MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 ysokoúčá kapalová chroaografe Teore HPLC Josef Cvačka, 4. 10. 016 1 MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Reečí velčy R, M ' R, Reečí čas R je celkový čas od ásřku vzorku do zazaeáí píku deekore. Mrvý čas M je reečí čas aalyu, kerý eí v koloě zadržová, j. aalyu, kerý se pohybuje koloou sejou rychlosí jako oblí fáze. šechy aalyy sráví v oblí fáz sejý čas - rvý čas koloy. Redukovaý reečí čas R je čas, kerý příslušý aaly sráví ve sacoárí fáz.
MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Reečí velčy R, M ' R, Reečí obje R je celkový obje oblí fáze, kerá proeče sysée od ásřku vzorku do zazaeáí píku deekore. Mrvý obje M je reečí obje aalyu, kerý eí v koloě zadržová, j. aalyu, kerý se pohybuje koloou sejou rychlosí jako oblí fáze. Je o obje koloové rubce íus obje áplě. Redukovaý reečí obje R je dá rozdíle reečího a rvého objeu. 3 MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Průok oblí fáze Leárí rychlos oblí fáze u [c/] u L M L délka koloy Objeová průoková rychlos oblí fáze F [l/] M F M R, F R, ' R, F ' R, obje oblí fáze v koloě 4
5 Dsrbučí kosaa K D je poěr rovovážé kocerace aalyu ve sacoárí a oblí fáz s s s D c c K ) ( ) ( ) ( ) ( (c ) s kocerace aalyu ve sacoárí fáz (c ) kocerace aalyu v oblí fáz obje oblí fáze s obje sacoárí fáze MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Dsrbučí kosaa 6 Reečí poěr k jeda z ejužívaějších reečích velč. Udává kolkrá více času sráví aaly ve sacoárí fáz ež ve fáz oblí, j. v kolkaásobku rvého času (objeu) aaly eluuje. Je o poěr lákových ožsví aalyu ve sacoárí a oblí fáz za rovovážých podíek. M M R M R k,, ' s D s K k, ) ( ) ( MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Reečí poěr s D M R K,,
MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Separačí fakor k k 1 K K D, D,1 Separačí fakor (selekva) paraer charakerzující vzájeou reec dvou aalyů. 7 MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Teore chroaografckého para Kolou lze hypoecky rozděl a ožsví zv. paer, a keré dochází k okažéu usaveí rovováhy. Tvar elučí křvky z eore chroaografckého para vyplývá, že elučí křvka á var Possoova rozděleí, keré lze pro vysoký poče paer lze ahrad Gaussovou křvkou. c c ax ( exp R, ) w b šířka píku př základě w 0,5 šířka píku v polově výšky 8
MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Teore chroaografckého para Poče eoreckých paer bezrozěrá velča pro vyjádřeí účos chroaografcké koloy. ypočíá se z šířky píku v chroaograu 16 w R, b 5,54 w R, 0,5 ýškový ekvvale eoreckého para H délka koloy přpadající a jedo eorecké paro H L 9 MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Rozšřováí chroaografcké zóy v koloě ásřk aalyu ok oblí fáze,,, a Deeerova rovce vzah ez výškový ekvvalee eoreckého para a leárí průokovou rychlosí; uvažuje varablu oku oblí fáze uvř koloy (H p ), dfuz aalyu (H d ) a rychlos přeosu hoy ez sacoárí a oblí fází (H ). H H p H d H 10
MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 a Deeerova rovce ířvá dfuze (varabla oku oblí fáze) epravdelos ve sacoárí fáz způsobují, že ěkerý kaálky proudí oblí fáze s aalye rychlej ež jý H p d p geoercký fakor závslý a dsrbuc velkos čásc d p velkos čásc Malzace příspěvku vířvé dfuze: alé čásce sacoárí fáze s úzkou dsrbucí velkosí kvalě aplěé koloy 11 MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 a Deeerova rovce Axálí dfuze (dfuze aalyu podél osy koloy) koceračí gradey po sraách zóy způsobují pohyb aalyu do oblas s žší kocerací H d D u D dfuzí koefce aalyu v oblí fáz u leárí rychlos oblí fáze Malzace příspěvku axálí dfuze: rychlejší eluce (vyšší průok) za běžých průoků v HPLC je eo příspěvek zaedbaelý 1
MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 a Deeerova rovce Keka přeosu hoy (odpor pro přeosu hoy) kobace rychlos adsorpce a povrch fáze a přeos hoy (zejéa daý dfuzí) uvř sacoárí fáze. Malzace příspěvku odporu pro přeosu hoy: H d D p u fakor závslý a ypu áplě (velkos pórů čásc, varu čásc D dfuzí koefce aalyu v oblí fáz u leárí rychlos oblí fáze d p velkos čásc alé čásce sacoárí fáze s úzkou dsrbucí velkosí žší průokové rychlos vyšší eploy koloy 13 MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 a Deeerova rovce prax se používá zkráceý záps a Deeerovy rovce závslos výškového ekvvaleu eoreckého para a leárí rychlos oblí fáze H [µ] H A B u C u A,B,C kosay pro daý chroaografcký sysé álí H, ejvyšší opálí leárí průoková rychlos u [/s] 14
MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 a Deeerova rovce Účos separace rose se sžující se velkosí čásc áplě (H~,5d p ). Mu křvky udává průokové rychlos, př keré koloa vykazuje ejvěší účos. Mu je pro alé čásce ploché, j. je ožo pracova v šrší rozsahu průoků bez zráy účos. 15 MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 HPLC a UHPLC (UPLC) UHPLC = Ulra Hgh Perforace Lqud Chroaography ysokoúčá kapalová chroaografe s čásce eší ež a vel vysoký provozí lake (do ~ 1000 bar). Dosahuje se vyšších účosí separace a vel krákých reečích časů. 16
MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 elkos čásc a lak v syséu Tlak v HPLC syséu je přío úěrý průoku, vskozě oblí fáze a délce koloy a epřío úěrý druhé ocě velkos čásc a průěru koloy. P ~ F d p L d c 17 MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Teploa a její vlv a účos Př vysokých průocích se řeí oblí a sacoárí fáze v koloě vyváří eplo. Produkce epla je úěrá laku a koloě a průoku oblí fáze. Teploí gradey způsobují rozdíly ve vskozě oblí fáze a í heerogeí dsrbuc vekorů její rychlos. Účos koloy je í egavě ovlvěa. 1/ deálě zolovaé sěy koloy eploí grade v ose koloy / deálě erosaovaá koloa eploí grade v ose kolé a osu koloy reálých podíkách kobace obou eploích gradeů, uo zajs dobrý odvod epla (koloy s alý průěre, erosaováí). 18
MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Mokoloové příspěvky k rozšřováí zó K celkové šířce píku přspívá eje koloa, ale osaí čás HPLC syséu: celkový j koloa spoj de el j příspěvek jekoru. Obje vzorku by ěl bý co eješí (< 1 eor. paro), asříkuá zóa by ěla bý j K pravoúhlá. K fakor závslý a kosrukc jekoru j spoj příspěvek spojovacích rubc. Spojovací rubce usí í alý vří průěr a usí bý co ejkraší 4 R l spoj 4D F R,l vří poloěr a délka rubce 19 MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Mokoloové příspěvky k rozšřováí zó Profly rychlosí v rubc: Laárí prouděí vzká př běžých rychlosech oblí fáze v HPLC. Kapalu lze považova za soubor vrsev, ez ž působí vskózí síly. Turbuleí prouděí vzká př vel vysokých rychlosech (~100l/.), uspořádaá dsrbuce rychlosí je arušea, pohyb oblí fáze je chaocký, dochází k ezvíu proícháváí. de příspěvek deekoru. Závsí a objeu a geoer de deekčí cely de K el příspěvek elekroky. Závsí a časových kosaách elekrockých obvodů (zeslovačů). kos el F 0
MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Syere píku A S B A w T f f 0,05 Fakor asyere A s íra souěros chroaografckého píku, určuje se v 10% výšky. Talg fakor T f obdobá velča jako fakor asyere používaá ve faraceucké aalýze. Určuje se v 5% výšky píku. T f >1 pro píky asyercké v sesupé čás ( alg píky) T f <1 pro píky asyercké ve vzesupé čás ( frog píky) 1 MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Rozlšeí Rozlšeí velča kvafkující schopos chroaografckého syséu vzájeě odděl dva aalyy. R 1, R, R,1 0,5 ( wb, wb, 1)
MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Rozlšeí Dva píky jsou rozděley a základí l pokud je R>1.5 3 MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Rozlšeí PŮODNÍ R 1, k1 (,1 1) 4 1 k 1 účos selekva reece ZMĚNA k Ovlvěí selekvy a reece olba oblí fáze, volba sacoárí fáze, eploa. Ovlvěí účos Délka koloy, velkos čásc, průok. ZÝŠENÍ ZÝŠENÍ 4
MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Rozlšeí R 1, k1 (,1 1) 4 1 k 1 Nejvěší vlv a rozlšeí zvýšeí lze dosáhou opalzací sacoárí oblí fáze. Má výza, ale rozlšeí rose je s druhou odocou. k Pro vyšší reečí časy se posledí čle blíží k 1 a eá edy sysl dále reec zvyšova. 5 MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Isokracká a gradeová eluce Izokracká eluce: Složeí oblí fáze (její elučí síla) se běhe aalýzy eěí. Gradeová eluce: Elučí síla oblí fáze vzrůsá běhe aalýzy. ýhody gradeové eluce: hodější pro koplexí vzorky s velký poče aalyů Lepší rozlšeí pro píky a začáku a koc chroaograu yšší clvos pro píky a koc chroaograu ěší kapaca píků (víc se jch vejde do chroaograu) Nevýhody gradeové eluce: Náročější srueace (čerpadla) Náročější vývoj eody Delší doby aalýzy vyplývající z uos ekvlbrace kolo 6
MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Účos v gradeové eluc kapaca píku Př gradeové eluc se (éěř) eěí šířka píku s čase a elze edy pro hodoceí účos použí rovc: R, 16 wb Kapaca píku P: elča pro srováváí účos růzých gradeů podíl celkové doby gradeu a průěré šířky píku v chroaograu P: 100-00 (grade) P 1 (1/ ) g 1 w b 7 g doba rváí gradeu MC30P14 ysokoúčá kapalová chroaografe, 016/017 Ovlvěí separačího procesu v HPLC Separac lze ovlv: - zěou velkos erakce ez aalye, sacoárí a oblí fází erodyacký aspek - ovlvěí šířky zó eluujících složek kecký aspek Terodyacký aspek: K R, M D, s Ovlvňujee dsrbučí kosay aalyů zěa oblí ebo sacoárí fáze. K D je závslá a eploě, eploa ovlvňuje separac. Kecký aspek: Šířku píků lze ovlv vše paraery vyskyující se v plé verz a Deeerovy rovce, j. leárí rychlosí oblí fáze, velkosí čásc sorbeu, dfuzí koefcey (lze ovlv eploou!), délkou koloy. 8