BACTEC PZA Test Medium Culture Vials Middlebrook Medium 7H12 o ph 6,0

Transkript

1 ÚÈEL POUŽITÍ Testovací médium BACTEC PZA (živná pùda Middlebrook 7H12, ph 6,0) bylo speciálnì vyvinuto pro testování citlivosti kmene Mycobacterium tuberculosis na pyrazinamid (PZA). Hlavní použití je vázáno na vybavení BACTEC 460TB. SHRNUTÍ A VYSVÌTLENÍ Radiometrická technika BACTEC je používána k testování antimikrobiální citlivosti na primární antimykobakteriální léèiva (streptomycin, isoniazid, rifampin a etambutol). 1-4 Pøi této technice se kvantitativnì mìøí 14 CO 2 produkovaný mykobakteriemi z metabolismu substrátu C 14 pøítomného v médiu BACTEC 12B. Pokud je do média pøidána antimikrobiální pøísada, mykobakteriální mikroorganismy propagované v èisté kultuøe, které jsou na tuto antimikrobiální pøísadu citlivé, jsou inhibovány a množství vytváøeného 14 CO 2 se sníží. Butler a spol. 5 navrhli zlepšenou konvenèní metodu testování citlivosti na PZA, která vyžaduje speciální 7H10 agarové médium o ph 5,5. Nevýhodou této metody je, že pøi ph 5,5 mnoho mikroorganismù M. tuberculosis propagovaných v èisté kultuøe se buï nemnoží, nebo se množí špatnì. Médium BACTEC 12B nelze použít k testování citlivosti na PZA, nebot tato látka je aktivní pouze pøi nižších hodnotách ph. 5 Heifets et al. navrhli radiometrickou metodu testování citlivosti na PZA s použitím média BACTEC 12B pøi ph 5,5. Tato metoda vyžaduje snížení ph každé jednotlivé lahve ze 6,8 na 5,5, jakmile v lahvièce zapoène rùst. 6 Pøi ph 5,5 rùzné mikroorganismy propagované v èisté kultuøe v médiu 12B nerostou, aèkoli všeobecné výsledky získané s médium o 12B ph 5,5 byly lepší než výsledky získané pøi použití 7H10 o ph 5,5. Pozdìji bylo navrhováno pøidat pro zlepšení rùstu mykobakterií vajeèný žloutek. 7 Pøi tomto postupu. To mìlo za následek validnìjší výsledky, zjistilo se však, že pøidávání èerstvého vajeèného žloutku je pro rutinní klinickou laboratoø nepraktické. Salfinger a Heifets po dalších studiích ohlásili, že MIC PZA se zvýšilo pøi zvýšení ph média ze 5,5 na 6,8. 8 Pøi použití modifikace výše uvedených radiometrických postupù zjišt ování citlivosti Salfinger et al. doporuèili použít médium BACTEC 12B pøi ph 5,9 až 6,0 (testovací médium BACTEC PZA Test Medium) s koncentrací PZA vyšší, než je koncentrace používaná v konvenèních pevných médiích (ph 5,5). 9 PRINCIP POSTUPU Testovací médium BACTEC PZA je modifikované médium 7H12 se sníženým ph (6,0). Pøi tomto ph lze aktivitu PZA proti mykobakteriím stanovit bez inhibice rùstu vìtšiny mikroorganismù M. tuberculosis, propagovaných v èisté kultuøe. Pøi testu BACTEC je ke kompenzaci zvýšeného ph je použita vyšší koncentrace PZA (100 µg/ml ve srovnání se µg/ml pøi konvenèním testu). Testovací médium PZA obsahuje znaèený substrát 14 C. Mykobakterie pøi rùstu v tomto médiu metabolizují znaèený substrát a 14 CO 2 se uvolòuje do atmosféry nad médiem uvnitø utìsnìné lahvièky. Pøístroj BACTEC 460TB testuje pøítomnost 14 CO 2 odstranìním plynu z lahvièky a jeho pøevedením do elektrometru, kde je množství ionizace zkonvertováno na èíselnou hodnotu, tzv. rùstový index (GI). Stupeò a množství 14 CO 2 produkovaného v médiu je pøímo úmìrné stupni a množství rùstu v médiu. Po pøidání antimykobakteriální látky PZA do média je rùst citlivých mykobakterií inhibován. Na to poukazuje snížení produkce 14 CO 2 ve srovnání s opaèným trendem u kontrolních lahvièek. Pokud jsou organismy rezistentní, v testovací lahvièce dojde k malému nebo žádnému potlaèení rùstu. REAGENTY Obsah* na jednu lahvièku (4 ml) testovacího média PZA (koneèná hodnota ph 6,0 ± 0,2): Živná pùda 7H9... 0,47 % w/v Hydrolyzát kaseinu... 0,10 % w/v Albumin z hovìzího séra... 0,50 % w/v Kataláza jednotek Substrát 14 C... 4 µci Deionizovaná voda (ml)... 4 q.s. *Doplnìno tak, aby byla splnìna kritéria výkonu. Varování a bezpeènostní opatøení: Pro diagnostiku in vitro. BACTEC PZA Test Medium Culture Vials Middlebrook Medium 7H12 o ph 6,0 Produkt obsahuje suchý pøírodní kauèuk. PP071JAA MA /06 V klinických vzorcích se mohou nacházet patogenní mikroorganismy vèetnì virù hepatitidy a HIV. Proto dodržujte pøi práci se vším, co je kontaminováno krví a jinými tìlními tekutinami, standardní bezpeènostní opatøení Èesky

2 Postupy je tøeba provádìt ve vhodnì zabezpeèené pracovnì a náležitì vìtraném prostoru. Inokulované lahvièky musejí být testovány na pøístroji BACTEC 460TB vybaveném digestoøí BACTEC 460TB, což zajistí filtrovaný vzduch HEPA a negativní tlak v testovací oblasti pøístroje. Pøed použitím je každou lahvièku nutno peèlivì prohlédnout a vylouèit její poškození, narušení nebo kontaminaci (zakalení, vyduté nebo propadlé víèko). Je-li lahvièka kontaminovaná, NEPOUŽÍVEJTE ji. V kontaminované lahvièce by mohl být pøetlak. Kontaminace lahvièky nemusí být zøejmá na první pohled. Lahvièky, které vykazují poškození, by mìly být pøed naoèkováním vyøazeny. Ve výjimeèných pøípadech mùže pøi snímání zaklápìcího víèka nebo pøi manipulaci dojít k prasknutí sklenìné lahvièky nebo ke zlomení krèku. Ve výjimeèných pøípadech mùže také dojít k nedostateènému uzavøení lahvièky. V obou pøípadech mùže obsah lahvièek vytéci, zejména pokud dojde k pøevrácení lahvièky. Dojde-li po inokulaci lahvièky k úniku nebo rozlití jejího obsahu, postupujte opatrnì, protože se zde mohou nacházet patogenní organismy nebo látky. Pøed likvidací všechny inokulované lahvièky sterilizujte v autoklávu. Možný únik bìhem inokulace vzorkù do kultivaèních lahvièek lze minimalizovat pomocí injekèních støíkaèek s trvale nasazenými jehlami nebo hroty Luer-Lok. Kontaminace Bìhem odbìru a inokulace do lahvièky BACTEC nesmí dojít ke kontaminaci vzorku. Výsledkem kontaminovaného vzorku bude pozitivní odeèet, který však nebude relevantním klinickým výsledkem. Taková kontaminace mùže být dùsledkem nesprávné údržby jehel a hadièek BACTEC, špatného oèištìní víèka nebo špatné funkce jednotky pro zahøívání jehel BACTEC (viz návod k obsluze a údržbe systému). Rozhodnutí musí uèinit uživatel v závislosti na takových faktorech, jako je typ získaných organismù, výskyt téhož organismu ve více kulturách, anamnéza pacienta, odpovídající kontroly vybavení atd. Pokyny ke skladování Kultivaèní lahvièky BACTEC pro testovací médium PZA by mìly být skladovány na chladném (2 25 C) a suchém místì. Datum Použít do napište na vnìjší stranu každého balení a použijte nejprve nejstarší zásoby. Je dobrým zvykem skladovat radioaktivní materiál oddìlenì v pracovnì pøístupné pouze oprávnìnému personálu. Pracovna by mìla být oznaèena slovy Pozor: Radioaktivní materiály. Nevystavujte médium pøímému jasnému svìtlu. Pokaždé nejprve otestujte každou lahvièku na pøístroji BACTEC 460TB kvùli potvrzení 5 10% atmosféry CO 2 v lahvièce a vylouèení lahvièek s vysokým odeètem pozadí. Pokud pøi poèáteèním screeningu èiní odeèet rùstového indexu (GI) lahvièky 20 nebo více, vyøaïte ji. PØÍPRAVA VZORKU Izolované, èisté kultury M. tuberculosis by mìly být èerstvì pìstovány v médiu BACTEC 12B a mìly by být použity pro tento test, když jsou ve fázi aktivního rùstu. Nepoužívejte staré zmrazené kultury nebo kultury, které pøi odeètu vykazovaly nejvyšší rùstový index po více než jeden den. POSTUP Dodané materiály Testovací médium BACTEC PZA Potøebný materiál, který není souèástí dodávky Sada s lécivem PZA a redicím roztokem BACTEC (50 testù) Médium BACTEC 12B Pøístroj BACTEC 460TB Tuberkulinová støíkaèka s trvale nasazenou jehlou Støíkaèka 5 ml Dezinfekèní roztok 70% izopropylalkohol Pøíprava léèebného média } Viz èást Dostupnost. a. Lyofilizovaná látka PZA je dodávána oddìlenì spolu se speciálním øedicím roztokem PZA (RF). b. Oèistìte horní èást lahvièky tampónem napuštìným alkoholem. Asepticky pøidejte støíkaèkou do lahvièky s lyofilizovaným PZA 5 ml øedicího roztoku. Dobøe promíchejte. Po úplném rozpuštìní poskytne tento zásobní roztok µg PZA/mL. c. Pøed inokulací, po oèištìní horní èásti lahvièky tampónem s alkoholem pøidejte pomocí 1 ml støíkaèky do každé lahvièky pro médium PZA 0,1 ml zásobního roztoku PZA. Výsledná koncentrace PZA je 100 µg PZA/mL média. Bezpeènostní opatøení: Nepøipravujte PZA pomocí vody nebo jiného než urèeného øedicího roztoku. Objem øedicího roztoku v lahvièce se mùže rùznit. Pøi pøípravì prášku PZA odmìøte pøesnì 5 ml z dodávané lahvièky. Pøidání správného množství testované látky do média má pro provedení testu citlivosti zásadní význam. Pøidejte pøesnì 0,1 ml zásobního roztoku pomocí 1mL tuberkulinové støíkaèky. Pøíprava kontroly Testovací médium bez jakéhokoli léèiva slouží ke kontrole. Pøed inokulací kultury pøidejte 0,1 ml øedicího roztoku do kontrolní lahvièky. Øedicí roztok obsahuje substanci podporující rùst - steran polyoxyetylnatý (POES). Øedicí roztok musí být ve všech inokulovaných lahvièkách. Pøíprava inokula K provedení tohoto testu by mìly být použity pouze aktivnì rostoucí kultury. Nepoužívejte pøerostlé kultury, uskladnìné kultury nebo kultury vyrostlé v jiných médiích. a. Testovaná kultura by mìla být subkultivována do lahvièky s médiem BACTEC 12B (katalogové èíslo ), doplnìné 0,1 ml øedicího roztoku na lahvièku. b. Inkubujte pøi 37 C ±1 C a testujte lahvièku dennì na pøístroji BACTEC 460TB. c. Jakmile denní rùstový index dosáhne hodnoty , použijte lahvièku k inokulaci pøi testu citlivosti.

3 d. Pokud je hodnota rùstového indexu vyšší než , pøidejte do výchozí rùstové lahvièky èerstvé médium 12B podle níže uvedené tabulky. Pokud bylo použito øedìní, zaznamenejte použité øedìní pro budoucí potøeby. GI : Žádné øedìní GI : Pøidejte 1,0 ml média 12B GI : Pøidejte 1,5 ml média 12B GI : Pøidejte 2,0 ml média 12B GI : Pøidejte 2,5 ml média 12B GI : Pøidejte 3,5 ml média 12B Pøed použitím dùkladnì promíchejte. Nikdy nepoužívejte lahvièky s odeètem 999, u nichž byla zaznamenána nejvyšší hodnota rùstového indexu. Inokulace u testu a. Pøed zavedením støíkaèky oèistìte horní èást u všech kultivaèních lahvièek tampónem se 70% alkoholem. b. Smíchejte øádnì testovací kulturu v médiu 12B pomocí 1,0 ml tuberkulinové støíkaèky s trvale nasazenou jehlou. c. Pøidejte 0,1 ml tohoto inokula do kontrolní lahvièky a lahvièky PZA. Na rozdíl od doporuèení pro jiné látky (napø. isoniazid, streptomycin, etambutol, rifampin atd.). KONTROLNÍ KULTURU NEØEÏTE. d. Dezinfikujte horní èást gumového víèka vhodným dezinfekèním prostøedkem a potom jej oèistìte tampónem napuštìným 70% alkoholem. POZNÁMKA: Pøi manipulaci s lahvièkami bìhem provádìní testu postupujte opatrnì. Víèko lahvièky mùže být kontaminováno kultivovanými organismy. Inkubace a testování a. Všechny inokulované lahvièky (vèetnì kontrolních lahvièek) by mìly být otestovány na pøístroji BACTEC 460TB kvùli zajištìní 5% atmosféry CO 2 ještì pøed inkubací. Pokud to však nebylo uèinìno døíve, lze lahvièky otestovat bezprostøednì po inokulaci. b. Inkubujte pøi 37 C ± 1 C. c. Lahvièky PZA a kontrolní lahvièky testujte dennì na pøístroji BACTEC 460TB, dokud rùstový index kontrolní lahvièky nedosáhne hodnoty 200 nebo více. Kontrola kvality Po uplynutí data expirace lahvièky NEPOUŽÍVEJTE. Nepoužívejte lahvièky, které vykazují praskliny nebo defekty. Lahvièky zlikvidujte odpovídajícím zpùsobem. Informace o kontrole kvality u pøístroje BACTEC 460TB naleznete v návodu k obsluze a údržbì systému BACTEC 460TB a 460. Podobnì jako u jiných testù citlivosti na léèiva má i zde kvalita inokula zásadní význam. Používejte pouze aktivnì rostoucí kultury v médiu 12B s pøíslušným øedìním. Za ideálních podmínek by mìla být u kontrolních lahvièek odeètena hodnota rùstového indexu 200 do 4 až 7 dnù. Pokud je hodnoty rùstového indexu 200 dosaženo u kontrolních lahvièek za ménì než 4 dny, svìdèí to o tom, že inokulum bylo pøíliš husté. Pokud výsledky nejsou jednoznaèné, test je tøeba opakovat. Jestliže je u kontrolních lahvièek dosaženo hodnoty rùstového indexu 200 za více než 7-10 dní, ukazuje to na špatnou kvalitu inokula (tzn. jeho nízkou životnost, nízký poèáteèní odeèet rùstového indexu inokula nebo nedostateèné zøedìní). Výsledky mohou být chybné. Rùstový index u kontrolních lahvièek i lahvièek s léèivem by mìl být peèlivì sledován, dokud není dosaženo jasných výsledkù. Pokud se objeví pochybnosti, test zopakujte. Pokud se hodnota rùstového indexu v lahvièce s léèivem blíží 10% rùstového indexu u kontrolní lahvièky, testujte lahvièky další 1-3 dny. Tento postup vám pomùže posoudit vzorec citlivosti u testované kultury. Jestliže výsledky nelze interpretovat, zopakujte test s mikroorganismem propagovaným v èisté kultuøe vyrostlé v èerstvém médiu BACTEC 12B (katalogové èíslo ). Vždy použijte H37Rv (ATCC 27294) jako kontrolu citlivosti a H37Rv PZA-R (ATCC 35828) jako kontrolu rezistence. Požadavky na kontrolu kvality musí být splnìny v souladu s platnými místními, státními a federálními zákony a požadavky na akreditaci a se standardními postupy kontroly kvality vaší laboratoøe. Doporuèujeme, aby si uživatel prostudoval informace o správném provádìní kontroly kvality v pøíslušných smìrnicích NCCLS a pøedpisech CLIA. INTERPRETACE VÝSLEDKÙ Pøístroj odeèítá pøímo na stupnici rùstového indexu hodnoty Rùstový index pøedstavuje míru metabolické aktivity organismu v médiu. Když rùstový index u kontrolní lahvièky dosáhne hodnoty 200 nebo více, interpretujte výsledky následujícím zpùsobem: GI v lahvièce s látkou je < 9% GI v kontrolní lahvièce = citlivý GI v lahvièce s látkou je > 11% GI v kontrolní lahvièce = rezistentní GI v lahvièce s látkou je mezi 9% a 11% (vèetnì) GI v kontrolní lahvièce = hranièní OMEZENÍ POSTUPU Hodnota rùstového indexu odráží míru a množství rùstu, který se objeví v médiu, ale nelze ji použít ke kvantifikaci vytváøení jednotek kolonií na ml. Morfologii kolonií a charakteristiku pigmentace lze stanovit pouze na pevných médiích. Vyøazení pøibližnì 10% lze použít jako pøibližné stanovení rezistence nebo citlivosti založené na zjištìní hodnoty rùstového indexu. Test citlivosti BACTEC PZA se doporuèuje pouze pro komplex mikroorganismù M. tuberculosis propagovaných v èisté kultuøe. Užiteènost PZA nebo metody testování citlivosti u jiných než tuberkulózních mykobakterií (MOTT) není známa. OÈEKÁVANÉ HODNOTY Rùstový index u kontrolní lahvièky by se mìl postupnì zvyšovat. V testovací lahvièce mùže hodnota rùstového indexu zùstat stejná, nebo se mùže zvýšit èi snížit v závislosti na citlivosti testovaného organismu (viz pøíklady 1 a 2). Obvykle lze výsledky BACTEC získat za 4 až 7 dnù. Pomalu rostoucí kultury mohou obèas vyžadovat delší dobu. Nevyhodnocujte výsledky døíve než za 4 dny nebo pozdìji než za 21 dnù.

4 Pøíklad è. 1: Citlivost na PZA Denní odeèty GI Látka GI GI kontrola % Výsledky: Kontrolní x 100 = 0,8% Citlivé vzorek < 9% 475 Pøíklad è. 2: Rezistence na PZA denní odeèty rùstového indexu Denní odeèty GI Látka GI GI kontrola % Výsledky: Kontrolní x 100 = 86,5% Resistentní vzorek > 11% 282 CHARAKTERISTIKA VÝKONNOSTI Radiometrická technika BACTEC 460TB, založená na modifikovaném médiu 7H12 o ph 6,0, je doposud jedinou metodou založenou na kultuøe pro testování citlivosti na PZA, která je doporuèena Národní komisí pro klinické laboratorní standardy (NCCLS). 14,15 Ve studii, kterou uskuteènili Pfyffer et al., byla výsledkem testování citlivosti M. tuberculosis na PZA více než 96% shoda ve srovnání s médiem a léèiva BACTEC 460TB PZA a médiem a léèivem BACTEC MGIT 960 PZA. Støední doba obìhu èinila u testu BACTEC 460TB PZA 5,4 dní, pøièemž nezahrnovala èas požadovaný k získání radiometrické subkultury s hodnotou rùstového indexu (GI) Dostupnost Katalog. èíslo Popis Kultivaèní lahvièky s testovacím médiem BACTEC PZA, 4 ml, ctn Léèivo BACTEC PZA/sada s øedicím roztokem (50 testù) Médium BACTEC 12B Pøístroj BACTEC 460TB LITERATURA 1. Gross, W. M. and J.L. Hawkins, Radiometric selective inhibition test for differentiation of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacteria bovis, and other mycobacteria. J. Clin. Microbiol., 21: Middlebrook, G. et al Automatable radiometric detection of growth of Mycobacterium tuberculosis in selective media. Amer. Rev. Resp. Dis. 115: Roberts, G.D. et al. Evaluation of the BACTEC radiometric method for recover of mycobacteria and drug susceptibility testing of M. tuberculosis from acid-fast smear positive specimens. J. Clin. Microbiol. 18: Siddiqi, S.H. et al Evaluation of a rapid radiometric method for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 13: Butler, W.R. and J.O. Kiburn Improved method for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide. J. Clin. Microbiol. 16: Heifets, L.B. and M. D. Iseman, Radiometric method for testing susceptibility of mycobacteria to pyrazinamide in 7H12 broth. J. Clin. Microbiol. 21: Woodley, C.L. and R. W. Smithwick, Radiometric method for pyrazinamide susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in egg yolk enriched BACTEC 12B medium. Antimicrob. Agents Chemother. 32: Salfinger, M. and L. Heifets, Determination of pyrazinamide MICs for Mycobacterium tuberculosis at different ph s by the radiometric method. Antimicrob. Agents Chemother. 32: Salfinger, M. et al Rapid radiometric method for pyrazinamide susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Res. Microbiol. 140: National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, PA. 11. Garner, J.S Hospital Infection control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17: U.S. Department of Health and Human Services Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 13. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p Pfyffer, G.E., F. Palicova and S. Rüsch-Gerdes Testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide with the nonradiometric BACTEC MGIT 960 System. J. Clin. Microbiol. 40: National Committee for Clinical Laboratory Standards Tentative standard M24-T2. Susceptibility testing of mycobacteria, nocardia and other aerobic actinomycetes, 2nd ed. NCCLS, Wayne, PA.

5

6 Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, Maryland USA BENEX Limited Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Shannon, County Clare, Ireland Tel: Fax: ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BD, BD Logo, BACTEC, Luer-Lok and MGIT are trademarks of Becton, Dickinson and Company BD.