Autor prezentace: Doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D.

Transkript

1 k4 Konstrukce vhodného rekombinantního plasmidu pro uchování a expresi vybraných genů Škola molekulárních biotechnologií Využití molekulárního klonování uchovávání, zmnožení a manipulace s genetickou informací (cdna a genomové knihovny) produkce proteinů pro různorodé využití vnášení nových či pozměněných genů do organismů (GMO, genová terapie) Molekulární klonování: Snímek 3 k4 retinis pigmentosa 5 milionu lidi na svete photoreceptor glycoprotein peripherin kokos; KLONOVÁNÍ multikrokový proces který vytvoří kolekci definovaných fragmentů dané DNA spojení vybraných DNA fragmentů (většinou jednoho genu) se speciálním nosičem vektor přenos vzniklého konstruktu do živých buněk (často baktérie) mnohonásobné namnožení vložených ý DNA fragmentů replikaci v živé buňce DNA KLONY Buněčné klonování: vytváření geneticky identických buněk (organismů) v živé přírodě přirozené: kolonie baktérii řízkování rostlin jednovaječná j dvojčata umělé farmaceutika zemědělství základní výzkum průmysl medicína

2 tupé konce 5 přesahující konec 3 přesahující konec Existují RE se stejnou restrikční sekvencí lišící se pouze typem vzniklých konců (5 - či 3 - lepivé) KpnI vs. Asp718 - izoschizomery Lepivé konce: každý DNA fragment (jakéhokoli původu) tvoří štěpením stejnou RE dvě jednovláknové identické sekvence (čtené ve směru 5-3 ) ). Kompatibilní konce: RESTRIKČNÍ ENDONUKLEASY BamHI (restrikční enzymy II třídy) rozpoznávají specifické sekvence dsdna a štěpí ji ve stejném místě rozpoznávací místo je 4-8 bp dlouhé štěpí dlouhé fragmenty dsdna na kratší štěpí vždy znovu opakovatelným způsobem pocházejí především z bakterií ochrana před cizorodou DNA především bakteriofágovou modifikačně-restrikční enzymový systém (RE + specifická modifikační metylasa) Přes 120 rozpoznávacích míst dodnes popsaných více než 800 RE GˇGATCC GATCC BglII AˇGATCT EcoRI LEPiVÉ KONCE specifické spojení RESTRIKČNÍ MíSTA MAJÍ BOD SYMETRIE Existují RE se stejnou rozpoznávací sekvencí lišící se pouze typem vzniklých konců (5 - či 3 - lepivé) KpnI vs. Asp718 - izoschizomery Asp718 KpnI TAKTO VZNIKLÉ KONCE SE NEDAJÍ LIGOVAT! Existují různé RE které mají konce kompatibilní EcoRI vs. MfeI EcoRI MfeI RE mohou na DNA vytvářet TUPÉ nebo LEPIVÉ konce restrikční sekvence jsou většinou symetrické. nukleotidy vytvářejí PALINDROM Palindrom: sekvence se čte stejně v obou směrech jak ve 5 3 tak ve směru 5 3 na komplementárním řetězci. TUPÉ KONCE nespecifické spojení

3 dvě odlišné DNA mající stejné rozpoznávací místo pro danou RE se mohou vzájemně spojit v rekombinantní DNA molekulu rekombinantníní DNA molekula: je nová kombinace nukleotidů v DNA která se nevyskytuje volně v přírodě 3.4 kb KONTIGY parciální štěpení 3.5 kb 1.5 kb 6.5 kb 4.5 kb full digest partial digest Počet nukleotidů v restrikčním místě dané RE determinuje průměrnou délku fragmentů DNA získaných naštěpením danou RE jjj Pravděpodobnost že dané restrikční místo bude nalezeno v genomu: 1) 4 4 = 256 bp 2) 4 6 = 4096 bp 3) 4 8 = bp průměrná vzdálenost mezi restrikčními sekvencemi v DNA = 4 n n = # bází v restrikčním místě GTAC GAATCC GCGGCCGC Separace z gelu A klonování do vhodného vektoru (BAC) 15 kb kb 15 kb kb 8.0 kb 7.0 kb 5.0 kb 8.0 kb 7.0 kb 5.0 kb 2.0 kb 1.0 kb ELFO full digest 2.0 kb 1.0 kb ELFO partial digest

4 STAR AKTIVITA nespecifické náhodné štěpení DOUBLE DIGEST kombinace dvou RE v jedné reakci působeníů b í RE je velmi citlivé na iontovou sílu roztoku a charakter přítomných solí. pokud nejsou zachovány specifické podmínky pro danou RE ta může mít tzv. star t aktivitu it Autor prezentace: Doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D. 1. při vysoké koncentraci glycerolu 2. při vysoké koncentraci enzymu 3. při nízkýchí h iontových silách h 4. při vysokých hodnotách ph 5. v přítomnosti některých ý organických g ý látek (DMSO,( etanol, etylenglykol, dimethylformamid) Restrikční enzym BamHI Štěpení na koncích fragmentu DNA Sekvence Delka sekvence % štěpení CGGATCC CGGGATCC CGCGGATCC hod 20 hod EcoRI GGAATTC 8 CGGAATTC CCGGAATTC 12 HindIII KpnI NotI SmaI XhoI t / /t /d di t NotI CAAGCTT CCAAGCTT CCCAAGCTT GGGTACC GGGGTACC CGGGGTACC TTGCGGCCGC TTTGCGGCCGC AAATATGCGGCCGC ATAAGAATGCGGCCGC AAGGAAAAAAGCGGCCGC CCCGGG CCCCGGG CCCCCGGG TCCCCCGGG TCCCCCGGG CCTCGAG CCCTCGAG CCGCTCGAG AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGCTGCATACTGAGGCAGT ATGCTGCATACTGAGGCAGTCCAGATCA ATGCGCGCTAAACCGTAAACTAG TACGACGTATGACTCCGTCAGGTCTAGT TACGCGCGATTTGGCATTTGATC CGATTTGGCATTTGATCCCTAGGCGC forward primer reverse primer BamHI

5 Templát např. genomická DNA XXXXXXXXXXXXXXXXXXATGCTGCATACTGAGGCAGTCCAGATCA ATGCGCGCTAAACCGTAAACTAGXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXTACGACGTATGACTCCGTCAGGTCTAGT TACGCGCGATTTGGCATTTGATCXXXXXXXXXXX Nastavení PCR reakce (templát + primery) AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGCTGCATACTGAGGCAGT ATGCTGCATACTGAGGCAGTCCAGATCA ATGCGCGCTAAACCGTAAACTAG TACGACGTATGACTCCGTCAGGTCTAGT TACGCGCGATTTGGCATTTGATC CGATTTGGCATTTGATCCCTAGGCGC Produkt PCR reakce restrikce (double digest) ( NotI AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGCTGCATACTGAGGCAGTCCAGATCA ATGCGCGCTAAACCGTAAACTAGGGATCCGCG (TTCCTTTTTTCGCCGGCGTACGACGTATGACTCCGTCAGGTCTAGT TACGCGCGATTTGGCATTTGATCCCTAGGCGC Ligace do vektoru Alkalická fosfatasa hydrolýzad fosfátů fá ů z 5 konců ů DNA nebo RNA vláken CIAP (calf intestine AP) BamHI AGCTGC CGCATGCTGCATACTGAGGCAGTCCAGATCA ATGCGCGCTAAACCGTAAACTAGG GATCTTCCAT TCGA CGGCGTACGACGTATGACTCCGTCAGGTCTAGT TACGCGCGATTTGGCATTTGATCCCTAG AAGGTA vektor )n vektor pg9 T4 DNA ligasa enzym izolovaný z T4 bakteriofága infikujícího E.coli, katalyzuje tvorbu fosfodiesterovéf vazby mezi 5 fosfátovou skupinou jednoho a 3 OH skupinou sousedního nukleotidu. reakce vyžaduje energii jednoho ATP používá se ke spojování lepivých i tupých konců dvou restrikčních fragmentů DNA, připojování různých adaptorových sekvencí k DNA a cirkulizaci DNA Reakce se provádí většinou za snížené teploty (15-16 C) aby se snížila kinetická energie molekul a zabránilo se tak nekomplementárnímu spárování lepivých konců. zápor: nízká aktivita enzymu dlouhý reakční čas. Mung bean nukleasa odstraňování jednovláknových 3' i 5' konců s dvouvláknové DNA Klenowův fragment DNA polymerasy DNA polymerasa zbavená své 5-3 exonukleasové aktivity it zaplňování jednovláknových 5' konců na dvouvláknové DNA 5 -vyčnívající konec C 3 -recesivní konec (15 37 C C ) 2x tupý konec C C

6 Snímek 19 pg9 proofreading 3-5 pokud neni muze delat A overhangy 5-3 odstranuje primery co stoji v ceste, nema Klenowuw fragment zaplnuje 5 vycnivajici seka 3 vycnivajici galuszka; ZINC FINGER NUCLEASES CÍLENÁ MANIPULACE V GENOMU příprava p knockoutovaných linií organismů Autor prezentace: Doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D. PŘIROZENÁ REKOMBINACE oprava dvouřetězcových zlomů reakce na poškození DNA HR homologní rekombinace NHEJ nehomologní lepení konců pg5 ZINC FINGER NUCLEASES chimerické proteiny vytvořené spojením Fok I nukleasy a specifických sekvencí zvaných zinkové prsty

7 Snímek 22 pg5 The enzyme FokI, naturally found in Flavobacterium okeanokoites, is a bacterial type IIS restriction endonuclease consisting of an N-terminal DNA-binding domain and a non-specific DNA cleavage domain at the C-terminal.[1] Once the protein is bound to duplex DNA via its DNA-binding domain at the 5'-GGATG-3': 5'-CATCC-3' recognition site, the DNA cleavage domain is activated and cleaves non-specifically between nine and 13 nucleotides downstream of the recognition site. galuszka; Testování specifity ZFN pg6 pg7 ZINC FINGER NUCLEASES Knock-out genu pomocí ZFN Shukla et al (2009): Precise genome modification in the crop species using ZFN. Nature 459

8 Snímek 25 pg6 CCR5 - chemokinovy receptor klinicke testy 18 pacientu deletovany homozygot je immunni vuci AIDS galuszka; pg7 alela pouze u kavkazoidni rasy, zafixovala se zřejmě během morovych pandemii galuszka; KLONOVACÍ VEKTORY A) Bakteriální a kvasinkové PLASMIDY přirozené součástí bakteriálních buněk nesoucí vlastní genetickou informaci ve formě dsdna (rezistence k antibiotikům, metabolismus nezvyklých substrátů apod.) 2-0kb replikují se nezávisle na baktérii vlastní plasmidové vektory vznikly úpravou přirozených pbr (Bolivar a Rodriguez) Autor prezentace: Doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D. MCS (multiple cloning site - polylinker) Unikátní synteticky vytvořená sekvence, obsahující za sebou jdoucí restrikční místa frekventovaných restrikčnícht endonukleas 4.36 kb menší než je přirozeně se vyskytující v E.coli oriv vlastní počátek replikace rezistence k Amp a Tc unikátní restrikční místa kapacitap pro inzertovou DNA 1-5 kb cca 300 bp počátek replikace oriv kóduje sekvenci antisense RNA, která iniciuje DNA replikaci (slouží jako primer) regulace: high copy plasmid např. ColE1 vzájemná j inkompatibilita ori

9 agarosová elektroforesa plasmidové DNA ccc covalently closed circle oc open circle ccc genomická DNA oc forma plasmidu ccc forma plasmidu linearizovaný plasmid oc izolace plasmidové DNA Kolony s křemičitým nosičem nebo aktivními DEAE skupinami 8 kb 6 kb 4 kb 3 kb pg4 Snímek 31 pg4 izolace plasmidové DNA metoda alkalické denaturace ccc plasmidová DNA je stabilnější v alkalickém ph linearní genomická DNA se při ph denaturuje a pak při rychle neutralizaci precipituje v přítomnosti SDS a neutralizaci octanem sodným se precipitují i proteiny a RNA DEAE cistci pro transfekce chaotropni sul jsou obecně iontové sloučeniny, které snižují strukturovanost vody. Ve vodě v tekutém stavu totiž vznikají přechodně vodíkové můstky mezi kyslíkem a vodíkem sousedních molekul, takže je určitým způsobem "strukturovaná". V molekulární genetice je využíván fakt, že molekuly DNA v přítomnosti chaotropních solí adherují na SiO2, tedy obecně na skleněný povrch. ionty guanidinu. galuszka; DEAE matrice křemičitá matrice + chaotropní sůl Výtěžky: 1ml LB média μg g DNA (high-copy plasmid) 1ml LB média 0.5μg DNA (low-copy plasmid)

10 Snímek 33 k5 lytický a lysogenní cyklus virů střední část je důležitá pro lysogenni rust a integrraci do genomu kokos; k5 KLONOVACÍ VEKTORY B) Virové - BAKTERIOFÁGY bakteriální viry s dvouřetězcovou lineární DNA klonovací kapacita 2-25kb 25kb inzertu mnohonásobné množení v závislosti na hostitelské bakterii cos KLONOVACÍ VEKTORY B) Virové - BAKTERIOFÁGY cos Bakteriofág se rozpěstovává na bakteriálním koláči popř. v tekuté suspenzi vhodné baktérie lýzované bakterie tvoří tzv. PLAKY BAKTERIOFÁG lambda 49kb střední d í částt genomu není důležitá pro lytický růst a lze ji nahradit inzertovou DNA snadná manipulace díky cos místům (lepivé konce) na koncích λ DNA, které umožňují její cirkulaci cirkuluje se pouze bakteriofág, který má vzdálenost mezi cos místy 37-52kb tvorba cdna a genomových knihoven

11 PG1 KLONOVACÍ VEKTORY C) bakteriálně-virové - KOSMIDY odvozené z plasmidu do kterého byly naklonovány cos místa bakteriofága λ inzertová DNA je naklonována do lineárního kosmidu a sbalena in vitro virovým i ý mechanismem h i a infikovánai á dod bakterieb i v bakterii je pak cirkulována a replikuje se dál jako plasmid malá velikost cca 5kb není potřeba infekčních lytickýchy ý λ proteinů, pouze selekční marker k antibiotiku, velikost inzertové DNA se může pohybovat až k 47kb D) bakteriálně-virové - FASMIDY (phagemid) k6 odvozené od bakteriofága M13 s malou ssdna (6.4kb), který se po infekci do bakterie replikuje jako kruhovitá dsdna (plasmid, snadná manipulace, restrikce) infekční fágové částice však opět obsahují pouze ssdna (vhodný zdroj pro izolaci ssdna např. pro hybridizaci) do infekčních částic mohou být sbaleny částice až dvakrát větší než je fágová DNA Do buňky jde jako plasmid, pokud chceme produkovat virové částice, necháme buňku infikovat pomocným fágem helper phage konkatemer manipulace s kosmidem Snímek 35 PG1 k6 KOSMIDY nemají lytické geny, replikují se jako bakteriofág ale nelýzují bakterii, s prazdnýma se manipuluje jako s plasmidy. Replikuji se pomaleji než plasmidy KONKATEMERY - cirkularní kosmid se naštípe jedním lepivým a jedním tupym aby nedochazelo k cirkulaci galuszka; A phagemid or phasmid is a type of cloning vector developed as a hybrid of the filamentous phage M13 and plasmids to produce a vector that can grow as a plasmid, and also be packaged as single stranded DNA in viral particles. Phagemids contain an origin of replication (ori) for double stranded replication, as well as an f1 ori to enable single stranded replication and packaging into phage particles. Many commonly used plasmids contain an f1 ori and are thus phagemids. Similarly to a plasmid, a phagemid can be used to clone DNA fragments and be introduced into a bacterial host by a range of techniques (transformation, electroporation). However, infection of a bacterial host containing a phagemid with a 'helper' phage, for example VCSM13 or M13K07, provides the necessary viral components to enable single stranded DNA replication and packaging of the phagemid DNA into phage particles. These are secreted through the cell wall and released into the medium. Filamentous phage retard bacterial growth but, in contrast to lambda and T7 phage, are not generally lytic. Helper phage are usually engineered to package less efficiently than the phagemid so that the resultant phage particles contain predominantly phagemid DNA. F1 Filamentous phage infection requires the presence of a pilus so only bacterial hosts containing the F-plasmid or its derivatives can be used to generate phage particles kokos; KLONOVACÍ VEKTORY E) kvasinkové - YAC umělé kvasinkové chromosomy (yeast artificial chromosomes) patří mezi kyvadlové vektory (shuttle vector) v bakterii jako kruhová dsdna (plasmid) vedle sekvencí bakteriálního plasmidu obsahují části kvasinkového chromozomu (centromera, počátek replikace, dvě telomery) linearizacíi se chromozom aktivuje (oddělení telomer od sebe) obrovská klonovací kapacita až 2000kb nestabilita a složitá manipulace (protoplasty)

12 k8 KLONOVACÍ VEKTORY F) bakteriální - BAC umělé bakteriální chromosomy (bacterial artificial chromosomes) odvozené od E.coli F-plasmidu (fertility plasmid), low copy 1-2 kopie na buňku Snímek 38 k8 par A B C dulezite pro rozdelovani do dcerinych bunek repe helikasa musi se rust v bakteriich s deletovanyma rekombinasama kokos; VÝHODY oproti YAC: Autor prezentace: Doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D. - stabilita (cirkulární) - snadná manipulace - potlačení rekombinace Vhodné fragmenty genomické DNA pro ligaci jsou získány pulsní gelovou elektroforesou VELKÝ VÝZNAM PŘI MANIPULACI S CELÝMI GENOMY INVITROGEN SCREENING BACových knihoven pomocí 3D-poolování

13 SELEKČNÍ MARKERY geny nesené na klonovacím vektoru, exprimované současně s transgenem, na jejichž fenotypovém projevu lze transformované buňky snadno selektovat 1) geny kódující resistenci vůči ANTIBIOTIKU INHIBITORY SYNTÉZY BAKTERIÁLNÍ BUNĚČNÉ STĚNY AMPICILIN gen Amp koduje -laktamasu která štěpí -laktámový kruh penicilinových antibiotik CEFOTAXIM INHIBITORY SYNTÉZY PROTEINů CHLORAMFENIKOL, KANAMYCIN (vážou se na ribozomální podjednotky) gen Cml kóduje chloramfenikol acyltransferasu gen Kan kóduje aminoglykosid fosfotransferasu AMPICILIN SELEKČNÍ MARKERY 2) geny kódující enzymy narušující NUTRIČNÍ NEDOSTATEČNOST (ztráta autotrofie) - používají se především pro selekci transgenních kvasinek Gen URA3 kóduje enzym orotidin 5 -fosfát dekarboxylasu, enzym metabolické dráhy uracilu LYS2 kóduje aminoadipát reduktasu (biosyntéza lyzinu) ADE2 (C1-tetrahydrofolát syntasa), LEU2 ( - izopropylmalát dehydrogenasa), TRP1 (fosforibozylanthranilát izomerasa) SELEKČNÍ MARKERY 1) geny kódující resistenci vůči ANTIBIOTIKU INHIBITORY SYNTÉZY PROTEINů TETRACYKLIN (zabraňuje vazbě aminoacyl trna k ribozomu) gen Tet kóduje membránový protein, který aktivně transportuje TC ven z buňky HYGROMYCIN B (interferuje s velkou ribozomální podjednotkou a zabraňuje elongaci syntetizovaného peptidu) gen způsobující rezistenci hgh kóduje fosforylasu inaktivující toto antibiotikum. PůSOBÍ I NA EUKARYOTICKÉ BUŇKY!!! (selekce transgenních rostlin) INHIBITORY TRANSKRIPCE A REPLIKACE ACTINOMYCIN D (inhibuje transkripci tím, že se váže na specifické úseky DNA) RIFAMPICIN (inhibuje prokaryotní RNA polymerasu, ale i chloroplastovou a mitochondriální, proto je toxicky i pro člověka) ZEOCIN glykopeptid izolovaný ze Streptomyces, který štěpí po vstupu do buňky jakoukoliv DNA. Rezistentní gen Sh ble kóduje inhibiční protein (13.6 kda) tohoto glykopeptidu. koncentrace účinné pro selekci: Baktérie g/ml Kvasinky g/ml Savčí buňky g/ml ZEOCIN SELEKČNÍ MARKERY 3) blue/white screening test t (α-komplementace) pomocný test pro selekci transformovaných bakterií či bakteriofágu klonovací vektor nese gen lacz + který kóduje enzym -galaktosidasu (štěpí laktosu na galaktosu a glukosu) MCS je umístěn uvnitř tohoto genu, a po vložení inzertu se tento gen stává neaktivní Princip selekce: pro transformaci daného plasmidu se použijí specifické kmeny kvasinek deficientní pro daný gen, selekce se pak provádí na minimálním médiu (bez živin). Příklad: kmen Saccharomyces cerevisiae INVSc1 genotyp: MATa his3 1 leu2 trp1-289 ura3-52 /MAT his3 1 leu2 trp1-289 ura3-52 fenotyp: His -, Leu -, Trp -, Ura - tzn. že tento kmen je autotrofní na histidin, leucin, tryptofan a uracil a na médiu bez těchto živin neporoste kyvadlový vektor pro transformaci kvasinek X-GAL galaktosa uvolní se modré barvivo Ampicilin (zabije netransformované bakterie) X-GAL (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl b-d-galaktopyranosid) umělý substrát IPTG (isopropyl-1-thio- -D-galaktopyranosid) induktor exprese lacz genu

14 lytický a lysogenní cyklus virů struktura lambda bakteriofága Autor prezentace: Doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D. SELEKČNÍ MARKERY 4) lysogenní selekce bakteriofágových vektoru LAMBDA FIX II VEKTOR ( bakteriofágový vektor) selekce se provádí na speciálním kmeni E.coli (lysogenní pro P2 bakteriofága, tzn. že hostitelská buňka je již napadená jiným bakteriofágem) Pokud má vektor genotyp red/gam+ na daném kmeni neroste je tzv. Sensitivní k P2 interferenci (Spi + fenotyp) red/gam- red a gam geny se nacházejí ve střední části (stuffer) a jsou nahrazeny inzertem. Bakteriofág s inzertem je tudíž Spi- a může být vyselektován na P2 lysogenním kmeni příliš malý nesbalí se do kapsidy red/gam+ 12 kb inzert (genomová knihovna) Heterologní expresní systémy Bakteriální Kvasinkové Hmyzí buňky Savčí buňky Transgenní rostliny

15 pg8 charakteristika E. coli kvasinky hmyzí buňky savčí buňky buněčný růst rapidní (30min) rapidní (90min) pomalý (18-24h) pomalý (24 h) požadavky na růstové medium minimální TA TOPO klonování minimální linearizovaný ý vektor ošetřen DNA topoisomerasou I rychlá reakce bez účasti T4 DNA ligasy komplexní medium komplexní medium cena růstového media nízká nízká vysoká vysoká množství exprimovaného proteinu extracelulární lární exprese skládání proteinů velké malé až velké malé až velké malé nebo střední sekrece do sekrece do sekrece do sekrece do inkluzních tělísek media media media posttranslační modifikace obvykle nutné dodatečné složení N-glykosylace - v některých případech nutné dodatečné složení vysoký obsah manosy řádně složené proteiny jednoduché, bez sialové kyseliny řádně složené proteiny komplexní O-glykosylace fosforylace acetylace acylace γ-karboxylace Snímek 51 pg8 rekombinatní genetická informace je vklonována do vhodného expresního plasmidu, nedochází k integraci do genomu TA klonování Taq polymerasy bez 3-5 samoopravné aktivity přidávají na 3 konce datp The key to TOPO cloning is the enzyme DNA topoisomerase I, which functions both as a restriction enzyme and as a ligase. Its biological role is to cleave and rejoin DNA during replication. Vaccinia virus topoisomerase I specifically recognizes the pentameric sequence 5 -(C/T)CCTT-3 and forms a covalent bond with the phosphate group attached to the 3 thymidine. It cleaves one DNA strand, enabling the DNA to unwind. The enzyme then relegates the ends of the cleaved strand and releases itself from the DNA. To harness the religating activity of topoisomerase, TOPO vectors are provided linearized with topoisomerase I covalently bound to each 3 phosphate galuszka;

16 rekombinační klonování místně specifický p ý rekombinační systém bakteriofága lambda slouží k integraci g do genomu hostitele (aktivuje lysogenní cyklus) attb x attp attl x attr ( x znamená rekombinaci). rekombinační klonování rekombinace probíhá v obou směrech a je katalýzována proteiny z λdna i bakteriálními. selekce antibiotikum a gen ccdb mezi rekombinantními místy, protein ccdb inhibuje bakteriální DNA gyrasu a způsobuje smrt buněk nesoucí prázdný vektor vstupní vektor destinační vektor Autor prezentace: Doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D. Invitrogen dodává všechny typy vektorů kompatibilních pro rekombinantní klonování reakce trvá 1 hodinu při laboratorní teplotě zachovávání čtecích rámců (ORF), žádné složité plánování Klasické klonování do vstupního vektoru: pentr vektory udržované v E.coli kmen DB3.1 (mutovaná gyrasa tak, že je necitlivá na ccdb inhibici) po rekombinaci dvojitá selekce (1) na antibiotikum a (2) v sensitivním kmeni k ccdb nerostou nezrekombinované plasmidy 0% účinné není třeba selektovat pozitivní klony

17 přímá amplifikace s primery obsahující rekombinační sekvence: attb1 attb2 rekombinace do donorového vektoru: pentr a pdonr: pomocné vektory pdest: cílové vektory k použití PG2 N-terminal 6xHis tag umožňuje velice účinnou purifikaci i proteinu pomocí metal-chelatační chromatografie popř. detekci pomocí Anti-HisG protilátky Snímek 58 PG2 LR reakce BP reakce se účastní integrasa a ekscionasa (αdna) se účastní IHF a integrasa a IHF (integration host factor) z bakterie rekombinační klonování T7 bakteriofág, nejsilnější známy promotor, T7 RNA polymerasa je v baktérii pod IPTG inducibilním promotorem galuszka; EK rozpoznávací sekvence pro specifickou enterokinasu, odštěpuje His-tag T7 promotor přesná a silná exprese heterogenního proteinu Ribosome binding site TOPO klonovací místo pro PCR produkt Xpress epitop (Asp-Leu-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp- Lys) umožňuje detekci fúzního proteinu pomocí Anti-Xpress protilátky T7 transcription termination region silnýý terminační systém T7 bacteriofága gen pro rezistenci k ampicilinu umožňuje selekci plasmidu v E. coli puc origin zajišťuje vysokou replikaci plasmidu a růst E. coli C-terminal V5 epitope tag umožňuje detekci fúzního proteinu pomocí Anti-V5 protilátky

18 exprimovaný protein PG3 usnadnění izolace rekombinantního proteinu koncové značky signální peptid ATGforward primer exprimovaný protein reverse primertag V5 epitop detekce his tag izolace nejpoužívanější N a C-terminální značky (tagy): His-tag pro metal chelatační chromatografii (Ni) FLAG epitope - tag DYKDDDDK (Sigma; specifická protilátka) CBP - calmodulin binding peptide (26 AK) CBD - cellulose binding domain Autor prezentace: Doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D. his tag x-press signální peptid exprimovaný protein forward primer izolace detekce Snímek 60 PG3 FLAG hydrofilní epitop rozpoznatelný specifickou protilátkou celulosa váže aromatické residua AK galuszka; reverse primertag izolace proteinu z bakteriální kultury: pokud je protein ukládán do inkluzních tělisek, rozbití buněk tepelným šokem, případně sonifikací nebo lysozymem pokud je ukládán do inkluzních tělísek, oddělení nerozpustné frakce a denaturace 9M močovinou č nebo guanidium chloridem poté je nutno protein renaturovat - SLOŽITÉ!!!! marker IB 1M 0.5mM imidazol 200mM 0mM wash II wash I IB rakt bakt.extr

19 k1 tagy založené na sacharid-vazebných proteinech MBP - maltosa binding protein - amylosa CBP - intein chitin binding protein - chitin Který kmen E.coli zvolit? k2 k3 tona mutace chrání bakterii před napadením T1 a T5 fágem, chrání tak vaše klony lacz.m15 částečná delece wild-typového lacz genu, po vložení plasmidu dochází k tzv.α- komplementaci potřebné pro blue/white screening na miskách s X-gal enda1 deficience endonukleasy I zaručuje kvalitní izolaci plasmidové DNA laciq q produkuje lacz represor negativně regulující transkripci z lacz promotoru; zrušení přídavkem IPTG mcra, mcrbc, a mrr mutace v těchto genech zaručuje možnost klonování i methylované genomové DNA reca1 zabraňuje rekombinaci mezi plasmidovou a bakteriální DNA F episom je potřebný pro produkci ssdna kóduje protein tvořící tzv pilus na vnější membráně E.coli Snímek 62 k1 k2 Nejpoužívanější laboratorní kmeny E.coli kmen mutace účel firma BL21(DE3) BL21 (DE3) plyss BL21 Star (DE3) DB3.1 DH5λ Origami (DE3) Rosetta Top inteiny - proteinové introny kokos; The most likely mutation is in the rop gene because rop mutants have increased plasmid copy number, and temperature sensitive mutations are most often due to changes in protein structure. An alternative explanation is that the mutation destablizes a stem-loop structure in the RNA which plays a role in regulation. (It is possible to obtain temperature sensitive mutations that decrease the stability of nucleic acid hybrids but, since most nucleic acid hybrids involve a considerable number of base pairs, a single nucleotide substitution is unlikely to have a substantial effect on the Tm of the hybrid. Furthermore, in this case the hybrid is between complementary strands so a nucleotide substitition would result in a different base pair at that position, not mispairing at that position.) kokos; k uvolneni represe az 00 kopii kokos; deficientní na obecná exprese proteasy deficientní na přesně řízená exprese proteasy, exprese lysosymu RNaseE mutant exprese s redukovanou degradací RNA gyra462 alela první laboratorní kmen propagace GATEWAY vektorů s toxickým genem ccdb propagace plasmidu, klonování. trxb a gor mutant exprese, tvoří disulfidické můstky v cytoplasmě Geny pro argu, argw, glyt, IleX, leuw, mett, prol, thrt, thru, and tyru ara mutant exprese eukaryotních genů propagace plasmidu, klonování. Stratagene Novagen Invitrogen Invitrogen Life Technologies Novagen Novagen Invitrogen

20 regulace exprese pod T7 promotorem kmeny E.coli vhodné pro expresi - BL21(DE3) nebo BL21(DE3)LysS exprese naklonovaného genu je kontrolována velice silným promotorem z bakteriofága T7, který původně řídí expresi genu pro obalový protein pro expresi je nutno dodat do hostitelským buněk T7 RNA polymerasu a to buď infekcí bakteriofágem, nebo její indukovanou expresi. v sytému pcr T7 TOPO TA Expression je exprese T7 RNA polymerasy indukována lacz promotorem pomocí IPTG a tento systém je uložen v genomu hostitelských buněk Autor prezentace: Doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D. před indukci IPTG probíhá bazální exprese T7 RNA polymerasy, pokud je exprimovanýp ý produkt toxickýý pro bakterii, nedojde k selekci, selektují se pouze mutované klony, které neprodukují rekombinantní protein kmen E.coli BL21(DE3) nese v genomu T7 RNA polymerasovýy ý gen pod lacz promotorem, tento konstrukt je vložen do genu pro integrasu, jehož inaktivaci se zabrání lyzi, vyštěpení fágové částice v nepřítomnosti pomocného fága. Přirozený lac represor, jehož gen je taktéž vložený do genomu bakterie, brání expresi bez přítomnosti induktoru (IPTG) někdy ovšem i přesto dochází k bazální expresi T7 RNA polymerasy a pokud je pod T7 promotor vložen gen produkující toxický produkt pro E.coli může docházet k redukci růstu, smrti baktérie či nestabilitě plasmidu. Kmen BL21(DE3)LysS navíc obsahuje T7 lysozym (produkovaný genem LysS), uložený na speciálním vektoru s nízkou expresí a nezávislou selekci na chloramfenikol. l T7 lysozym je schopen se vázat na T7 RNA polymerasu a inhibovat bazální transkripci, i exprese indukovaná IPTG je daleko silnější a T7 RNA polymerasa se dostane z této inhibice T7 lysozym je bifunkční enzym, kterýý má navíc vlastní lytickou funkci, naštěpuje bakteriální peptidoglykanovou stěnu a usnadňuje tak následnou izolaci exprimovaného proteinu. Jaké geny lze v E.coli exprimovat? většinu z prokaryotických organismů eukaryotní geny jejichž produkty nepodléhají posttranslačním modifikacím většina cytosolárních proteinů (není glykosylovaná) geny kódované chloroplastovou nebo mitochondriální DNA (podobný genetický kód, evoluční příbuznost) všechny geny jejichž produkty nepotřebujeme v aktivní formě

21 k9 k stabilizace exprimovaného proteinu SUMO peptide Small Ubiquitin like MOdifier ochrana před proteolýzou zvyšování rozpustnosti proteinu zvyšuje množství exprimovaného proteinu Saccharomyces cerevisiae (od 1979) SHUTTLE VEKTOR GAL1 promotor zajišťuje induktivní expresi vloženého genu T7 promotor/priming site umožňuje in vitro transkripci a sekvenaci inzertu Multiple cloning site má 9 jedinečných klonovacích míst CYC1 terminátor transkripce, stabilizuje mrna transkript pmb1 origin (puc-derived) udržuje high copy replikaci v E. coli Ampicillin resistance gene selekce v bakterii URA3 selekce kvasinek v uracil-deficientním médiu 2 μ origin udržování replikace v kvasince f1 origin produkce single-stranded DNA Sumo proteasa 2004 Snímek 71 k9 k kvasinkové expresní systémy jednoduchá a levná exprese v eukaryotním organismu rychlá propagace a jednoduchá média jednoduchá manipulace s genem (klonovací systémy kompatibilní s bakteriálními, shuttle vektor) většinou lze produkovat nativní proteiny z vyšších eukaryot (správná posttranslační modifikace glykosylace, folding) jednoduchý a prozkoumaný systém pro sekreční expresi do média hostitelské organismy: epimerasa galaktosy UDP-glucosa na UDP galaktosa kokos; CYC1 cytochrom c oxidase kokos; Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Pichia pastoris Hansela polymorpha Kluyveromyces lactis Yarrowia lipolytica

22 g Saccharomyces cerevisiae REGULACE EXPRESE u kmene INVSc1 je transkripce z GAL1 promotoru inhibována přítomnosti glukosy v médiu transkripce je indukována odstraněním glukosy a přidáním galaktosy jako zdroje uhlíku do média alternativně se může kvasinková kultura propagovat v médiu obsahující rafinosu, která neinhibuje ani neindukuje galaktosový promotor a transkripce se spustí pouze přídavkem galaktosy, bez nutnosti odstraňování rafinosy HOSTITELSKÉ BUŇKY A) standardní kmen E. coli např. TOPF který slouží pro namnožení plasmidu, jeho udržování a manipulaci s ním. B) kmen S.cerevisiae INVSc1 Genotyp: MATa his3 D1 leu2 trp1-289 ura3-52/mata his3 D1 leu2 trp1-289 ura3-52 Fenotyp: His-, Leu-, Trp-, Ura- INVSc1 je diploidní kmen autotrofní na histidin, leucin, tryptofan, a uracyl. Pichia pastoris v ideálních případech poskytuje až 0 krát vyšší výtěžky než klasická Saccharomyces klonování a manipulace s Pichii je velmi obdobná jako pro Saccharomyces selekce zeocin nebo nutriční autotrofie Pichia přirozeně sekretuje daleko méně vlastních proteinů než Saccharomyces - zjednodušuje izolací rekombinantního proteinu Pichia pastoris je methylotrofní t organismus tzn. jako zdroj uhlíků využívá á metanolt l nejdříve ho oxiduje na formaldehyd (dva geny pro alkoholdehydrogenasu) za přítomností kyslíku, proces probíhá v peroxizomech jelikož vzniká toxický peroxid vodíku. Kvasinková AOX má velice slabou afinitu ke kyslíku a proto je AOX exprimováná ve velice velkém množství (5% veškeré mrna). toho využívá heterologní expresní systém, kdy je transgen vložen pod AOX promotor. Snímek 74 g Saccharomyces cerevisiae roste do vysoké density až sirupovitá galuszka; SEKRECE HETEROLOGNÍHO PROTEINU V KVASINKÁCH sekrece proteinu v kvasinkách je komplexní proces a není zde obecně akceptovaný sekreční signální peptid některé heterologní jsou sekretovány úspěšně pod svým vlastním signálem často se k heterolognímu proteinu přidává kvasinkový sekreční signál odvozený od S.cerevisae genů pro invertasu (SUC2), kyselou fosfatasu (PHO5) nebo alfa-faktorfaktor (MFa1) POSTRANSLAČNÍ ÚPRAVY HETEROLOGNÍHO PROTEINU N-a O-glykosylace se u kvasinek liší od vyšších eukaryot a způsobuje tvorbu neaktivního heterologního proteinu např. kvasinky preferuji glykosylaci manosou na zbytky treoninu a serinu zatímco vyšší eukaryota preferuji O-glykosylaci sialovou kyselinou tyto rozdíly mohou způsobovat špatný folding, nestabilitu či jinou imunogenicitu od původních proteinů N-glykosylace většinou probíhá bez problému problémy mohou nastat u složitějších proteinů s jejich fosforylací, acetylací, methylací, miristylací i a isoprenylací problém jsou nejčastěji kvasinkové endoproteasy, které rády napadají exprimované cizí proteiny

23 HIS4 selekce v Pichii ampicilinová selekce v bakterií AOX1 promotor AOX1 terminátor pbr322 bakteriální počátek replikace Pichia pastoris rekombinace a integrace v Pichia pastoris transformace lineární plasmidovou DNA vede k integraci do genomu kvasinky pomocí homologní rekombinace. transformanti vykazují vysokou stabilitu i bez selekčního tlaku integrace na AOX1 lokus gen narušen f1 produkce ssdna S signální sekvence alfa faktoru 3 AOX1 ORF pro AOX gen místo pro homologní rekombinaci může nastat i mnohonásobná inzerce s pravděpodobností p 1-% jednoduché inzerce Pichia pastoris rekombinace a integrace v Pichia pastoris

24 MNOHONÁSOBNÁ REKOMBINACE A INTEGRACE v PICHII různé typy selekce transformované Pichia pastoris selekce na základě stupňující se koncentrace antibiotika v médiu je třeba otestovat stovky kolonií (1-% účinnost) ANTIBIOTIKA zeocin 50 μg μg /ml blasticidin Kanamycin/G418 G418 kanamycin Autor prezentace: Doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D. Pichia pastoris - glykosylace N-glykany mají vysoký obsah manosy nutričnít í autotrofie t gen pro histidinol fosfatasu f (his4) lepší pro udržováníd ž á í integrity transformanta při kultivacích ve velkých objemech (fermentace) narušení genu pro AOX1 způsobuje ztrátu aktivity alkohol dehydrogenasy a kvasinka získává MutS fenotyp (methanol utilization slow). Je schopná zpracovávat metanol pouze AOX2 (která má daleko nižší aktivitu 5%) ) využívá se toho pro selekci integrantů po transformaci: ti co vyrostou daleko později než ti co mají v sobě cirkulární plasmid a nemají narušený gen pro AOX1 Yarrowia lipolytica je to lipofilní kvasinka, která spotřebovává jako zdroj uhlíku n-alkány a mastné kyseliny do prostředí sekretuje velké množství extraceluární proteasy (gen XPR2) promotor tohoto genu byl upraven, tak aby nebyl reprimovám okolními vlivy hybridní promotor má 4x opakující se tandemové části z pxpr2 a vykazuje konstitutivní expresi za hybridní promotor je vložená signální sekvence proteasy XPR2 nebo sekretované lipázy klonovací místo SfiI a KpnI (XbaI)

25 Yarrowia lipolytica vektory jsou integrativní (rekombinatní DNA se zabudovává do genomu kvasinky) odvozené od základního plasmidu pbr322 pina1267 mono-integrativní (homologní rekombinace na Po1g lokus, který byl klonován do hostitelského kmene kvasinky do Leu2 genu, linearizace přes jedinečné NotI místo pina1294 mnohonásobná integrace, do vektoru vložená Ylt1 retraspozonová sekvence, která aktivuje nehomologní rekobinaci do genomu kvasinky hostitelský kmen na knockoutoványy geny pro extracelulární proteasy do hostitelské Yarrowia je vložen gen Suc2 ze Saccharomyces který umožňuje růst nového kmenu na sacharóze (snadnější propagace) YEAST TWO HYBRID SYSTEM HYBRIDNÍ EXPRESNÍ KNIHOVNY systém pro studium interakce protein - protein, bait vektor (návnada) obsahuje gen pro protein, který studujeme a fish (prey) vektor (obsahuje danou cdna expresní knihovnu) PRO STUDIUM PROTEIN-PROTEIN INTERAKCÍ význam ý pro studiumt regulačních a signálních drah naklonovaná cdna knihovna z libovolného euk.organismu konstitutivní promotor Heterologní exprese v Yarrowia lipolytica srovnání s ostatními heterologními systémy exprese kukuřičného enzymu cytokinin oxidasy/dehydrogenasy y y Escherichia coli (ptybii cytosolická exprese s protein fusován s inteinem) ± 5 mg/litr média 3 dny Saccharomyces cerevicae (pyes2 sekrece do média) ± 2 μg/litr média Pichia pastoris ppicz-a (přirozený signální peptid) ± μg/litr média Pichia pastoris ppicz-α (signální peptid z kvasinky) 1 mg/litr média Yarrowia lipolytica pina1294 (signální peptid z kvasinky) 5mg/litr média přirozený zdroj kukuřice (purifikace) 2 μg/kg média kukuřičných zrn mutace místně cílená (site-directed mutagenesis) gen, či sekvenci kterou budeme chtít mutovat, je třeba mít v libovolném vektoru navržení dvou reverzně komplementárních primerů, v místě kde chceme mutovat, nesoucí tuto mutaci vytváří se nové cirkulární DNA nesoucí mutaci, jsou k sobě komplementární a drží u sebe, mají přerušení v místě konce primerů (tzv. nick) ošetření restrikční endonukleasou DpnI (štěpí pouze methylovanou DNA, templátový plasmid) ) transformace do bakterie a namnožení mutovaného plasmidu 0% účinnostt není třeba selekce mutovaný/nemutovanýt t ý 2 měsíce 3 týdny 3 týdny 1 týden 3 měsíce kvasinkový k chromozom

26 mutace místně cílená (site-directed mutagenesis) M G A L L W L původní sekvence 5 ATG GGA GCT CTA TTA ACC TTA 3 forward primer 3 TAC CCT CGA GAT AAT TCG AAT 5 reverse primer 5 ATG GGA GCT CTA TTA AGC TTA 3 M G A L L S L originální plasmid nastavení PCR s PfuTURBO Taq PCR s nízkým počtem cyklů CÍLENÁ MUTACE KOZAKOVÁ SEKVENCE je důležitá pro efektivitu translace (umožňuje pevnou vazbu malé ribozomální podjednotky na mrna) u eukaryot. obratlovci Drosophila spp. gccrccatgg caaaatg Saccharomyces cerevisiae aaaaaaatgtct rostliny aacaatggc Autor prezentace: Doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D. PfuTURBO termostabilní DNA polymerasa - nejmenší chybovost exonukleasová aktivita XL-Gold kmen E.coli - nemá knockoutované metyltransferasy DpnI restrikce s DpnI transformace a namnožení syntéza genů na zakázku Minimum charge bp bp bp price/bp $159 $0.39/bp $0.39/bp $0.39/bp turnaround time 12 # 12 # 12 # 17 # start codon Kozak seq. U A A A C A A U G G C U 60% 0% 70% AtCKX1 G U A G A A A U G G G A AtCKX2 A A A C A A A U G G C U HvCKX2 A G A G C C A U G A G G syntéza DNA FOSFORAMIDIT ochrana N-bází

27 Syntéza umělého genu Optimalizace syntetického genu firmou Mr.GENE 1. Úprava kodonů 2. Vyvarování se terciárním strukturám mrna 3. Vyhledávání specifických motivů např. Shine-Dalgarnova sekvence 5' -AGGAGGU-3 3' polyadenylační signály odchylky v genetickém kódu jiná preference: kodón pro arginin (6 různých): CGU CGA CGG CGC snižují výtěžek heterologní exprese AGA AGG E. coli Arabidopsis th. H. sapiens AGA 2.2% 2% AGA 18.9% AGA 11.9% AGG 1.6% AGG 11.0% AGG 12.1% výjimky: sekvenace DNA (Sangerova metoda) asymetrická PCR amplifikuje pouze jeden řetězec dsdna PCR s jedním primerem a dideoxyribonukleotidy (ddatp, ddgtp, ddctp, ddttp) dideoxyribonukleotidy ib značenéč 4 fluorescenčními č markery velice citlivé elektroforetické rozdělení v kapiláře fluorimetr s automatickým vyhodnocením dideoxyribonukleotid

28 sekvenace DNA (Sangerova metoda) vyhodnocení dříve elektroforeticky ve čtyřech reakcích sekvenace DNA (Sangerova metoda) Autor prezentace: Doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D. NOVÉ METODY SEKVENCOVÁNÍ: Pyrosekvencování DNA polymerasa dntp mix ATP sulfurylasa Adenosine 5 fosfosulfát Luciferasa Luciferin Apyrasa dnes: jedna reakce, čtyři různě fluorescenčně značené dideoxyribonukleotidy, ib detekce při čtyřech různých emisních vlnových délkách univerzální primery, nebo vlastní jedna sekvenační reakce přečte cca bp SEKVENAČNÍ ZAKÁZKOVÝ SERVIS: CZK na jednu sekvenaci 1. Izolace genomové DNA a restrikce na vhodné fragmenty ( bp) 2. Zatupení konců a navázání adaptorové sekvence s biotinovou značkou (modrá) a druhé bez (červená) 3. Navázání na kuličky se streptavidinem 4. Nanesení na mikroreaktorovou destičku 5. Provedení emulsního PCR (červený a modrý primer) 6. Paralelní l pyrosekvencování ve všech jamkách

29 Roche 454/GS FLX Sequencing Technology Bridge Bridge PCR 1. Illumina/Solexa metoda cyklické reverzibilní terminace 3. cyklická reverzibilní terminace Chemické štěpení ve vodném prostředí za katalýzy paladiem DEALLYLACE

30 Illumina/Solexa - vyhodnocení SROVNÁNÍ platforma Příprava templátu chemismus Délka jednoho čtení (bp) Doba běhu Přečtené Gb na jeden běh Cena přístroje (USD) ROCHE 454 Fragmentace + emulsní PCR ILLUMINA SOLEXA Fragmentace + bridge PCR Cena přečtení lidského genomu pyrosekvencování hod Cyklická reverzibilní terminace 35 9 dní Autor prezentace: Doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D. ROCHE dlouhé běhy, lze dělat i de novo nekomplikované genomy (mikroorganismy + rychlé y y v homopolymerních p y repeticích p (AAAAAAAAA, (, GGGGGGGGGGG)) -- chyby ILLUMINA/ + nejpoužívanější jp j SOLEXA + obrovský rozsah, resekvenace celého genomu v jednom běhu -- nízká multiplexita Pyrosekvencování a technologie Roche 454 umožnili rozvoj metagenomiky: ODSEKVENOVANÉ GENOMY Rychlé a levné sekvencování genomů jednotlivců Nelze sekvencovat neznáme genomy, kvůli obtížnosti přiřazení (repetice) pouze ty u kterých je znám homologický genom (stejného biologického druhu) Metagenomika studium biologické rozmanitosti a genetického materiálu celé komunity (mikro)organismů přímo v jejich přirozeném prostředí bez nutnosti jejich kultivace v laboratoři (např. z půdy, střevní mikroflora) Metagenom celková genetická iinformace f komunity k it organismů X Genom celková genetická informace jednoho organismu

31 Střevní mikroflóra P. J. Turnbaugh et al. (2006) An obesity-associated i t gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. Dec 21;444(7122): Apendikální mikrobiální DNA z ob/ob, ob/+, +/+ myši Složení mikroflóry střeva závislé na obezitě změny v zastoupení bakteriálních kmenů Bacteroidetes a Firmicutes změny y v metabolickém potenciálu střeva (ukládání energie) největší význam DIAGNOSTIKA zlevnit přesekvencování lidského genomu na USD (do roku 2015) (nové levnější přístupy: SOLID Applied Biosystems, HELIOS) CANCER GENOME ATLAS DNA mamuta - Mammoth Project Hendrik N. Poinar et al (2006): Metagenomics to Paleogenomics: Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA. Science Jan. 20, 311 (5759): DNA extrahována z 1 g mamutí kosti (28000 let, ze Sibiře) 0 ml DNA fragmenty bp 454 sekvenování 28 miliónů bp čtení 45,4% čtení se přirovnalo se sekvencí slona afrického, 1,4% - s lidskou a 1,2% se psí sekvencí. TRANSCRIPTOME SEQUENCING (RNA-seq) výhoda oproti DNA čipům je že 0% postihuje alternativní sestřih a alelickou variabilitu SINGLE MOLECULE SEQUENCING (Helios) preinplantační č diagnostika SOLID PHASE CAPTURE NimbleGene čip vyrobený pro vychytání kodujících sekvencí a regulačních oblastí z fragmentované genomické DNA před vlastním vysokoúčinným sekvencováním