POVRCHOVÁ ÚPRAVA TITANOVÝCH SLITIN POVLAKY DLC

Transkript

1 POVRCHOVÁ ÚPRAVA TITANOVÝCH SLITIN POVLAKY DLC František HNILICA a,b, Ladislav JOSKA c, Vítězslav BŘEZINA d, Sonia BARTÁKOVÁ e, Ladislav CVRČEK f a UJP PRAHA a.s., Nad Kamínkou 1345, 156 Praha 5, Česká republika, hnilica@ujp.cz b ČVUT v Praze, Fakulta strojní, Ústav materiálového inženýrství, Technická 4, Praha 6 b VŠCHT v Praze, Ústav kovových materiálů a korozního inženýrství, Technická 1905, Praha 6 c B.P.MEDICAL spol.s.r.o., Příkop 843/4, Brno d Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně, Stomatologická klinika, Pekařská 53, Brno e HVM PLASMA spol s.r.o., Jinonická 80, 158 Praha 5 Abstrakt Vrstvy DLC byly deponované technologií PACVD (Plasma Assisted Chemical Vapour Deposition), přitom předtím byla nanesena mezivrstva čistého Ti grade 1 magnetronovým naprašováním. Experimentální studie byla zaměřena na DLC povlaky na vzorcích: 1. titanu grade 2, 2. slitiny Ti6Al4V a 3. slitiny Ti35Nb6Ta. Povrchy vzorků byly připraveny s různou drsností leštěním, broušením a balatinováním částicemi Al 2 O 3 zrnitosti 120 a 60 mesh. Studován byl charakter povrchu povlaků k substrátům metodou řádkovací elektronové mikroskopie, tloušťka povlaků metodou metalografických řezů a jejich struktura metodou XPS (fotoelektronovou spektroskopií). Adhese povlaků k substrátům byla hodnocena pomocí scratch testů a měřením kontaktních úhlů byla určena povrchová energie podle Owense a Wendta. Fyzikální charakteristiky byly porovnány s biologickými vlastnostmi. Byla hodnocena cytokompatibilita DLC vrstev metodou růstu buněk ve výluhu zkoušeného materiálu, primárně pak morfologie, dilatace a růst buněk v reakci na studovaný materiál s využitím řádkovací elektronové mikroskopie. 1. ÚVOD Titanové slitiny představují v současné době vynikající materiály pro výrobu implantátů zejména proto, že se vyznačují mnoha kvalitními vlastnostmi potřebnými pro použití v medicíně. Velmi důležité je jejich chemické složení a mechanické charakteristiky, především nízký elastický modul. Na prvním místě je však kompatibilita s lidským tělem, přitom interakce s tkání závisí na povrchu implantátu. Jednou z cest zlepšení interakce buněk s povrchem je jeho povlakování vrstvou DLC. Modifikace povrchu povlaky DLC je předmětem příspěvku. 2. EXPERIMENTÁLNÍ MATERIÁL A POUŽITÉ METODY Jako substráty použité pro deponování DLC (diamond like carbon) vrstev byly použity technicky čistý titan grade2, slitina Ti6Al4V (Ti grade5) a beta-titanová slitina o složení Ti35Nb6Ta (dále ozn. TNT). Z materiálů byly připraveny vzorky ve tvaru válečků průměru 8 mm a tloušťky 3 mm. Čelní plochy byly upraveny čtyřmi způsoby za účelem dosažení různé drsnosti. Byly jednak leštěny (ozn. polish) na dosažení zrcadlového lesku, broušeny brusným papírem s karbidy křemíku zrnitosti P 1200 (ozn. grind) a balatinovány (pískoványozn. sand) jednak částicemi Al 2 O 3 zrnitosti 120 mesh a jednak zrnitosti 60 mesh. Takto připravené substráty byly povlakovány vrstvou DLC. Vrstva DLC byla deponována technologií PACVD (Plasma Assisted Chemical Vapour Deposition) v zařízení Flexicoat 1200 (Hauzer Techno Coating)

2 z acetylenu. Depoziční teplota byla 200 o C, tlak 0,5 0,8 Pa s pulzním předpětím na povlakovaných substrátech. Předtím byla nanesena adhezní mezivrstva metodou megnetronového naprašování z terče Ti grade 1. Vrstvy byly deponovány firmou HVM Plasma. Charakteristika povrchu substrátů i povlaků byla hodnocena kvalitativně pomocí řádkovací elektronové mikroskopie, kvantitativní hodnocení drsnosti povrchů bylo provedeno kontaktní metodou na přístroji Hommel Basic T Stanovení povrchové energie bylo provedeno pomocí měření kontaktních úhlů přisedlé kapky vody resp. ethylen glycolu a jejího výpočtu podle Owense a Wendta [1]. Tloušťka DLC vrstev byla měřena na plochách metalografických výbrusů orientovaných kolmo na povrchy vzorků a jejich struktura byla určena metodou XPS (fotoelektronovou spektoskopií). Cytokompatibilita DLC vrstev byla hodnocena metodou růstu buněk ve výluhu zkoušeného materiálu, primárně pak morfologie, dilatace a růst buněk v reakci na studovaný materiál s využitím řádkovací elektronové mikroskopie. 3. VÝSLEDKY A JEJICH DISKUSE 3.1 Charakteristika povrchů substrátů a vrstev DLC Povrchy všech substrátů mají obdobné charakteristické rysy. Po vyleštění jsou povrchy substrátů zcela hladké, u slitiny Ti6Al4V je v obrazu sekundárních elektronu zviditelněna její α + β struktura (Obr. 1). Zdrsnění povrchu broušením vede k vytvoření četných rýh, kdy zejména u beta-ti slitiny u některých hlubších rýh dochází k odtrhávání drobných kousků materiálu. Po balatinování jsou povrchy výrazně zvrásněné, pozorujeme zde různě orientované mikroplošky s četnými záhyby tvořenými deformací materiálu na povrchu při dopadu částic Al2O3. V některých případech částice ulpívají v povrchové vrstvě (Obr. 2). Povrchy vzorků po balatinování substrátů nejhrubší zrnitosti 60 mesh mají z kvalitativního pohledu obdobný charakter jako povrchy balatinované částicemi zrnitosti 120 mesh s tím, že mikroplošky jsou rozměrnější a členitost povrchu je větší.vyšší plasticita u beta slitiny se projevila větší drsností povrchu. Obr. 1. Leštěný povrch substrátu Ti Grade 5 Fig. 1. Polished surface of substratum Ti Grade 5 Obr. 2. Balatinovaný povrch substrátu Ti Grade5 částicemi Al 2 O 3 zrnitosti 60 mesh Fig. 2. Sand-blasted of substratum surface by particles granularity 60 mesh Povlaky DLC nanesené na leštěný povrch substrátů se při kvalitativním posouzení při menším zvětšení jeví jako zcela hladké, větší zvětšení odhaluje jemnější reliéf tvořený polokulovitými útvary (Obr. 3). Rýhy po broušení i reliéfní povrch po balatinování substrátu zůstávají zachovány. Je však, na obrázcích pořízených při větších zvětšeních, patrné zaoblení ostřejších hran a struktura výše uvedeného jemného reliéfu. Typický charakter povlaku DLC na balatinovaných substrátech je ukázán na Obr. 4.

3 Obr. 3. Vrstva DLC na leštěném povrchu substrátu Ti Grade 2 Obr. 4. Vrstva DLC na balatinovaném povrchu substrátu Ti Grade 2 částicemi zrnitosti 60 mesh Fig. 3. DLC coating on polished surface of Fig. 4. DLC coating on sand-blasted substratum substratum Ti Grade 2 surface Ti Grade 2 by particles granularity 60 mesh Srovnání střední aritmetické úchylky profilu Ra charakterizující drsnost povrchu substrátů i povrchů povlaků na nich deponovaných je uvedeno na Obr. 5. Z obrázku je zřejmé, že drsnost povrchů rostla 3,5 3 v pořadí leštěné, broušené, balatinované částicemi 2,5 subtnt zrnitosti 120 a 60 mesh a u různých subtigr2 2 subtigr5 nepovlakovaných materiálů substrátů se významně 1,5 a-c:h(tnt) a-c:h(tigr2) neliší. (Pouze poněkud vyšší drsnost vykazují 1 a-c:h(tigr5) broušené povrchy a balatinovaný povrch částicemi 0,5 60 mesh u slitiny Ti35Nb6Ta.) Povlakované povrchy 0 polish grind sand120 sand60 mají srovnatelné hodnoty parametrů drsnosti s povrchy substrátů, na které byly deponovány. Obr. 5. Drsnost povrchů Ra po různé úpravě Fig. 5. Surface roughness Ra after different 3.2 Měření tloušťky vrstev treatment Tloušťka vrstvy a její homogenní rozložení na povrchu substrátů, byly hodnoceny na metalografických výbrusech. Ty byly připraveny na řezech orientovaných kolmo k povlakované ploše. Výbrusy byly připraveny standardním způsobem broušením a leštěním, tloušťka vrstvy byla hodnocena na nenaleptaných výbrusech z padesáti měření na každém vzorku v náhodně vybraných místech. Ukázky charakteru řezů vrstvou DLC jsou uvedeny na Obr. 6 a 7. Na obrázcích ze světelné mikroskopie je zřejmé, že vrstva je tvořena ze dvou částí, adhezní vrstvou a vrstvou DLC, daných výše uvedeným Ra [μm] způsobem deponování. Vrstva na leštěném povrchu je relativně homogenní s malou lokální členitostí povrchu, rovněž tak vrstva po broušení (Obr. 6). Členitější povrch vzorků po balatinování částicemi menší zrnitosti 120 mesh, je souvisle pokryt vrstvou DLC, její tloušťka je však méně rovnoměrná. Balatinováním povrchu substrátů částicemi Al 2 O 3 hrubší zrnitosti byl vytvořen reliéfnější povrch, avšak částice Al 2 O 3 v povrchové vrstvě často ulpěly (Obr. 7). V některých místech se zdá, že vrstva zcela nepokrývá členitý povrch.

4 Obr. 6. Povlak DLC na broušeném povrchu Obr. 7. Povlak DLC na balatinovaném povrchu substrátu Ti Grade 2 substrátu Ti Grade 2 Fig. 6. DLC coating on grinded surface of Fig. 7. DLC coating on surface of substratum substratum Ti Grade 2 sand-blast particles granularity 60 mesh Tloušťka deponovaných vrstev se pohybovala v rozsahu 2,2 až 3,3 μm s odchylkou 0,1 až 0,3 μm, přitom větší odchylka byla zjištěna u vrstev deponovaných na členitější povrch substrátů. 3.4 Scratch test Měření adheze vrstev, pomocí tzv. scratch testů, probíhalo při plynule se zvyšujícím zatížením F normal od 0 do 100 N (resp. 50 N) působícím na indentor po délce stopy vrypu 3 mm. Použité zařízení umožňuje sledovat záznam signálu akustické emise, hloubky průniku indentoru a jeho zbytkovou hodnotu po odtížení a záznam obrazu pomocí světelné mikroskopie. Pro detailní posouzení přilnavosti povlaků k substrátům byly vrypy prohlíženy také na řádkovacím elektronovém mikroskopu JEOL JSM 5510 LV. Měření bylo prováděno na vzorcích s leštěnými povrchy substrátů a příklad jeho výsledků je uvedený na Obr. 8a, kde je zachycen průběh scratch testu na vzorku s vrstvou deponovanou na leštěný povrch substrátu Ti Grade 5. Význam a označení jednotlivých os a křivek je uveden u obrázku. Obr. 8a. Závislost signálu akustické emise, hloubky proniknutí indentoru a zůstatkové hloubky průniku na síle zatížení (normal force), resp. délce stopy. Fig. 8a Dependence of acoustic emission signal, indenter penetration depth and residual depth on load (normal force), respectively scratch length Následující obrázky ukazují detaily porušování vrstvy DLC v místě počátku porušování vrstvy (Obr. 8b) a v místě proniknutí indentoru vrstvou povlaku (Obr. 8c).

5 Obr. 8b Detailní pohled na stopu po indentoru v místě počátku praskání a oddělování vrstvy DLC Fig. 8b. Detail view of indenter track at start of cracking and layer delamination Obr. 8c Detail vrypu v místě proniknutí indentoru vrstvou povlaku. Fig. 8c. Detail of scratch in location where indenter penetrated coated layer Z rozboru grafických záznamů a obrázků příslušných vrypů pořízených na řádkovacím elektronovém mikroskopu vyplývá, že k počátečnímu praskání vrstvy a oddělování kousků materiálu na okrajích vrypů dochází, podle hodnocení z grafických záznamů, v rozmezí mezi 10 až 13 N. Přitom při posuzování místa počátečního praskání vrstvy pouze pomocí obrázků jsou tyto hodnotu nepatrně nižší (8 až 11 N). K úplnému oddělení vrstvy a proniknutí indentoru až na podložku došlo u vrstev deponovaných na substrátech Ti Grade 2, resp. Ti Grade 5 při vyšších hodnotách zátěžné síly (u vrstvy na substrátu Ti Grade 2 při F normal = 64 N, na substrátu Grade 5 při F normal = 48,9 N) než u beta Ti slitin (u vrstvy na substrátu Ti35Nb6Ta při F normal = 29,9 N). Větší rozptyl hodnot může být ovlivněn rozdíly v tloušťce vrstev, ale zdá se, že souvisí především s rozdílnou strukturou, tj. především rozdílnou plasticitou substrátů. 3.5 Struktura vrstev a měření kontaktního úhlu Analýza struktury nanesené DLC vrstvy byla provedena ve spolupráci s VŠCHT, Ústavem kovových materiálů a korozního inženýrství. Byl analyzován poměr sp2 a sp3 uhlíku na XPS spektrometru ESCAprobeP (Omicron). Dekonvoluce dat byla uskutečněna programem CASA XPS (Casa Software Ltd.) (Obr. 9). Na obr.9 je ilustrovaná analýza C1s píku fotoelektronového spektra. Je zřejmé, že poměr obou forem uhlíku zastoupených v DLC vrstvách je možné jednoznačně určit a jedná se o vrstvu označovanou v literatuře [2] jako vrstva a-c:h. Obr. 9. Charakter povrchu povlaků Pomocí měření kontaktních úhlů přisedlých kapek vody resp. deponovaných na substráty, analýza ethylen glycolu byla určována povrchová energie metodou podle C1s píku DLC vrstvy na Ti grade 2 Owense-Wendta (O-W). Porovnání výsledků měření je uvedeno na Fig. 9. Character of surface coatings deponed on substratum Obr. 10 a 11. Kontaktní úhly kapky vody se u vzorků s povlaky a bez povlaků významně neliší. U povrchů leštěných a broušených se pohybují v rozmezí od 60 o do 80 o, u povrchu s vyšší drsností (balatinované povrchy) hodnoty kontaktních úhlů mírně vzrostly, přitom lze pozorovat tendenci k vyšším kontaktním úhlům (nižší smáčivosti) u vzorků bez povlaků. Hodnoty kontaktních úhlů kapky ethylen glycolu i jejich závislosti na drsnosti se u vzorků s povlaky DLC a vzorků substrátů bez povlaků naopak výrazně liší. Kontaktní úhly u vzorků substrátů

6 s povlaky jsou významně nižší než kontaktní úhly na površích substrátů bez povlaků, přitom s růstem drsnosti mírně klesají, na rozdíl od kontaktních úhlů na vzorcích bez povlaků, které mírně rostou kontaktní úhel(voda) [ o ] a-c:h(tnt) subtigr2 a-c:h(tigr2) subtigr5 a-c:h(tigr5) kontak. úhel(eth. glycol) [ o ] a-c:h(tnt) subtigr2 a-c:h(tigr2) subtigr5 a-c:h(tigr5) Ra [μm] Ra [μm] Obr. 10. Závislost kontaktního úhlu kapky vody na drsnosti povrchu Ra Fig. 10. Dependence of contact angle drop of water on surface roughness Ra Obr. 11. Závislost kontaktního úhlu ethylen glycolu na drsnosti povrchu Ra Fig. 11. Dependence of contact angle drop of ethylene glycol on surface roughness Ra povrchová energie [mj/m 2 ] a-c:h(tnt) subtigr2 30 a-c:h(tigr2) subtigr5 20 a-c:h(tigr5) Ra [μm] Obr. 12. Závislost povrchové energie na drsnosti Ra Fig. 12. Dependence of surface energy on Ra Na obr. 12 je uvedena závislost povrchové energie určené metodou podle Owense a Wendta na parametru drsnosti Ra. Z obrázku je vidět, že hodnoty povrchové energie vzorků s povlaky jsou vyšší než substrátů Ti Grade 2 a Ti Grade 5, přitom s růstem drsnosti jejich energie roste, na rozdíl od substrátů Ti Grade 2 a Ti Grade 5 bez povlaků, kde je naopak pozorován pokles. 3.6 Hodnocení cytokompatibility substrátů a DLC vrstev Studium cytokompatibility substrátů a povlaků DLC na substrátech bylo prováděno metodami buněčných kultur za použití buněčné linie MG 63. Použité metody pro tento výzkum byly jednak ty, které jsou doporučeny pro zdravotnické materiály a to CSN EU ISO: pro cytotoxicitu a další metody, které ve svém výsledku podávají obrazový záznam o interakci buněk s užitým materiálem a také o morfologických změnách povrchu buněk v reakci na studovaný materiál. V zásadě jde o dvojí druh aplikace. První je, že interakce buněk a materiálu se zkouší v definovaném výluhu zkoušených vzorků, druhou aplikací je přímá interakce buněk s materiálem. Výluh byl zhotoven v kultivačním médiu (MEM) bez přídavku bovinního séra. Sterilní vzorky byly v tomto médiu třepány při 37 C po dobu sedmi dnů frekvencí 60 rpm. Poměr množství média k ploše vzorku byl 1,75ml na 1 vzorek. Ke studiu dilatace (spreading) buněk ve výluhu, kdy kulaté buňky po trypsinizaci sedají na dno kultivační láhve a postupně se s přibývajícím časem dilatují (adherují), byla použita metoda sběrné mikrokinematografie, tj. postupného snímkování buněčné populace. Na snímcích byly stanoveny počty nedilatovaných a dilatovaných buněk a vyjádřen jejich podíl. Pro zkoušky růstu buněk i jejich dilatace byly užity buňky hetroploidní buněčné linie MG-63.

7 Technika rastrovací elektronové mikroskopie (SEM) byla využita k posouzení morfologických změn na povrchu buněk a posouzení k morfologie vazby buňky k povrchu zkoumaného vzorku. Kultivace sterilních vzorků proběhla v jamkových kultivačních destičkách. Po určené době kultivace byly vzorky vyjmuty a buňky fixovány a odvodněny. Následovala další preparace, jejíž podstatou je úprava biologického vzorku metodou vysoušení v prostředí kolem kompensačního bodu (critical point drying). Následně je vzorek s buňkami pokoven pro účely SEM. Zkoušky cytotoxicity vzorků růstem buněk ve výluhu Nebyla pozorována závislost mezi dávkou a účinkem. Drobné úchylky mezi pokusnými variantami jsou dány jednak variabilitou populace, jednak experimentální chybou a nejsou významné. Obdobné závislosti byly zjištěny jak pro substráty tak pro vzorky povlakované vrstvou DLC po celém jejich povrchu. Ze série měření růstových křivek buněčné populace plyne, že povlak a-c:h, pravděpodobně omezuje, resp. zamezuje výluhu nějakých zplodin s toxickým efektem [3]. Zkoušky cytotoxicity vzorků dilatací buněk ve výluhu Buňky po inokulaci adherují a postupně dilatují (spreading). Frekvence dilatovaných buněk narůstá s časem. Plná dilatace je charakterizována frekvencí mezi 0,9 až 1. Ve výluhu technicky čistého titanu (TiGrade2) je dosaženo plné dilatace po šedesáti minutách. Průběh závislosti postupné dilatace (spreding) u ostatních titanových slitin je obdobný s tím, že narůstání dilatace může mít jinou kinetiku a plné dilatace je dosahováno v různé době. Dilatace ve výluhu TiGr5 má pomalejší charakter, plné dilatace je dosaženo po 80 minutách. Slitina Ti35Nb6Ta má strmější frekvenci dilatovaných buněk a plné dilatace je dosaženo po padesáti minutách. Podobné výsledky vykazují i slitiny povlakované DLC [3]. Zkoušky interakce buněk a povlaku DLC Povlaky a-c:h nanesené na různé substráty se z kvalitativního hlediska hodnocení chování dilatujících a rostoucích buněk chovaly stejně. Na obr. 14 je ukázáno jak buňky adherují na vrstvu a-c:h nanesenou na povrch substrátu. Dobře je vidět vazbu buněčné membrány na rovinném povrchu vzorku. S rostoucí inokulační hustotou buňky povrch hustěji zaplňují a řada z nich, které se dělí, jsou patrné jako kulaté bílé objekty. V inokulu buněk/ml je hustota buněk ještě výrazně vyšší, povrch je přeplněn. Dělící se buňky jsou kulovitého tvaru a začínají tvořit druhou vrstvu na již pokryté ploše. Zvyšující se členitost povrchu vede ke snadnější adherenci buněk. Buňky neztrácejí na nerovném povrchu své vzájemné kontakty a kotvení s povrchem. I při nejnižším inokulu buněk/ml buňky na členitém, pískovaném povrchu se dobře přichytily a dilatovaly (obr. 13). Vazba mezi buňkami pomocí vlasových výběžků, jejich dilataci na členitý povrch a zakulacení dělících se buněk je dobře patrné na obr. 14.

8 Obr. 13. Vysoká hustota buněk na povrchu vrstvy DLC, substrát balatinovaný částicemi 120 mesh (v inokulu buněk/ml). Fig. 13. High cells density on surface of DLC coating, substratum sand-blasted by particles grand size 120 mesh (inoculum cells/ml). Obr. 14. Detail buněk na povrchu DLC povlaku naneseného na substrát balatinovaný částicemi zrnitosti 120 mesh Fig. 14. Detail of cells on DLC coating surface deposed on substratum sand-blasted by particles grain size 120 mesh 4. ZÁVĚR a) Použitým postupem deponování vrstev DLC bylo dosaženo rovnoměrného pokrytí povrchu substrátů všech studovaných materiálů. Tloušťka vrstev se pohybovala od 2,2 do 3,3 μm a jejich struktura odpovídala vrstvám s vyšším podílem sp2 vazeb označovaným a-c:h. b) Scratch testy ukázaly, že k počátečnímu praskání a oddělování materiálu na okrajích vrypů dochází u vrstev na všech substrátech při působení normálové síly na indentor v rozmezí mezi 10 až 13 N. Tyto hodnoty mohou sloužit k porovnávání adhezní schopnosti vrstev. c) Hodnoty povrchové energie vrstvy s povlaky určené měřením kontaktních úhlů přisedlých kapek vody resp. ethylen glycolu metodou podle Owense-Wendta (O-W) jsou vyšší než u substrátů Ti Grade 2 a Ti Grade 5 pro všechny drsnosti povrchů. d) Pomocí zkoušek cytotoxicity vzorků růstem buněk ve výluhu, dilatací buněk ve výluhu a zkoušek přímé interakce buněk s materiálem byla posouzena cytokompatibilita substrátů Ti Grade 2, Ti Grade 5 a slitiny Ti35Nb6Ta a povlaku a-c:h deponovaného na substráty. Studium cytokompatibility substrátů a povlaků DLC bylo provedené metodami buněčných kultur za použití buněčné linie MG 63. PODĚKOVÁNÍ Práce vznikla za podpory projektu MPO IMPULS FI-IM5/020 LITERATURA [1] NAVRÁTIL, Z. aj. Czech. J. Phys. 54, 2004, s. 877 [2] ROBERTSON,J. Diamond-like amorphous carbon, Materials Science Engineering R 37, 2002, s [3] BŘEZINA, V. aj. Zpráva IMPULS - Cytokompatibilita 2009, FNUSA Brno, B.P. MEDICAL, s.r.o., Brno, prosinec 2009