Expresní systémy a klonovací strategie

Transkript

1 Expresní systémy a klonovací strategie živé systémy využívající rekombinantních DNA technologií pro produkci bioorganických látek (především proteinů)

2 Heterologní expresní systémy Bakteriální Kvasinkové Hmyzí buňky Savčí buňky Transgenní rostliny

3 charakteristika E. coli kvasinky hmyzí buňky savčí buňky rostlinné b. buněčný růst rapidní (30min) rapidní (90min) pomalý (18-24h) pomalý (24 h) pomalý požadavky na růstové medium minimální minimální komplexní medium komplexní medium minimální cena růstového media nízká nízká vysoká vysoká nízká množství exprimovaného proteinu velké malé až velké malé až velké malé nebo střední malé extracelulární exprese sekrece do inkl. tělísek sekrece do media sekrece do media sekrece do media sekrece do media posttranslační modifikace skládání proteinů obvykle nutné dodatečné složení v některých případech nutné dodatečné složení řádně složené proteiny řádně složené proteiny řádně složené proteiny O-glykosylace - vysoký obsah manosy jednoduché, bez sialové kyseliny komplexní komplexní N-glykosylace fosforylace acetylace acylace γ-karboxylace

4 Bakteriální expresní systémy Escherichia coli + rychlá produkce + nejvýkonnější (až 0.5 g na 1 litr kultury) + levné a jednoduché na manipulaci - chybí posttranslační úprava proteinů (neaktivní produkty eukaryotních genů) - přirozeně neprobíhá sekrece do média preferují jiný genetický kód než vyšší eukaryota

5 rekombinatní genetická informace je vklonována do vhodného expresního plasmidu, nedochází k integraci do genomu TA klonování Taq polymerasy bez 3-5 samoopravné aktivity přidávají na 3 konce datp

6 TA TOPO klonování linearizovaný vektor ošetřen DNA topoisomerasou I rychlá reakce bez účasti T4 DNA ligasy

7 rekombinační klonování místně specifický rekombinační systém bakteriofága lambda slouží k integraci do genomu hostitele (aktivuje lysogenní cyklus) attb x attp attl x attr ( x znamená rekombinaci). 250bp 25bp

8 Invitrogen dodává všechny typy vektorů kompatibilních pro rekombinantní klonování reakce trvá 1 hodinu při laboratorní teplotě zachovávání čtecích rámců (ORF), žádné složité plánování

9 přímá amplifikace s primery obsahující rekombinační sekvence: attb1 attb2 rekombinace do donorového vektoru: pentr a pdonr: pomocné vektory pdest: cílové vektory k použití

10 Klasické klonování do vstupního vektoru: pentr vektory udržované v E.coli kmen DB3.1 (mutovaná gyrasa tak, že je necitlivá na ccdb inhibici) po rekombinaci dvojitá selekce (1) na antibiotikum a (2) v sensitivním kmeni k ccdb nerostou nezrekombinované plasmidy 100% účinné není třeba selektovat pozitivní klony

11 rekombinační klonování rekombinace probíhá v obou směrech a je katalýzována proteiny z λdna i bakteriálními. selekce antibiotikum a gen ccdb mezi rekombinantními místy, protein ccdb inhibuje bakteriální DNA gyrasu a způsobuje smrt buněk nesoucí prázdný vektor vstupní vektor destinační vektor

12 LR reakce se účastní integrasa a ekscionasa (αdna) a IHF (integration host factor) z bakterie BP reakce se účastní IHF a integrasa rekombinační klonování

13 GIBSONOVO KLONOVÁNÍ účinnou a jednoduchá metoda klonování v rámci jedné reakce za použití tří různých enzymů (T5 exonucleasa, T4 DNA ligasa, Pfu DNA polymerasa můžeme najednou pospojovat několik dvouřetězcových fragmentů DNA v jeden úsek.

14 Kvasinkové rekombinační klonování Kvasinka upravená tak aby měla robustní systém pro homologní rekombinace Segmenty, které chceme spojit jsou PCR amplifikovány s bp přesahy homologními k oblasti vektoru, kde proběhne rekombinace Vektor se linearizuje Všechny fragmenty se transformují do kvasinky, kde spontánně mezi fragmenty proběhne homologní rekombinace a ty se pospojují

15 N-terminal 6xHis tag umožňuje velice účinnou purifikaci proteinu pomocí metal-chelatační chromatografie popř. detekci pomocí Anti-HisG protilátky T7 promotor přesná a silná exprese heterologního proteinu Ribosome binding site Shine-Dalgarnova sekvence, vazba malé ribozomální podjednotky, rozpoznání správného ATG TA TOPO klonovací místo pro PCR produkt Xpress epitop (Asp-Leu-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp- Lys) umožňuje detekci fúzního proteinu pomocí Anti-Xpress protilátky EK rozpoznávací sekvence pro specifickou enterokinasu, odštěpuje His-tag T7 transcription termination region silný terminační systém T7 bacteriofága gen pro rezistenci k ampicilinu umožňuje selekci plasmidu v E. coli puc origin zajišťuje vysokou replikaci plasmidu a růst E. coli

16 exprimovaný protein signální peptid exprimovaný protein reverse primertag V5 epitop his tag ATGforward primer detekce izolace his tag x-press signální peptid exprimovaný protein reverse primertag izolace detekce forward primer

17 usnadnění izolace rekombinantního proteinu koncové značky nejpoužívanější N a C-terminální značky (tagy): His-tag pro metal chelatační chromatografii (Ni) FLAG epitope - tag DYKDDDDK (Sigma; specifická protilátka) CBP - calmodulin binding peptide (26 AK) CBD - cellulose binding domain

18 izolace proteinu z bakteriální kultury: pokud není protein ukládán do inkluzních tělísek, rozbití buněk tepelným šokem, případně sonifikací nebo lysozymem pokud je ukládán do inkluzních tělísek, oddělení nerozpustné frakce a denaturace 9M močovinou nebo guanidium chloridem poté je nutno protein renaturovat - SLOŽITÉ!!!! marker IB 1M 0.5mM imidazol 200mM 100mM wash II wash I IB bakt.extrakt

19 tagy založené na sacharid-vazebných proteinech MBP - maltosa binding protein - amylosa CBP - intein chitin binding protein - chitin

20 Mechanismus štěpení inteinu Intein má transpeptidazovou aktivitu, která katalyzuje vznik amidové vazby mezi volnou aminoskupinou a karbonylovou skupinou, v rámci již existující peptidové vazby

21 Který kmen E.coli zvolit? tona mutace chrání bakterii před napadením T1 a T5 fágem, chrání tak vaše klony lacz.m15 částečná delece wild-typového lacz genu, po vložení plasmidu dochází k tzv.α- komplementaci potřebné pro blue/white screening na miskách s X-gal enda1 deficience endonukleasy I zaručuje kvalitní izolaci plasmidové DNA laciq produkuje lacz represor negativně regulující transkripci z lacz promotoru; zrušení přídavkem IPTG mcra, mcrbc, a mrr mutace v těchto genech zaručuje možnost klonování i methylované genomové DNA reca1 zabraňuje rekombinaci mezi plasmidovou a bakteriální DNA F episom je potřebný pro produkci ssdna kóduje protein tvořící tzv pilus na vnější membráně E.coli

22 kmen mutace účel firma BL21(DE3) BL21 (DE3) plyss BL21 Star (DE3) deficientní na proteasy deficientní na proteasy, exprese lysozymu RNaseE mutant obecná exprese přesně řízená exprese exprese s redukovanou degradací RNA DB3.1 gyra462 alela propagace GATEWAY vektorů s toxickým genem ccdb DH5λ první laboratorní kmen propagace plasmidu, klonování Origami (DE3) trxb a gor mutant exprese, tvoří disulfidické můstky v cytoplasmě Rosetta Nejpoužívanější laboratorní kmeny E.coli Geny pro argu, argw, glyt, IleX, leuw, mett, prol, thrt, thru, and tyru exprese eukaryotních genů Stratagene Novagen Invitrogen Invitrogen Life Technologies Novagen Novagen Top10 ara mutant propagace plasmidu, klonování Invitrogen

23 regulace exprese pod T7 promotorem exprese naklonovaného genu je kontrolována velice silným promotorem z bakteriofága T7, který původně řídí expresi genu 10 pro obalový protein pro expresi je nutno dodat do hostitelským buněk T7 RNA polymerasu a to buď infekcí bakteriofágem, nebo její indukovanou expresi. v sytému pcr T7 TOPO TA Expression je exprese T7 RNA polymerasy indukována lacz promotorem pomocí IPTG a tento systém je uložen v genomu hostitelských buněk

24 kmeny E.coli vhodné pro expresi - BL21(DE3) nebo BL21(DE3)LysS

25 před indukci IPTG probíhá bazální exprese T7 RNA polymerasy, pokud je exprimovaný produkt toxický pro bakterii, nedojde k selekci, selektují se pouze mutované klony, které neprodukují rekombinantní protein kmen E.coli BL21(DE3) nese v genomu T7 RNA polymerasový gen pod lacz promotorem, tento konstrukt je vložen do genu pro integrasu, jehož inaktivaci se zabrání lyzi, vyštěpení fágové částice v nepřítomnosti pomocného fága. Přirozený lac represor, jehož gen je taktéž vložený genomu bakterie, brání expresi bez přítomnosti induktoru (IPTG) někdy ovšem i přesto dochází k bazální expresi T7 RNA polymerasy a pokud je pod T7 promotor vložen gen produkující toxický produkt pro E.coli může docházet k redukci růstu, smrti baktérie či nestabilitě plasmidu. Kmen BL21(DE3)LysS navíc obsahuje T7 lysozym (produkovaný genem LysS), uložený na speciálním vektoru s nízkou expresí a nezávislou selekci na chloramfenikol. T7 lysozym je schopen se vázat na T7 RNA polymerasu a inhibovat bazální transkripci, exprese indukovaná IPTG je daleko silnější a T7 RNA polymerasa se dostane z této inhibice T7 lysozym je bifunkční enzym, který má navíc vlastní lytickou funkci, naštěpuje bakteriální peptidoglykanovou stěnu a usnadňuje tak následnou izolaci exprimovaného proteinu.

26 Jaké geny lze v E.coli exprimovat? většinu z prokaryotických organismů eukaryotní geny jejichž produkty nepodléhají posttranslačním modifikacím většina cytosolárních proteinů (není glykosylovaná) geny kódované chloroplastovou nebo mitochondriální DNA (podobný genetický kód, evoluční příbuznost) všechny geny jejichž produkty nepotřebujeme v aktivní formě

27 stabilizace exprimovaného proteinu 2004 SUMO peptide Small Ubiquitin like MOdifier ochrana před proteolýzou zvyšování rozpustnosti proteinu zvyšuje množství exprimovaného proteinu Sumo proteasa

28 Bacillus subtilis alternativní prokaryotické expresní systémy gram pozitivní půdní baktérie není lidský patogen má vyvinutý sekreční systém neprodukuje žádné endotoxiny (rek. proteiny se dají využít v medicíně) využití pro průmyslovou produkci proteas (prací prášky) a amylas (sladovnictví) a hlavně průmyslově nejdůležitější zdroj kyseliny hyaluronové (polysacharid)

29 kvasinkové expresní systémy jednoduchá a levná exprese v eukaryotním organismu rychlá propagace a jednoduchá média jednoduchá manipulace s genem (klonovací systémy kompatibilní s bakteriálními, shuttle vektor) většinou lze produkovat nativní proteiny z vyšších eukaryot (správná posttranslační modifikace glykosylace, folding) jednoduchý a prozkoumaný systém pro sekreční expresi do média hostitelské organismy: Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Pichia pastoris Kluyveromyces lactis Yarrowia lipolytica

30 Saccharomyces cerevisiae (od 1979) SHUTTLE VEKTOR GAL1 promotor zajišťuje induktivní expresi vloženého genu T7 promotor/priming site umožňuje in vitro transkripci a sekvenaci inzertu T7 priming site Multiple cloning site má 9 jedinečných klonovacích míst CYC1 terminátor transkripce, stabilizuje mrna transkript pmb1 origin (puc-derived) udržuje high copy replikaci v E. coli Ampicillin resistance gene selekce v bakterii URA3 selekce kvasinek v uracil-deficientním médiu 2 μ origin udržování replikace v kvasince f1 origin produkce single-stranded DNA

31 Saccharomyces cerevisiae REGULACE EXPRESE u kmene INVSc1 je transkripce z GAL1 promotoru inhibována přítomnosti glukosy v médiu transkripce je indukována odstraněním glukosy a přidáním galaktosy jako zdroje uhlíku do média alternativně se může kvasinková kultura propagovat v médiu obsahující rafinosu, která neinhibuje ani neindukuje galaktosový promotor a transkripce se spustí pouze přídavkem galaktosy, bez nutnosti odstraňování rafinosy HOSTITELSKÉ BUŇKY A) standardní kmen E. coli např. TOP10F který slouží pro namnožení plasmidu, jeho udržování a manipulaci s ním. B) kmen S.cerevisiae INVSc1 Genotyp: MATa his3 D1 leu2 trp1-289 ura3-52/mata his3 D1 leu2 trp1-289 ura3-52 Fenotyp: His-, Leu-, Trp-, Ura- INVSc1 je diploidní kmen autotrofní na histidin, leucin, tryptofan, a uracyl.

32 Saccharomyces cerevisiae N-a O-glykosylace se u kvasinek liší od vyšších eukaryot a způsobuje tvorbu neaktivního heterologního proteinu např. kvasinky preferuji glykosylaci manosou na zbytky asparaginu zatímco vyšší eukaryota preferuji N-glykosylaci sialovou kyselinou a N-acetylglucosaminem tyto rozdíly mohou způsobovat špatný folding, nestabilitu či jinou imunogenicitu od původních proteinů O-glykosylace většinou probíhá bez problému SEKRECE HETEROLOGNÍHO PROTEINU V KVASINKÁCH sekrece proteinu v kvasinkách je komplexní proces a není zde obecně akceptovaný sekreční signální peptid některé heterologní jsou sekretovány úspěšně pod svým vlastním signálem často se k heterolognímu proteinu přidává kvasinkový sekreční signál odvozený od S.cerevisae genů pro invertasu (SUC2), kyselou fosfatasu (PHO5) nebo alfa-faktor (MFa1) POSTRANSLAČNÍ ÚPRAVY HETEROLOGNÍHO PROTEINU problémy mohou nastat u složitějších proteinů s jejich fosforylaci, acetylaci, methylaci, miristylaci a isoprenylaci problém jsou nejčastěji kvasinkové endoproteasy, které rády napadají exprimované cizí proteiny

33 N-glycosylation in different organisms

34

35 Pichia pastoris v ideálních případech poskytuje 10 až 100 krát vyšší výtěžky než klasická Saccharomyces klonování a manipulace s Pichii je velmi obdobná jako pro Saccharomyces selekce zeocin nebo nutriční autotrofie Pichia přirozeně sekretuje daleko méně vlastních proteinů než Saccharomyces - zjednodušuje izolací rekombinantního proteinu Pichia pastoris je methylotrofní organismus tzn. jako zdroj uhlíků využívá metanol nejdříve ho oxiduje na formaldehyd (dva geny pro alkoholdehydrogenasu) za přítomností kyslíku, proces probíhá v peroxizomech jelikož vzniká toxický peroxid vodíku. Kvasinková AOX má velice slabou afinitu ke kyslíku a proto je AOX exprimováná ve velice velkém množství (5% veškeré mrna). toho využívá heterologní expresní systém, kdy je transgen vložen pod AOX promotor.

36 Pichia pastoris HIS4 selekce v Pichii ampicilinová selekce v bakterií AOX1 promotor AOX1 TT terminátor pbr322 bakteriální počátek replikace S signální sekvence alfa faktoru 3 AOX1 3 UTR pro AOX gen místo pro homologní rekombinaci

37 Pichia pastoris

38 rekombinace a integrace v Pichia pastoris transformace lineární plasmidovou DNA vede k integraci do genomu kvasinky pomocí homologní rekombinace. transformanti vykazují vysokou stabilitu i bez selekčního tlaku integrace na AOX1 lokus gen narušen může nastat i mnohonásobná inzerce s pravděpodobností 1-10% jednoduché inzerce

39 rekombinace a integrace v Pichia pastoris

40 MNOHONÁSOBNÁ REKOMBINACE A INTEGRACE v PICHII selekce na základě stupňující se koncentrace antibiotika v médiu je třeba otestovat stovky kolonií (1-10% účinnost)

41 různé typy selekce transformované Pichia pastoris ANTIBIOTIKA zeocin 50 μg μg /ml blasticidin Kanamycin/G418 G418 kanamycin nutriční autotrofie gen pro histidinol fosfatasu (his4) lepší pro udržování integrity transformanta při kultivacích ve velkých objemech (fermentace) narušení genu pro AOX1 způsobuje ztrátu aktivity alkohol dehydrogenasy a kvasinka získává MutS fenotyp (methanol utilization slow). Je schopná zpracovávat metanol pouze AOX2 (která má daleko nižší aktivitu 5%) využívá se toho pro selekci integrantů po transformaci: ti co vyrostou daleko později než ti co mají v sobě cirkulární plasmid a nemají narušený gen pro AOX1

42 Pichia pastoris - glykosylace N-glykany mají vysoký obsah manosy

43 Yarrowia lipolytica je to lipofilní kvasinka, která spotřebovává jako zdroj uhlíku n-alkany a mastné kyseliny do prostředí sekretuje velké množství extraceluární proteasy (gen XPR2) promotor tohoto genu byl upraven, tak aby nebyl reprimován okolními vlivy hybridní promotor má 4x opakující se tandemové části z pxpr2 a vykazuje konstitutivní expresi za hybridní promotor je vložená signální sekvence proteasy XPR2 nebo sekretované lipasy klonovací místo SfiI a KpnI (XbaI)

44 Yarrowia lipolytica vektory jsou integrativní (rekombinatní DNA se zabudovává do genomu kvasinky) odvozené od základního plasmidu pbr322 pina1267 mono-integrativní (homologní rekombinace na Po1g lokus, který byl klonován do hostitelského kmene kvasinky do Leu2 genu, linearizace přes jedinečné NotI místo pina1294 mnohonásobná integrace, do vektoru vložená Ylt1 retraspozonová sekvence, která aktivuje nehomologní rekombinaci do genomu kvasinky hostitelský kmen má knockoutovány geny pro extracelulární proteasy do hostitelské Yarrowia je vložen gen Suc2 ze Saccharomyces který umožňuje růst nového kmenu na sacharóze (snadnější propagace)

45 exprese proteinů ve velkém měřítku: FERMENTORY regulace: teplota ph obsah kyslíku (případně jiných plynů) přesné dávkování

46 Heterologní exprese v Yarrowia lipolytica srovnání s ostatními heterologními systémy exprese kukuřičného enzymu cytokinin oxidasy/dehydrogenasy Escherichia coli (ptybii cytosolická exprese; protein fúzován s inteinem) ± 5 mg/litr média 3 dny Saccharomyces cerevicae (pyes2 sekrece do média) ± 2 μg/litr média Pichia pastoris pgapz (konstitutivní exprese) ±10 μg/litr média Pichia pastoris ppicz-α (signální peptid z kvasinky, inducibilní) 1 mg/litr média Yarrowia lipolytica pina1294 (signální peptid z kvasinky) 5mg/litr média přirozený zdroj kukuřice (purifikace) 2 μg/kg média kukuřičných zrn 2 měsíce 3 týdny 3 týdny 1 týden 3 měsíce

47 odchylky v genetickém kódu snižují výtěžek heterologní exprese výjímky: jiná preference: kodón pro arginin (6 různých): CGU CGA CGG CGC AGA AGG E. coli Arabidopsis th. H. sapiens AGA 2.2% AGA 18.9% AGA 11.9% AGG 1.6% AGG 11.0% AGG 12.1%

48 Optimalizace syntetického genu firmou Mr.GENE 1. Úprava kodonů 2. Vyvarování se terciárním strukturám mrna 3. Vyhledávání specifických motivů např. Shine-Dalgarnova sekvence 5'-AGGAGGU-3' polyadenylační signály

49 syntéza DNA FOSFORAMIDIT ochrana N-bází

50 Syntéza umělého genu