.cz Brno 17.-18.5.2015 Flowcytometrické karyotypování a sorting chromozomů - Historie Užívána od pol. 70. let 20.stol