inženýrstv enýrství KBC/BAM - Pokročil

Transkript

1 Základy klonování a genového inženýrstv enýrství KBC/BAM - Pokročil ilé biochemické a biotechnologické metody

2 Molekulárn rní klonování: KLONOVÁNÍ multikrokový proces který vytvoří kolekci definovaných fragmentů dané DNA spojení vybraných DNA fragmentů (většinou jednoho genu) se speciáln lním nosičem vektor přenos vzniklého konstruktu do živých buněk k (často( baktérie) mnohonásobn sobné namnožen ení vložených DNA fragmentů replikaci v živé buňce DNA KLONY Buněč ěčné klonování: vytvářen ení geneticky identických buněk k (organismů) v živé přírodě přirozené: : kolonie baktérii řízkování rostlin jednovaječná dvojčata umělé

3 k4 Využit ití molekulárn rního klonování uchovávání, zmnožení a manipulace s genetickou informací (cdna a genomové knihovny) produkce proteinů pro různorodé využití vnášení nových či pozměněných genů do organismů (GMO, genová terapie) farmaceutika zemědělství základní výzkum průmysl medicína

4 Snímek 3 k4 retinis pigmentosa 5 milionu lidi na svete photoreceptor glycoprotein peripherin kokos;

5 Příprava knock-out out organismu inserční vektor substituční vektor pozitivní selekce na neomycin (gen M)

6 knockoutovaná myš gen jehož expresi chceme potlačit vyizolujeme a naklonujeme do inzertního vektoru gen inaktivujeme naklonováním selekčního markeru (gen rezistence k neomycinu) do jeho ORF transformujeme embryonální kmenové buňky a vyselektujeme je na neomycinu vyselektované buňky implantujeme do blastocysty a tu vložíme do hostitelské matky selektujeme potomstvo pomocí fenotypu (ztráta aktivity genu) inzerční vektor Exon 1 Exon 2 Exon 4 Exon 3 gen v genomu EKB homologní rekombinace a přerušení genu

7 knockoutovaná myš PROBLÉM TÉTO METODY JE VELKÁ FREKVENCE NESPECIFICKÉ REKOMBINACE (antibiotikum vyselektuje i tyto linie, které nemají přerušený gen) možnost: SUBSTITUČNÍ VEKTOR s negativní selekci do vektoru je vložená sekvence genu HSVtk (herpes simplex virus thymidin kinasa) mimo rekombinantní místa, pokud dojde k náhodné rekombinaci, přenese se do genomu EKB také tento gen selekce GANGCYKLOVIREM prekursor buněčného jedu, který vzniká aktivitou HSVtk náhodně rekombinované buňky po přídavku gangcykloviru umírají homologní rekombinace linearizovaný substituční vektor náhodná integrace Neo R Gene segment 1 Neo R Gene segment 2 HSVtk Neo R+ / HSVtk - Neo R+ / HSVtk +

8 ZINC FINGER NUCLEASES CÍLENÁ MANIPULACE V GENOMU příprava knockoutovaných linií organismů

9 PŘIROZENÁ REKOMBINACE oprava dvouřetězcových zlomů reakce na poškození DNA HR homologní rekombinace NHEJ nehomologní lepení konců

10 pg5 ZINC FINGER NUCLEASES chimerické proteiny vytvořené spojením Fok I nukleasy a specifických sekvencí zvaných zinkové prsty

11 Snímek 9 pg5 The enzyme FokI, naturally found in Flavobacterium okeanokoites, is a bacterial type IIS restriction endonuclease consisting of an N-terminal DNA-binding domain and a non-specific DNA cleavage domain at the C-terminal.[1] Once the protein is bound to duplex DNA via its DNA-binding domain at the 5'-GGATG-3': 5'-CATCC-3' recognition site, the DNA cleavage domain is activated and cleaves non-specifically between nine and 13 nucleotides downstream of the recognition site. galuszka;

12 ZINC FINGER NUCLEASES

13 Testování specifity ZFN

14 pg6 pg7 Knock-out genu pomocí ZFN Shukla et al (2009): Precise genome modification in the crop species using ZFN. Nature 459

15 Snímek 12 pg6 pg7 CCR5 - chemokinovy receptor klinicke testy 18 pacientu deletovany homozygot je immunni vuci AIDS galuszka; alela pouze u kavkazoidni rasy, zafixovala se zřejmě během morovych pandemii galuszka;

16 KLONOVACÍ VEKTORY A) Bakteriální a kvasinkové PLASMIDY přirozené součástí bakteriálních buněk nesoucí vlastní genetickou informaci ve formě dsdna (rezistence k antibiotikům, metabolismus nezvyklých substrátů apod.) 2-100kb replikují se nezávisle na baktérii vlastní plasmidové vektory vznikly úpravou přirozených pbr (Bolivar a Rodriguez) 4.36 kb menší než je přirozeně se vyskytující v E.coli oriv vlastní počátek replikace rezistence k Amp a Tc unikátní restrikční místa kapacita pro inzertovou DNA 1-55 kb ori

17 MCS (multiple( cloning site - polylinker) Unikátní synteticky vytvořená sekvence, obsahující za sebou jdoucí restrikční místa frekventovaných restrikčních endonukleas

18 počátek replikace oriv cca 300 bp kóduje sekvenci antisense RNA, která iniciuje DNA replikaci (slouží jako primer) regulace: high copy plasmid např. ColE1 vzájemná inkompatibilita

19 agarosová elektroforesa plasmidové DNA ccc covalently closed circle oc open circle genomická DNA oc forma plasmidu ccc forma plasmidu linearizovaný plasmid 8 kb 6 kb 4 kb 3 kb ccc oc

20 izolace plasmidové DNA metoda alkalické denaturace ccc plasmidová DNA je stabilnější v alkalickém ph linearní genomická DNA se při p ph denaturuje a pak při p i rychle neutralizaci precipituje v přítomnosti p SDS a neutralizaci octanem sodným se precipitují i proteiny a RNA

21 izolace plasmidové DNA pg4 Kolony s křemik emičitým itým nosičem nebo aktivními DEAE skupinami DEAE matrice křemičitá matrice + chaotropní sůl Výtěž ěžky: 1ml LB média m 10μg g DNA (high( high-copy plasmid) 1ml LB média m 0.5μg g DNA (low( low-copy plasmid)

22 Snímek 18 pg4 DEAE cistci pro transfekce chaotropni sul jsou obecně iontové sloučeniny, které snižují strukturovanost vody. Ve vodě v tekutém stavu totiž vznikají přechodně vodíkové můstky mezi kyslíkem a vodíkem sousedních molekul, takže je určitým způsobem "strukturovaná". V molekulární genetice je využíván fakt, že molekuly DNA v přítomnosti chaotropních solí adherují na SiO2, tedy obecně na skleněný povrch. ionty guanidinu. galuszka;

23 k8 KLONOVACÍ VEKTORY F) bakteriální - BAC umělé bakteriáln lní chromosomy (bacterial artificial chromosomes) odvozené od E.coli F-plasmidu (fertility plasmid), low copy 1-2 kopie na buňku VÝHODY oproti YAC: - stabilita (cirkulární) - snadná manipulace - potlačení rekombinace Vhodné fragmenty genomické DNA pro ligaci jsou získány pulsní gelovou elektroforesou INVITROGEN VELKÝ VÝZNAM PŘI MANIPULACI S CELÝMI GENOMY

24 Snímek 19 k8 par A B C dulezite pro rozdelovani do dcerinych bunek repe helikasa musi se rust v bakteriich s deletovanyma rekombinasama kokos;

25

26 SCREENING BACových knihoven pomocí 3D-poolování

27 Heterologní expresní systémy Bakteriáln lní Kvasinkové Hmyzí buňky Savčí buňky Transgenní rostliny

28 charakteristika E. coli kvasinky hmyzí buňky savčí buňky buněčný růst rapidní (30min) rapidní (90min) pomalý (18-24h) pomalý (24 h) požadavky na růstové medium minimální minimální komplexní medium komplexní medium cena růstového media nízká nízká vysoká vysoká množství exprimovaného proteinu velké malé až velké malé až velké malé nebo střední extracelulární exprese sekrece do inkluzních tělísek sekrece do media sekrece do media sekrece do media posttranslační modifikace skládání proteinů obvykle nutné dodatečné složení v některých případech nutné dodatečné složení řádně složené proteiny řádně složené proteiny N-glykosylace - vysoký obsah manosy jednoduché, bez sialové kyseliny komplexní O-glykosylace fosforylace acetylace acylace γ-karboxylace

29 rekombinatní genetická informace je vklonována na do vhodného expresního plasmidu,, nedochází k integraci do genomu TA klonování Taq polymerasy bez samoopravné aktivity přidp idávají na 3 konce 3 datp

30 pg8 TA TOPO klonování linearizovaný vektor ošetřen DNA topoisomerasou I rychlá reakce bez účasti T4 DNA ligasy

31 Snímek 25 pg8 The key to TOPO cloning is the enzyme DNA topoisomerase I, which functions both as a restriction enzyme and as a ligase. Its biological role is to cleave and rejoin DNA during replication. Vaccinia virus topoisomerase I specifically recognizes the pentameric sequence 5 -(C/T)CCTT-3 and forms a covalent bond with the phosphate group attached to the 3 thymidine. It cleaves one DNA strand, enabling the DNA to unwind. The enzyme then relegates the ends of the cleaved strand and releases itself from the DNA. To harness the religating activity of topoisomerase, TOPO vectors are provided linearized with topoisomerase I covalently bound to each 3 phosphate galuszka;

32 rekombinační klonování místně specifický rekombinační systém bakteriofága lambda slouží k integraci do genomu hostitele (aktivuje lysogenní cyklus) attb x attp attl x attr ( x znamená rekombinaci).

33 rekombinační klonování rekombinace probíhá v obou směrech a je katalýz lýzována proteiny z λdna i bakteriáln lními. selekce antibiotikum a gen ccdb mezi rekombinantními mi místy, protein ccdb inhibuje bakteriáln lní DNA gyrasu a způsobuje smrt buněk k nesoucí prázdný vektor vstupní vektor destinační vektor

34 Invitrogen dodává všechny typy vektorů kompatibilních pro rekombinantní klonování reakce trvá 1 hodinu při p i laboratorní teplotě zachovávání čtecích ch rámcr mců (ORF), žádné složit ité plánov nování

35 Klasické klonování do vstupního vektoru: pentr vektory udržované v E.coli kmen DB3.1 (mutovaná gyrasa tak, že je necitlivá na ccdb inhibici) po rekombinaci dvojitá selekce (1) na antibiotikum a (2) v sensitivním kmeni k ccdb nerostou nezrekombinované plasmidy 100% účinné není třeba selektovat pozitivní klony

36 přímá amplifikace s primery obsahující rekombinační sekvence: attb1 attb2 rekombinace do donorového vektoru: pentr a pdonr: : pomocné vektory pdest: : cílovc lové vektory k použit ití

37 LR reakce se účastní integrasa a ekscionasa (αdna) a IHF (integration( host factor) ) z bakterie BP reakce se účastní IHF a integrasa rekombinační klonování

38 PG2 N-terminal 6xHis tag umožňuje velice účinnou purifikaci proteinu pomocí metal-chelatační chromatografie popř. detekci pomocí Anti-HisG protilátky EK rozpoznávací sekvence pro specifickou enterokinasu, odštěpuje His-tag T7 promotor přesná a silná exprese heterogenního proteinu Ribosome binding site TOPO klonovací místo pro PCR produkt Xpress epitop (Asp-Leu-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp- Lys) umožňuje detekci fúzního proteinu pomocí Anti-Xpress protilátky T7 transcription termination region silný terminační systém T7 bacteriofága gen pro rezistenci k ampicilinu umožňuje selekci plasmidu v E. coli puc origin zajišťuje vysokou replikaci plasmidu a růst E. coli C-terminal V5 epitope tag umožňuje detekci fúzního proteinu pomocí Anti-V5 protilátky

39 Snímek 32 PG2 T7 bakteriofág, nejsilnější známy promotor, T7 RNA polymerasa je v baktérii pod IPTG inducibilním promotorem galuszka;

40 exprimovaný protein signální peptid exprimovaný protein reverse primertag V5 epitop his tag ATGforward primer detekce izolace his tag x-press signální peptid exprimovaný protein reverse primertag izolace detekce forward primer

41 PG3 usnadnění izolace rekombinantního proteinu koncové značky nejpoužívanější N a C-terminální značky (tagy): His-tag pro metal chelatační chromatografii (Ni) FLAG epitope - tag DYKDDDDK (Sigma; specifická protilátka tka) CBP - calmodulin binding peptide (26 AK) CBD - cellulose binding domain

42 Snímek 34 PG3 FLAG hydrofilní epitop rozpoznatelný specifickou protilátkou celulosa váže aromatické residua AK galuszka;

43 izolace proteinu z bakteriáln lní kultury: pokud je protein ukládán do inkluzních tělisek, rozbití buněk tepelným šokem, případně sonifikací nebo lysozymem pokud je ukládán do inkluzních tělísek, oddělení nerozpustné frakce a denaturace 9M močovinou nebo guanidium chloridem poté je nutno protein renaturovat - SLOŽIT ITÉ!!!! marker IB 1M 0.5mM imidazol 200mM 100mM wash II wash I IB bakt.extrakt

44 k1 tagy založen ené na sacharid-vazebných proteinech k2 k3 MBP - maltosa binding protein - amylosa CBP - intein chitin binding protein - chitin

45 Snímek 36 k1 k2 inteiny - proteinové introny kokos; The most likely mutation is in the rop gene because rop mutants have increased plasmid copy number, and temperature sensitive mutations are most often due to changes in protein structure. An alternative explanation is that the mutation destablizes a stem-loop structure in the RNA which plays a role in regulation. (It is possible to obtain temperature sensitive mutations that decrease the stability of nucleic acid hybrids but, since most nucleic acid hybrids involve a considerable number of base pairs, a single nucleotide substitution is unlikely to have a substantial effect on the Tm of the hybrid. Furthermore, in this case the hybrid is between complementary strands so a nucleotide substitition would result in a different base pair at that position, not mispairing at that position.) kokos; k uvolneni represe az 1000 kopii kokos;

46 Který kmen E.coli zvolit? tona tona mutace chrání bakterii před napadením T1 a T5 fágem, chrání tak vaše klony lacz lacz.m15 částečná delece wild-typového lacz genu, po vložení plasmidu dochází k tzv.α- komplementaci potřebné pro blue/white screening na miskách s X-gal enda1 enda1 deficience endonukleasy I zaručuje kvalitní izolaci plasmidové DNA laciq laciq produkuje lacz represor negativně regulující transkripci z lacz promotoru; zrušení přídavkem IPTG mcra mcra, mcrbc mcrbc,, a mrr mutace v těchto genech zaručuje možnost klonování i methylované genomové DNA reca1 reca1 zabraňuje rekombinaci mezi plasmidovou a bakteriální DNA F episom je potřebný pro produkci ssdna kóduje protein tvořící tzv pilus na vnější membráně E.coli

47 Nejpoužívan vanější laboratorní kmeny E.coli kmen mutace účel firma BL21(DE3) deficientní na proteasy obecná exprese Stratagene BL21 (DE3) plyss deficientní na proteasy,, exprese lysosymu přesně řízená exprese Novagen BL21 Star (DE3) RNaseE mutant exprese s redukovanou degradací RNA Invitrogen DB3.1 gyra462 alela propagace GATEWAY vektorů s toxickým genem ccdb Invitrogen DH5λ první laboratorní kmen propagace plasmidu idu,, klonování. Life Technologies Origami (DE3) trxb a gor mutant exprese, tvoří disulfidické můstky v cytoplasmě Novagen Rosetta Geny pro argu, argw, glyt, IleX, leuw, mett, prol, thrt, thru, and tyru exprese eukaryotních genů Novagen Top10 ara mutant propagace plasmi midu,, klonování. Invitrogen

48 regulace exprese pod T7 promotorem exprese naklonovaného genu je kontrolována na velice silným promotorem z bakteriofága T7, který původnp vodně řídí expresi genu 10 pro obalový protein pro expresi je nutno dodat do hostitelským buněk k T7 RNA polymerasu a to buď infekcí bakteriofágem, nebo její indukovanou expresi. v sytému pcr T7 TOPO TA Expression je exprese T7 RNA polymerasy indukována na lacz promotorem pomocí IPTG a tento systém m je uložen v genomu hostitelských buněk

49 kmeny E.coli vhodné pro expresi - BL21(DE3) nebo BL21(DE3)LysS LysS

50 před indukci IPTG probíhá bazální exprese T7 RNA polymerasy, pokud je exprimovaný produkt toxický pro bakterii, nedojde k selekci, selektují se pouze mutované klony, které neprodukují rekombinantní protein kmen E.coli BL21(DE3) nese v genomu T7 RNA polymerasový gen pod lacz promotorem, tento konstrukt je vložen do genu pro integrasu, jehož inaktivaci se zabrání lyzi, vyštěpení fágové částice v nepřítomnosti pomocného fága. Přirozený lac represor, jehož gen je taktéž vložený do genomu bakterie, brání expresi bez přítomnosti induktoru (IPTG) někdy ovšem i přesto dochází k bazální expresi T7 RNA polymerasy a pokud je pod T7 promotor vložen gen produkující toxický produkt pro E.coli může docházet k redukci růstu, smrti baktérie či nestabilitě plasmidu. Kmen BL21(DE3)LysS LysS navíc obsahuje T7 lysozym (produkovaný genem LysS), uložený na speciálním vektoru s nízkou expresí a nezávislou selekci na chloramfenikol. T7 lysozym je schopen se vázat na T7 RNA polymerasu a inhibovat bazální transkripci, exprese indukovaná IPTG je daleko silnější a T7 RNA polymerasa se dostane z této inhibice T7 lysozym je bifunkční enzym, který má navíc vlastní lytickou funkci, naštěpuje bakteriální peptidoglykanovou stěnu a usnadňuje tak následnou izolaci exprimovaného proteinu.

51 Jaké geny lze v E.coli exprimovat? většinu z prokaryotických organismů eukaryotní geny jejichž produkty nepodléhaj hají posttranslačním modifikacím většina cytosolárn rních proteinů (není glykosylovaná) geny kódovank dované chloroplastovou nebo mitochondriáln lní DNA (podobný genetický kód, k evoluční příbuznost) všechny geny jejichž produkty nepotřebujeme ebujeme v aktivní formě

52 stabilizace exprimovaného proteinu 2004 SUMO peptide Small Ubiquitin like MOdifier ochrana před p proteolýzou zvyšov ování rozpustnosti proteinu zvyšuje množstv ství exprimovaného proteinu Sumo proteasa

53 kvasinkové expresní systémy jednoduchá a levná exprese v eukaryotním organismu rychlá propagace a jednoduchá média jednoduchá manipulace s genem (klonovací systémy kompatibilní s bakteriálními, shuttle vektor) většinou lze produkovat nativní proteiny z vyšších eukaryot (správná posttranslační modifikace glykosylace, folding) jednoduchý a prozkoumaný systém pro sekreční expresi do média hostitelské organismy: Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Pichia pastoris Hansela polymorpha Kluyveromyces lactis Yarrowia lipolytica

54 k9 k10 Saccharomyces cerevisiae (od 1979) SHUTTLE VEKTOR GAL1 promotor zajišťuje induktivní expresi vloženého genu T7 promotor/priming priming site umožňuje in vitro transkripci a sekvenaci inzertu Multiple cloning site má 9 jedinečných klonovacích míst CYC1 terminátor transkripce, stabilizuje mrna transkript pmb1 origin (puc-derived) udržuje high copy replikaci v E. coli Ampicillin resistance gene selekce v bakterii URA3 selekce kvasinek v uracil-deficientním médiu 2 μ origin udržování replikace v kvasince f1 origin produkce single-stranded DNA

55 Snímek 45 k9 k10 epimerasa galaktosy UDP-glucosa na UDP galaktosa kokos; CYC1 cytochrom c oxidase kokos;

56 Saccharomyces cerevisiae REGULACE EXPRESE u kmene INVSc1 je transkripce z GAL1 promotoru inhibována přítomnosti glukosy v médiu transkripce je indukována odstraněním glukosy a přidáním galaktosy jako zdroje uhlíku do média alternativně se může kvasinková kultura propagovat v médiu obsahující rafinosu, která neinhibuje ani neindukuje galaktosový promotor a transkripce se spustí pouze přídavkem galaktosy, bez nutnosti odstraňování rafinosy HOSTITELSKÉ BUŇKY A) standardní kmen E. coli např. TOP10F který slouží pro namnožení plasmidu, jeho udržování a manipulaci s ním. B) kmen S.cerevisiae INVSc1 Genotyp: MATa his3 D1 leu2 trp1-289 ura3-52/mata his3 D1 leu2 trp1-289 ura3-52 Fenotyp: His-, Leu-, Trp-, Ura- INVSc1 je diploidní kmen autotrofní na histidin, leucin, tryptofan, a uracyl.

57 Saccharomyces cerevisiae N-a O-glykosylace se u kvasinek liší od vyšších eukaryot a způsobuje tvorbu neaktivního heterologního proteinu např. kvasinky preferuji glykosylaci manosou na zbytky treoninu a serinu zatímco vyšší eukaryota preferuji O-glykosylaci sialovou kyselinou tyto rozdíly mohou způsobovat špatný folding, nestabilitu či jinou imunogenicitu od původních proteinů N-glykosylace většinou probíhá bez problému SEKRECE HETEROLOGNÍHO HO PROTEINU V KVASINKÁCH sekrece proteinu v kvasinkách je komplexní proces a není zde obecně akceptovaný sekreční signální peptid některé heterologní jsou sekretovány úspěšně pod svým vlastním signálem často se k heterolognímu proteinu přidává kvasinkový sekreční signál odvozený od S.cerevisae genů pro invertasu (SUC2), kyselou fosfatasu (PHO5) nebo alfa-faktor (MFa1) POSTRANSLAČNÍ ÚPRAVY HETEROLOGNÍHO HO PROTEINU problémy mohou nastat u složitějších proteinů s jejich fosforylací, acetylací, methylací, miristylací a isoprenylací problém jsou nejčastěji kvasinkové endoproteasy, které rády napadají exprimované cizí proteiny

58 g10 Pichia pastoris v ideálních případech poskytuje 10 až 100 krát vyšší výtěžky než klasická Saccharomyces klonování a manipulace s Pichii je velmi obdobná jako pro Saccharomyces selekce zeocin nebo nutriční autotrofie Pichia přirozeně sekretuje daleko méně vlastních proteinů než Saccharomyces - zjednodušuje izolací rekombinantního proteinu Pichia pastoris je methylotrofní organismus tzn. jako zdroj uhlíků využívá metanol nejdříve ho oxiduje na formaldehyd (dva geny pro alkoholdehydrogenasu) ) za přítomností kyslíku, ku, proces probíhá v peroxizomech jelikož vzniká toxický peroxid vodíku. Kvasinková AOX mám velice slabou afinitu ke kyslíku ku a proto je AOX exprimováná ve velice velkém m množstv ství (5% vešker keré mrna). toho využívá heterologní expresní systém, kdy je transgen vložen pod AOX promotor.

59 Snímek 48 g10 roste do vysoké density až sirupovitá galuszka;

60 Pichia pastoris HIS4 selekce v Pichii ampicilinová selekce v bakterií AOX1 promotor AOX1 terminátor pbr322 bakteriální počátek replikace f1 produkce ssdna S signální sekvence alfa faktoru 3 AOX1 ORF pro AOX gen místo pro homologní rekombinaci

61 Pichia pastoris

62 rekombinace a integrace v Pichia pastoris transformace lineární plasmidovou DNA vede k integraci do genomu kvasinky pomocí homologní rekombinace. transformanti vykazují vysokou stabilitu i bez selekčního tlaku integrace na AOX1 lokus gen narušen může nastat i mnohonásobná inzerce s pravděpodobností 1-10% jednoduché inzerce

63 rekombinace a integrace v Pichia pastoris

64 MNOHONÁSOBN SOBNÁ REKOMBINACE A INTEGRACE v PICHII selekce na základě stupňující se koncentrace antibiotika v médiu je třeba otestovat stovky kolonií (1-10% účinnost)

65 různé typy selekce transformované Pichia pastoris ANTIBIOTIKA zeocin 50 μg μg /ml blasticidin Kanamycin/G418 G418 kanamycin nutriční autotrofie gen pro histidinol fosfatasu (his4) lepší pro udržování integrity transformanta při kultivacích ve velkých objemech (fermentace) narušení genu pro AOX1 způsobuje ztrátu aktivity alkohol dehydrogenasy a kvasinka získává MutS fenotyp (methanol utilization slow). Je schopná zpracovávat metanol pouze AOX2 (která má daleko nižší aktivitu 5%) využívá se toho pro selekci integrantů po transformaci: ti co vyrostou daleko později než ti co mají v sobě cirkulární plasmid a nemají narušený gen pro AOX1

66 Pichia pastoris - glykosylace N-glykany mají vysoký obsah manosy

67 Yarrowia lipolytica je to lipofilní kvasinka, která spotřebovává jako zdroj uhlíku n-alkány a mastné kyseliny do prostředí sekretuje velké množství extraceluární proteasy (gen XPR2) promotor tohoto genu byl upraven, tak aby nebyl reprimovám okolními vlivy hybridní promotor má 4x opakující se tandemové části z pxpr2 a vykazuje konstitutivní expresi za hybridní promotor je vložená signální sekvence proteasy XPR2 nebo sekretované lipázy klonovací místo SfiI a KpnI (XbaI)

68 Yarrowia lipolytica vektory jsou integrativní (rekombinatní DNA se zabudovává do genomu kvasinky) odvozené od základního plasmidu pbr322 pina1267 mono-integrativní (homologní rekombinace na Po1g lokus, který byl klonován do hostitelského kmene kvasinky do Leu2 genu, linearizace přes jedinečné NotI místo pina1294 mnohonásobná integrace, do vektoru vložená Ylt1 retraspozonová sekvence, která aktivuje nehomologní rekobinaci do genomu kvasinky hostitelský kmen na knockoutovány geny pro extracelulární proteasy do hostitelské Yarrowia je vložen gen Suc2 ze Saccharomyces který umožňuje růst nového kmenu na sacharóze (snadnější propagace)

69 Heterologní exprese v Yarrowia lipolytica srovnání s ostatními heterologními systémy exprese kukuřičného enzymu cytokinin oxidasy/dehydrogenasy dehydrogenasy Escherichia coli (ptybii cytosolická exprese s protein fusován s inteinem) ± 5 mg/litr médiam 3 dny Saccharomyces cerevicae (pyes2 sekrece do média) ± 2 μg/litr médiam Pichia pastoris ppicz-a (přirozený signální peptid) ±10 μg/litr médiam Pichia pastoris ppicz-α (signální peptid z kvasinky) 1 mg/litr médiam Yarrowia lipolytica pina1294 (signální peptid z kvasinky) 5mg/litr médiam přirozený zdroj kukuřice (purifikace) 2 μg/kg média m kukuřičných zrn 2 měsícem 3 týdny 3 týdny 1 týden 3 měsícem

70 mutace místnm stně cílená (site-directed mutagenesis) gen, či sekvenci kterou budeme chtít mutovat, je třeba mít v libovolném vektoru navržení dvou reverzně komplementárních primerů, v místě kde chceme mutovat, nesoucí tuto mutaci vytváří se nové cirkulární DNA nesoucí mutaci, jsou k sobě komplementární a drží u sebe, mají přerušení v místě konce primerů (tzv. nick) ošetření restrikční endonukleasou DpnI (štěpí pouze methylovanou DNA, templátový plasmid) transformace do bakterie a namnožení mutovaného plasmidu 100% účinnost není třeba selekce mutovaný/nemutovaný

71 mutace místnm stně cílená (site-directed mutagenesis) origináln lní plasmid M G A L L W L původní sekvence 5 ATG GGA GCT CTA TTA ACC TTA 3 forward primer 3 TAC CCT CGA GAT AAT TCG AAT 5 reverse primer 5 ATG GGA GCT CTA TTA AGC TTA 3 M G A L L S L nastavení PCR s PfuTURBO Taq PCR s nízkým n počtem cyklů PfuTURBO termostabilní DNA polymerasa - nejmenší chybovost exonukleasová aktivita XL10-Gold kmen E.coli - nemá knockoutované metyltransferasy DpnI restrikce s DpnI transformace a namnožen ení

72 CÍLENÁ MUTACE KOZAKOVÁ SEKVENCE je důležitá pro efektivitu translace (umožňuje pevnou vazbu malé ribozomální podjednotky na mrna) u eukaryot. obratlovci Drosophila spp. Saccharomyces cerevisiae rostliny gccrccatgg caaaatg aaaaaaatgtct aacaatggc start codon Kozak seq. U A A A C A A U G G C U 60% 100% 70% AtCKX1 G U A G A A A U G G G A AtCKX2 A A A C A A A U G G C U HvCKX2 A G A G C C A U G A G G

73 syntéza genů na zakázku zku Minimum charge bp bp bp price/bp $159 $0.39/bp $0.39/bp $0.39/bp turnaround time 12 # 12 # 12 # 17 #

74 syntéza DNA FOSFORAMIDIT ochrana N-bázíN

75 Syntéza umělého genu

76 odchylky v genetickém m kóduk snižuj ují výtěž ěžek heterologní exprese výjimky: jiná preference: kodón pro arginin (6 různých): r CGU CGA CGG CGC AGA AGG E. coli Arabidopsis th. H. sapiens AGA 2.2% AGA 18.9% AGA 11.9% AGG 1.6% AGG 11.0% AGG 12.1%

77 Optimalizace syntetického genu firmou Mr.GENE 1. Úprava kodonů 2. Vyvarování se terciárním strukturám mrna 3. Vyhledávání specifických motivů např. Shine-Dalgarnova sekvence 5'-AGGAGGU-3' polyadenylační signály

78 NOVÉ METODY SEKVENCOVÁNÍ: Pyrosekvencování DNA polymerasa dntp mix ATP sulfurylasa Adenosine 5 fosfosulfát Luciferasa Luciferin Apyrasa

79 1. Izolace genomové DNA a restrikce na vhodné fragmenty ( bp) 2. Zatupení konců a navázání adaptorové sekvence s biotinovou značkou (modrá) ) a druhé bez (červen( ervená) 3. Navázání na kuličky ky se streptavidinem 4. Nanesení na mikroreaktorovou destičku 5. Provedení emulsního PCR (červený( a modrý primer) 6. Paralelní pyrosekvencování ve všech v jamkách

80 Roche 454/GS FLX Sequencing Technology

81 1. Illumina/Solexa 2. metoda cyklické reverzibilní terminace

82 Bridge PCR

83 cyklická reverzibilní terminace Chemické štěpení ve vodném prostřed edí za katalýzy paladiem DEALLYLACE

84 Illumina/Solexa - vyhodnocení

85 SROVNÁNÍ platforma Příprava templátu chemismus Délka jednoho čtení (bp) Doba běhu Přečtené Gb na jeden běh Cena přístroje (USD) Cena přečtení lidského genomu ROCHE 454 Fragmentace + emulsní PCR pyrosekvencování hod ILLUMINA SOLEXA Fragmentace + bridge PCR Cyklická reverzibilní terminace 35 9 dní ROCHE dlouhé běhy, lze dělat i de novo nekomplikované genomy (mikroorganismy + rychlé -- chyby v homopolymerních repeticích (AAAAAAAAA, GGGGGGGGGGG) ILLUMINA/ + nejpoužívanější SOLEXA + obrovský rozsah, resekvenace celého genomu v jednom běhu -- nízká multiplexita

86 ODSEKVENOVANÉ GENOMY

87 největší význam DIAGNOSTIKA zlevnit přesekvencování lidského genomu na USD (do roku 2015) (nové levnější přístupy: SOLID Applied Biosystems,, HELIOS) CANCER GENOME ATLAS TRANSCRIPTOME SEQUENCING (RNA-seq seq) výhoda oproti DNA čipům m je že e 100% postihuje alternativní sestřih a alelickou variabilitu SINGLE MOLECULE SEQUENCING (Helios( Helios) preinplantační diagnostika SOLID PHASE CAPTURE NimbleGene čip vyrobený pro vychytání kodujících ch sekvencí a regulačních oblastí z fragmentované genomické DNA před p vlastním vysokoúčinným sekvencováním